Geochemische Analytik HPLC

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1 Geochemische Analytik HPLC

2 HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (eng. high performance liquid chromatographie (HPLC)) ist ein analytisches Verfahren mit dem nicht flüchtige Substanzgemische getrennt und mit Hilfe von Detektoren bestimmt und quantifiziert werden können. A = Lösungsmittelreservoir B = Mischventil mit Pumpensystem C = 6-Wege Ventil D = Druckkompensationsschleife E = Mischkammer F = Injektionsventil G = Trennsäule I = Detektor (z.b. UV/VIS) J = Computer-Interface K = PC L = Drucker

3 HPLC flow chart niedere Polarität höhere Polarität Gradient Mixer Injektor Säulenofen Pumpe Autosampler Säule Druck: bar Eluentenflussrate: < 1ml/min Phases for separation: normal phase/reversed phase Gradient elution vs. Isocratic Eluents compatible to column & MS Chromatogramm Detektor polarity

4 HPLC Säulen Typ der Säule, Lösungsmittelzusammensetzung und Flussrate bestimmen den Druck der Applikation Typische Partikelgröße bewegt sich zwischen 1.3 und 5 µm und einer Länge zwischen 7 und 40 cm bei einem Durchmesser von 2.1 bzw 4.6 mm Innendurchmesser.

5 HPLC Säulen HPLC (Agilent 1200) UHPLC (Agilent 1290 Infinity) Ultra HPLCs erlauben einen Betrieb bis ~400 bar Ultra HPLCs erlauben einen Betrieb bis ca bar und damit die Verwendung von Säulen mit kleinerer Partikelgröße und gleichzeig schnellerem und effizienterem Betrieb.

6 HPLC-Modi Normalphasenchromatographie (normal-phase chromatography) Chromatographisches Verfahren bei dem ein polarer Säulentyp (z.b. Silikasäule) eingesetzt wird und das Stoffgemisch mit einem überwiegend apolaren Lösungsmittel von der Säule gespült wird. Zusätzlich ist die Beimengung von polaren Lösungsmittel während des Laufes möglich. Reversed- Phasen Chromatographie (reversed-phase chromatography) Chromatographisches Verfahren bei dem ein apolarer Säulentyp (z.b. C8 oder C18- Phasen) eingesetzt wird und das Stoffgemisch mit einem überwiegend polaren Lösungsmittel von der Säule gespült wird. Zusätzlich ist die Beimengung von apolaren Lösungsmittel während des Laufes möglich.

7 HPLC flow chart Polarität Polarität Normalphasenchromatographie (normal-phase chromatography) apolar polar apolare Substanz polare Substanz z.b. Silica-Säule Reversed- Phasen Chromatographie (reversed-phase chromatography) polar apolar z.b. C 8 oder C 18 -Säule apolare Substanz polare Substanz

8 Detektoren UV/VIS-Detektor: Nicht-destruktives Messverfahren, das die Absorption der elektromagnetischen Wellen des ultravioletten (UV) und des sichtbaren Lichts (VIS) nutzt. Variante des UV/VIS Detektors ist der Photodiodenzeilendetektor (PDA = photo diode array detector) Pigmente, Toxine Fluoreszenz-Detektor: Sehr sensitive und selektiv für Analyten, die fluoreszieren. Nicht einsetzbar für andere Substanzen Brechungsindex-Detektor (RI-Detektor): Messgerät zur Ermittlung der veränderlichen Konzentration gelöster Stoffe im Fluss eines Lösungsmittels. Geringere Nachweisgrenze als UV/VIS oder Fluoresenzdetektoren Zucker Massenspektrometer (MS): Destruktives Verfahren in dem Moleküle durch einen Elektronenstrahl in Ionen fragmentiert werden und Informationen hinsichtlich der Struktur organischer Verbindungen gewonnen werden können z.b. Lipide, Zucker, Proteine

9 Massenspektrometer neutral bis schwach polare Komponenten polare Komponenten Wang et al. (2015) RCS GC-MS EI = electron-impact ionization CI = chemical ionization HPLC-MS APCI = Atmopheric pressure chemical ionization ESI = electrospray ionization MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization

10 MS Detektoren GC/MS Sample introduction Interface to vacuum EI, CI Ion source Sector, Quadrupole, TOF Mass analyzer Detector high vacuum HPLC/MS Sample introduction ESI, APCI, APPI Ion source Interface to vacuum (triple) Quadrupole, ion trap, TOF, sector Mass analyzer Detector high vacuum Atmospheric Pressure Ionization (API)

11 MS Detektoreninterfaces APCI ESI

12 Anwendungen

13 Anwendungen HPLC erlaubt die Detektion von hochmolekularen und/oder (hoch)polaren Komponenten, die mit Hilfe von GC-MS nicht zu bestimmen sind. Klassische Anwendungsbeispiel in den Geowissenschaften sind: Pigmente: Chlorophylle, Carotenoide Bacteriohopanepolyols (BHPs) OH OH OH NH 2 Glycerol dialkyl glycerol tetraethers (GDGTs) HO O GDGT-0 O O O OH Intact Polar Lipids (IPLs) Ladderanes

14 Pigmente Lake Barkenberg (Germany) Lake Erie (USA Lake Taihu (China)

15 Pigmente Chlorophyll: Chlorophyll a, Chlorophyll c 1, Chlorophyll c 2 Gruppe von Tetrapyrrolen, die als primäre Pigmente in der Photosynthese von Bedeutung sind Chlorophyll a ubiquitär in Algen, Landpflanzen und Cyanobakterien Photosynthetische Bakterien enthalten Bakteriochlorophyll

16 Pigmente - Carotine Carotine: β-carotin, ε-carotin Carotine: sekundäre Pflanzenstoffe mit der Summenformel C 40 H 56, die zu den Tetraterpenen gerechnet werden. Sie bestehen aus ein bis zwei Ionen- Ringen, die durch eine Kohlenstoffkette mit neun Doppelbindungen verbunden sind.

17 Pigmente - Xanthphylle Xanthophylle: Echinenon, Canthaxanthin, Fucoxanthin, Neofucoxanthin, Diatoxanthin, Diadinoxanthin, Neoxanthin Xanthophylle: gehören zu den Tetraterpenen, die jedoch sauerstoffhaltige Gruppen (Hydroxy-, Carbonyl-, Carboxylgruppen) enthalten

18 Pigmente Chlorophyll a

19 Pigmente Chlorophyll a

20 Pigmente Grünalgen Cyanobakterien

21 Pigmente Phycoerythrin Cyanobacteria Phycocyanin Canthaxanthin (E161g) Zeaxanthin (E161h)

22 Anwendungen

23 Pigmente

24 GDGTs HPLC-APCI-MS

25 GDGTs Archaeen als Quelle von isoprenoidalen Diethern (Archaeol) und isoprenoidalen Tetraethern (glycerol dialkyl glycerol tetraethern) Archaeol GDGT-0

26 GDGTs Intaktes polares Lipid (IPL): Biologisches Molekül, dass aus einer Kopfgruppe (z.b. Glukose) besteht, das an ein Core Lipid gebunden ist. Sehr polar durch Kopfgruppe HPLC-ESI-MS, (~1,300-1,900 Da) Kopfgruppe Dihexose-GDGT Core Lipid (CL): Core Geomolekül, das seine Kopfgruppe verloren hat und über geologische Zeiträume in sedimentären Sequenzen stabil ist. Neutral bis schwach polar HPLC-APCI-MS, (Molekulargewicht in der Regel zwischen Da) Crenarchaeol

27 GDGTs GTGT-0 GDGT-0 GDGT-1 GDGT-2 GDGT-3 GDGT-4 Crenarchaeol

28 GDGTs GDGT-0 GC-MS Chappe et al. (1980) GDGT-1 Crenarchaeol GDGTs zu hohes Molekulargewicht für GC-MS Messung! HPLC-MS Aber Bruchstücke detektierbar mit Hilfe von GC-MS!

29 GDGTs Messung von GDGTs (als core lipide) mit Hilfe eines HPLC-MS Systems erstmals im Jahr 2000 an dem thermophilen Archaeon Metallosphaera sedula. M. sedula GDGT-1 GDGT-2 GDGT-3 GDGT-4 GTGT-0 GDGT-0 GDGT-1 GDGT-2 GDGT-0 GDGT-3 GDGT-4 GTGT-0 Crenarchaeol Crenarchaeol Hopmans et al. (2000)

30 TEX 86 Im folgenden Analyse von GDGTs in globalen marinen Sedimenten und Entdeckung von unterschiedlichen GDGT-Verteilungsmustern in Abhängigkeit der geographischen Breite. Halley Bay Station (Antarctica) Arabian Sea Schouten et al. (2002)

31 TEX 86 Steigende Anzahl an Ringen

32 TEX 86 Red Sea (Kim et al. 2010)

33 TEX 86 Red Sea (Kim et al. 2010)