Molekulare Mechanismen der Signaltransduktion Transkription und Chromatinmodifikation

Transkript

1 Molekulare Mechanismen der Signaltransduktion Transkription und Chromatinmodifikation (Christian Schwerk) Literatur Molecular Cell Biology (Lodish, Berk, Matsudaira et al.) 5th Edition (Kapitel 10 & 11) Jenuwein & Allis (2001) Translating the Histone Code. Science 293, Vaquero et al. (2003) The Constantly Changing Face of Chromatin Sci Aging Knowledge Environ Apr 9 (14):RE4. Zhang & Reinberg (2001) Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15,

2 Eine einzelne eukaryontische Zelle enthält ca. 2 m DNS Der Durchmesser einer solchen Zelle ist < 10 um entspricht einem Faktor von > 10 5 Humane Metaphasechromosomen

3 Problem: Wie bringe ich ca Meilen Spaghetti in einem Basketball unter? Lösung: Die DNS wird mit Hilfe von Proteinen in eine Chromatin genannte Struktur verpackt Humane Metaphasechromosomen

4 Chromatin Wenn DNS aus eukaryontischen Zellen in einem Puffer isoliert wird, welcher die gleiche Salzkonzentration wie die Zelle enthält (ca M KCl), dann ist die DNS mit einer gleichen Menge an Proteinen assoziiert. Dieser Nukleoproteinkomplex stellt das Chromatin dar Die Struktur des Chromatins is bemerkenswert ähnlich in allen Eukaryonten Das Chromatin ist während der Interphase mehr oder weniger gleichmäßig im Zellkern verteilt Eine weitere Kompaktion des Chromatins führt zur Bildung der Metaphasechromosomen für die Zellteilung

5 Chromatin im Elektronenmikroskop 10 nm beads-on-a-string (wenig Salz, kein Mg 2+ ) 30 mm (0.15 M KCl) Chromatin existiert in kondensierter und ausgedehnter Form Chromatin ist nicht statisch, sondern in seiner Struktur sehr variabel Die Chromatinstruktur scheint aus einzelnen Bauteilen zusammengesetzt zu sein, den sogenanten Nukleosomen Die Nukleosomen setzen sich aus Histonproteinen zusammen

6 Die Histone Sind die häufigsten mit eukaryontischer DNS assoziierten Proteine Sehr basische Proteine mit vielen positiv geladenen Aminosäuren Interagieren daher gut mit den negativ geladenem Phosphatgruppen der DNS Es gibt fünf Haupttypen der Histone: Histon 2A (H2A) Histon 2B (H2B) Histon 3 (H3) Histon 4 (H4) Histon 1 (H1) Im Organismus sind sehr viele Histonvarianten mit spezialisierten Funktionen vorhanden (z.b. Silencing und Aktivierung von Chromatin, Detektion von DNS-Brüchen, Lokalisation an Centromeren)

7 Das Nukleosom Histon 2A (H2A) Histon 2B (H2B) Histon 3 (H3) Histon 4 (H4) H2A-H2B-Dimer H3-H4-Tetramer Oktamer Drei Helices bilden einen histone-fold Alle Histone besitzen N- oder C-terminale tails bp DNS, etwas weniger als 2x um das Oktamer (der Nukleosom-Kern ) gewunden

8 Struktur des Nukleosoms 147 bp DNS sind 1 3/4x um ein Histon-Oktamer gewunden DNS zwischen den Nukleosomen wird als linker -DNS bezeichnet (in Metazoa: bp)

9 Die Rolle der Histon- tails und die Funktion von H1 Die Histon- tails werden für die Bildung der 30 nm Fiber benötigt Kontakte der tails mit der linker DNS und den Histonproteinen Modifikationen der tails erlauben eine Reorganisation des Chromatins! Spezifische Enzyme zur Histonmodifikation sind in der Zelle vorhanden H1 dient zur Stabilisierung der 30 nm Fiber

10 10 nm und 30 nm Fiber Solenoid-Struktur Histon H1 30 nm Fiber 10 nm Fiber

11 10 nm und 30 nm Fiber

12 10 nm und 30 nm Fiber

13 Micrococcal Nuklease schneidet die linker DNS. Zelle Nuklease DNA-Gel Nucleus

14 Weitere Verpackung der DNS in übergeordnete Chromatinstrukturen An der Ausbildung übergeordneter Chromatinstrukturen sind zusätzliche Chromatin-assoziierte Proteine beteiligt HMG-Proteine ( Architekturproteine ) HP1 (Heterochromatin-Protein 1; Chromodomänen-Protein)

15 Zusammenfassung 1 je zwei Moleküle H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein Histon-Oktamer 147 bp DNS werden um das Oktamer gewunden Histone + DNS stellen ein Nukleosom dar (10 nm Fiber) Zwischen den Nukleosomen befindet sich die linker -DNS Histon- tails und Histon H1 werden für die Verpackung in die 30 nm Fiber benötigt weitere Chromatinproteine sind an der Ausbildung höherer Chromatinstrukturen beteiligt

16 Transkription proteinkodierender Gene durch die RNA Polymerase II (RNAPII) Transkription: Abschrift der DNS für die Produktion einer Boten-RNS - regulatorische DNS-Sequenzen (pos. und neg.) - basale Transkriptionsmaschinerie - Enhancer-bindende Faktoren (Aktivatoren & Repressoren)

17 Aktivator- und Repressor-Proteine Aktivatoren und Repressoren sind modular aufgebaut: DNS-Bindungsdomäne - Bindung an spezifische DNS-Sequenzen Aktivierungs- oder Repremierungsdomäne - direkte Interaktionen mit der basalen Transkriptionsmaschinerie - Rekrutierung von Kofaktoren

18 Transkriptionsinitiation an eukaryontischen RNAPII Promotoren + weitere Transkriptionsfaktoren (z.b. Mediator-Komplex)

19 Probleme für Eukaryonten: Durch die Verpackung der DNS in Chromatin wird die Transkription von Zielgenen reprimiert (DNS ist inaktiv ) Zu transkribierende Gene müssen im Chromatin identifiziert werden Um der Transkriptionsmaschinerie Zugang zu einem Zielgen zu ermöglichen muß die Chromatinstruktur wieder geöffnet werden (die DNS muß aktiviert werden) Nach erfolgter Transkription muß die DNS erneut in die Chromatinstruktur eingepackt werden

20 Transkriptionell aktive und inaktive DNS inaktiv aktiv die nichttranskribierte, inaktive DNS existiert in der Zelle hauptsächlich in der kondensierten 30 nm Form und in higher order folded structures, deren genaue Konformation nicht bekannt ist. Die Regionen der DNS, welche aktiv transkribiert werden liegen wahrscheinlich in der ausgestreckten beads-on-astring Form vor

21 Transkriptionell aktive und inaktive DNS inaktiv Heterochromatin aktiv Euchromatin

22 Transkriptionsaktivierung durch Chromatin-modifizierende Faktoren 1.) ATP-abhängige Chromatin- remodelling Maschinen 2.) Histon-modifizierende Enzyme

23 1.) ATP-abhängige Chromatin- remodelling Maschinen Transkriptionsaktivierung durch Chromatin-modifizierende Faktoren

24 ATP-dependent chromatin-remodelling machines

25 Mechanismen für ATP-abhängiges Chromatin- Remodeling ISWI-Unterfamilie: Translokationsmodel, Kontakte zwischen Nucleosom und DNS werden unterbrochen SNF2-Unterfamilie: lateral cross transfer Model, Nukleosomen werden um ca. 80 bp versetzt, Tendenz zum Aufbrechen von Nukleosomen

26 Transkriptionsaktivierung durch Chromatin-modifizierende Faktoren 1.) ATP-abhängige Chromatin- remodelling Maschinen Multiproteinkomplexe Enthalten Mitglieder verschiedener ATPase-Familen Bewegen Nukleosomen auf der DNS mit Hilfe verschiedener Mechanismen

27 2.) Histon-modifizierende Enzyme Transkriptionsaktivierung durch Chromatin-modifizierende Faktoren

28 Histon-Modifikationen: Acetylierung / Deacetylierung Findet an Lysinen statt Reversibel Acetylierung wird durch Histon-Acetyltransferasen (HATS) durchgeführt Histon-Deacetylasen (HDACs) führen die Deacetylierung durch

29 Effect der Acetylierung / Deacetylierung Hypoacetylierungn (Blau): Starke internukleosomale Interaktionen: Histon- tails verstärken die Bindung der DNS an die Nukleosomen Hyperacetylierung (Gelb): Schwache internucleosomale interactions: Histon- tails verstärken die Bindung der DNS nicht; diese wird zugänglich für Transkriptionsfaktoren Histon-Modificationen (wie Acetylierung) können die folgenden Effekte haben: (1). Unterbrechung der Interaktionen zwischen DNS und Histonen (2). Unterbrechung der Interaktionen zwischen benachbarten Nukleosomen (3). Andockstelle für Transkriptions-Kofaktoren Es ensteht eine offene ( aktive ) Chromatinstruktur

30 Histonacetyltransferasen (HATs)

31 Histon-Deacetylasen (HDACs) Gruppe Mitglieder TSA sensitiv NAD + abhängig Lokalisierung Funktion Klasse I (Rpd3) HDAC1-3, 8 ja nein nukleär r & ubiquitär Transkritionsre- primierung Differenzierung Klasse II (HdaI) HDAC4-7, 9, 10 ja nein gewebespezifisch Transkriptions- repression, Mikrotubuliregulation Klasse III (Sir2) Sir2, HST1-4 (homologues) nein ja nukleär cytoplasmatisch mitochondriell Gen-Silencing Alterung

32 Rekrutierung von HATs und HDACs Repressorproteine rekrutieren Histon-deacetylierende Multiproteinkomplexe (z.b. sin3- Komplex) Aktivatoren rekrutieren Histonacetylierende Multiproteinkomplexe (z.b. SAGA-Komplex)

33 Zusammenspiel von Chromatin- remodelling Maschinen und Histon-modifizierenden Faktoren Aktivator-Proteine rekrutieren Chromatin- remodeling Faktoren Chromatinstruktur wird geöffnet, die Histon- tails werden freigelegt Histon-acetylierende Enzyme werden rekrutiert und modifizieren die Histon- tails Weitere Aktivatoren binden an freigewordene DNS- Sequenzen Der Mediator-Komplex und die basale Transkriptionsmaschinerie werden rekrutiert

34 Zusammenfassung 2

35 Posttranslationale Modifikationen von Histonen Acetylierung / Deacetylierung Methylierung Phosphorylierung / Dephosphorylierung Ubiquitinierung Poly-ADP-ribosylierung Biotinylierung

36 Die Histon- tails sind das Hauptziel der Modifikationen Methylierung Acetylierung Phosphorylierung Ubiquitinierung

37 Histone-code Hypothese Bereits existierende Modifikationen beeinflussen weitere Modifikationen Diese Modifikationen dienen als Marker für die Rekrutierung von verschiedenen Protein(komplex)en, welche spezifische Modifikationen erkennen. - Bromodomain fi Acetyl-Lysine (z.b. TAF II 250) - Chromodomain fi H3-Met.-Lys9 (HP1) Diese Protein(komplex)e regulieren verschiedene Chromatinfunktionen - Genexpression - DNS-Replikation - Chromosomensegregation

38 Weitere Protein-Codes...? p53: - acetyliert - methyliert - phosphoryliert

39 Histon-Modifikationen: Arginin- und Lysin-Methylierung

40 Arginin-Methylierung von Histonen fi wird durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) durchgeführt HMT Spezifität Funktion PRMT1 PRMT2 PRMT3 PRMT4/CARM1 PRMT5 H4-R3 (andere Proteine) unbekannt unbekannt H3-R2, -R17, -R26 (auch am C-Terminus) H2A, H4 (andere Proteine) Transkriptionsaktivierung (Signaltransduktion, etc) Estrogenrezeptor-Koaktivator Cytoplasmatisch (Mitose?) Transkriptions-Koaktivator Transkriptionsrepressor, Spliceosome-Bildung Normalerweise mit Genaktivierung assoziiert in vivo Methylierung von Histonen nur für PRMT1 und PRMT4 gezeigt H4-R3-Methylation durch PRMT1 fördert die Acetylierung von Histon H4 durch die Histonacetyltransferase p300 Der Transkriptionscoaktivator PRMT4/CARM1 methyliert Arginin-Reste in den tails von H3 und H4

41 Lysin-Methylierung von Histonen fi wird durch SET-Domänen (SU(VAR)3-9, E(Z), Trithorax) Proteine durchgeführt HMT Spezifität Funktion Suv39H1; Suv39H2 G9a ASH1 Set1 Set2 Set7 Set9 ESC-E(z) SETDB1 H3-K9 H3-K9, H3-K27 H3-K4, -K9, H4-K20 H3-K4 H3-K36 H4-K20 H3-K4 H3-K27 H3-K9 Heterochromatinbildung, Silencing Frühe Embryonalentw., Transkriptionsrepression Etablierung von epigentischen, aktiven Transkriptionsmuster Silencing Silencing,, Transkription Development, Silencing,, Alterung Transkriptionsaktivierung Polycomb-vermitteltes Silencing Korepressor KAP-1-vermitteltes Silencing kann sowohl mit Transkriptionsrepression als auch -aktivierung korrellieren H3-K9: Heterochromatinbildung, Transkriptionsrepression H3-K4: Gentranskription

42 Chromatin-Immunpräzipitationen 1. Chromatin wird ge crosslinked 2. DNS wird zerbrochen 3. DNS-Protein-Komplexe werden mit modifikationsspezifischen Histon-Aks präzipitiert 4. Der Crosslink wird aufgelöst 5. DNS wird mit Hilfe von PCR analysiert

43 Histon-Methylierungsmuster am Hefe mating type Locus H3-K4-Methylierung fi Euchromatin ( aktiv ) H3-K9-Methylierung fi Heterochromatin ( inaktiv )

44 Silencing durch H3-K9-Methylierung 1.) Deacetylierung 2.) Methylierung u.a. an H3-K9 1.) Transkriptionsfaktoren rekrutieren den Rb- Repressorkomplex 3.) HP1 bindet an methyl-h3-k9 (Chromodomäne!) 2.) Methylierung an H3-K9 4.) HP1 Moleküle assozieren miteinander über einen DNS- Bereich ( Heterochromatin- Spreading ) 3.) HP1 bindet an methyl-h3- K9 (Chromodomäne!) Rekrutierung von HDACs durch Rb ist ebenfalls in Transkriptionsrepression involviert

45 Zusammenspiel verschiedener Histon- tail Modifikationen H4-R3-Methylation durch PRMT1 fördert die Acetylierung von Histon H4 durch Histon-Acetylase p300 fi Aktivierung H3-K4-Methylierung durch Set9 verhindert die Bindung des HDAC- Komplexes NuRD an H3; die Folgen sind Hyperacetylierung und Transkriptionsaktivierung

46 Verbindung zwischen Histon- und DNS-Methylierung z.b. H3-K9

47 Histon-Demethylierung??? 1.) Demethylierung durch eine hypothetische Histondemethylase (HDM) 2.) Austausch von Histonen 3.) Abschneiden der Histon- tails durch allerdings unbekannte Enzyme 4.) Umwandlung von Methyl- Arginin in Citrullin; Nächster Schritt=???

48 Weitere posttranslationale Histon-Modifikationen Phosphorylierung / Dephosphorylierung alle Histone (einschließlich H1) werden phosphoryliert Phosphorylierungen können Methylierung und Acetylierung beeinflussen und so Transkriptionsaktivität steuern Histon-Phosphorylierungen spielen ebenfalls eine Rolle in der Mitose (H3-Phosph., Aurora-B Kinase) und Apoptose (Mst-1 Kinase) Ubiquitinierung hauptsächlich Monoubiquitinierung involviert in die Transkriptionsregulation

49 Weitere posttranslationale Histon-Modifikationen Poly-ADP-ribosylierung wird (u.a.?) durch PARP1 durchgeführt beeinflusst DNS-Reparatur, Genexpression, Replikation, Apoptose, Genom-Stabilität... Rolle bei der Gen-Aktivierung? Biotinylierung Rolle in Zellzyklus-Progression, Transkriptionskontrollle, Chromatin-Stabilität...???

50 Zusammenfassung 3 Histone werden zahlreicher posttranslationaler Modifikationen unterzogen Die Vielzahl der Modifikationen führte zur Aufstellung der Histon-Code- Hypothese Histon-Methylierung findet an Lysinen und Argininen statt und kann Genexpression aktivieren und reprimieren Histon- und DNS-Methylierung sind miteinander gekoppelt spezifische Modifikationen werden von bestimmten Proteindomänen erkannt verschiedene Histon- tail -Modifikationen beeinflussen sich gegenseitig