WS 2017/18 R. Vasold. Chromatographie II. Chromatographie II. HPLC Seminar
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- Anton Salzmann
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1 HPLC Seminar 1
2 HPLC Praktikum 2 I.1 Einleitung (siehe Skript Praktikum) I.2 Ziele des Praktikums I.3 Die stationäre Phase I.4 Die mobile Phase I.5 Die Pumpe(n) I.6 Die Injektionseinheit I.7 Die Detektoreinheit I.8 Die Software I.9 Die Methode des ISTD I.10 Aufgaben zum theoretischen Teil
3 I.2 Ziele des Praktikums 3 Nach diesem Praktikum soll man u.a.: Ziel 1 Über den Aufbau einer HPLC-Anlage, sowie über stationäre und mobile Phase Bescheid wissen. Ziel 2 Ziel 3 Ziel 4 Über die Einzelbestandteile (wie z.b. Pumpen, Injektoreinheit und Detektoren) Bescheid wissen. Wichtige chromatographische Kenngrößen (z.b. t m, t R (X), V m, V R (X), u m, u(x), k etc.) bestimmen können. Eine quantitative Bestimmung mit der Methode des Internen Standards durchführen können.
4 Kapitel I Theoretischer Teil 4
5 I.2.1 Komponenten der HPLC Anlage
6 I.2.1 Komponenten der HPLC Anlage Abb. I.2.1: Komponenten eines HPLC-Systems 5
7 I.3 Die Stationäre Phase 7 Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in: Normal-Phase-Chomatographie: NP Stationäre Phase polar Mobile Phase unpolar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar RP Mobile Phase polar
8 I.3 Die Stationäre Phase 8 Abb. I.3.1: Komponenten eines HPLC-Systems (Säule)
9 I.3 Die Stationäre Phase 9 Stationäre Phase Abb. I.3.2: Darstellung einer HPLC-Säule End-Kartusche
10 I.3 Die Stationäre Phase 10 Partikel (z.b.sphärisch) 3µm -10µm Abb. I.3.3: Darstellung der Einzelpartikel
11 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 11 Normal-Phase Abb. I.3.1.a: Material mit polaren Silanol- (SiOH)- Endguppen
12 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 12 RP-Phase Abb. I.3.1.b: Material mit unpolaren CH 3 -Endgruppen
13 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 13 RP-Phase Abb. I.3.1c: Material mit unpolaren C4-Endgruppen
14 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 14 RP-Phase Abb. I.3.1.d: Material mit unpolaren C8-Endgruppen
15 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 15 RP-Phase Abb. I.3.1e: Material mit C18-Endgruppen
16 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 16 Im Praktikumsversuch wird folgende Säule eingesetzt: Hersteller: Fa. Phenomenex Dimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID) Material: 3 µm stationäre Phase: C18
17 I.4 Die mobile Phase 17 Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in: Normal-Phase-Chomatographie: NP Stationäre Phase polar Mobile Phase unpolar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar RP Mobile Phase polar
18 I.4 Die mobile Phase 18 Abb. I.4.1: Komponenten eines HPLC-Systems (Eluenten)
19 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 19 = Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft E 0 ( Polarität) bezogen auf NP-Phase (empirisch bestimmt) Eluent Elutionskraft [E 0 (Al 2 O 3 )] UV-Grenze [nm] hauptsächliche Verwendung in RP-Chromatographie NP-Chromatographie n-hexan 0, Toluol 0, Chloroform 0, Dichlormethan 0, Aceton 0, Essigsäureethylester 0, Dimethylsulfoxid 0, Diethylamin 0, Acetonitril 0, Propanol 0, Methanol 0, Wasser >1,11 <190 Abb. I.4.1.a: Die Eluotrope Reihe (Auszug)
20 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 20 n-hexan CHCl 3 CH 2 Cl 2 2-Propanol E 0 =0,00 E 0 = 0, 40 E 0 = 0,42 E 0 =0,82 Für die Normalphasen-(NP)-Chomatographie gilt: Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen in der Säule weiter zu befördern
21 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 21 Beispiel für die Normalphasen-(NP): E 0 =0,00 E 0 =0,82 Elutionskraft sinkt Abb. I.4.1.b: 50% Hexan + 50% 2-Pr 60% Hexan + 40% 2-Pr 70% Hexan + 30% 2-Pr 80% Hexan + 20% 2-Pr 90% Hexan + 10% 2-Pr Retentionszeiten steigen Entwicklung einer NP-Trennung (isokratisch)
22 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 22 THF CH 3 CN Methanol H 2 O E 0 =0,45 E 0 = 0, 65 E 0 = 0,95 E 0 > 1 Für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie gilt: Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen in der Säule weiter zu befördern
23 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 23 Beispiel für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie: E 0 = 0,65 E 0 > 1 Elutionskraft sinkt 70% CH 3 CN + 30% H 2 O Nebenprodukt 60% CH 3 CN + 40% H 2 O 50% CH 3 CN + 50% H 2 O 40% CH 3 CN + 60% H 2 O Abb. I.4.1.c: Entwicklung einer RP-Trennung (isokratisch) Retentionszeiten steigen
24 I.4.2 Die isokratische-elution 24 Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung nicht: Abb. I.4.2.: Eluentenverlauf bei isokratischer Elution
25 I.4.3 Die Gradienten-Elution 25 Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung: Abb. I.4.3: Eluentenverlauf bei Gradienten Elution
26 I.5 Die Pumpe / Injektor / Detektor 26 Abb. I.5.a: Komponenten eines HPLC-Systems (Pumpe, Detektor, Injektionseinheit)
27 I.5 Die Pumpe 27 Auslaßventil Kolben Abb. I.5.b: Kolbenpumpe Einlaßventil
28 I.5 Die Pumpe 28 Auslaßventil Kolben Kolbenantrieb Einlaßventil Abb. I.5.c: Einkolben-Pumpe
29 I.5 Die Pumpe 29 Membran Kolben Hydraulik-Flüssigkeit Abb. I.5.e: Diaphragma-Pumpe
30 I.6 Die Injektionseinheit 30 Injektionsnadel Ventil Probengläschen Abb. I.6.a: Funktionsweise Autosampler Pumpe Säule Proben -Schleife
31 I.7 Die Detektoreinheit I.7.1 Der UV/VIS-Detektor 31 Spalt Gitter Deuteriumlampe Flußzelle Abb. I.7: UV/VIS - Detektor (VWD oder MWD) jeweils nur eine Wellenlänge einstellbar Photozelle
32 I.7 Die Detektoreinheit I.7.2 Der Diodenarray-Detektor (UV/VIS) 32 Spalt Gitter Photodioden Flußzelle Deuteriumlampe Abb. I.7.2: Der Photodiodenarray-Detektor
33 I Der ISO-Plot (DAD-Detektor) 33 0 mau Absorption 100 mau Wellenlänge [nm] Zeit [min] Abb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen Trennung
34 I Der 3D-Plot (DAD Detektor) 34 Absorption [mau] Abb. I.7.2.2: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung
35 I.7.3 Der MS-Detektor 35 Ionenquelle Quadrupol Ionenfalle HPLC Abb. I.7.3: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors
36 I.7.4 HPLC-Detektoren (Auswahl) 36 HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität UV/VIS DAD (Diodenarray-Detektor); RI (Refractive-Index-Det.) Brechungsindex FLD (Fluorescence-Det.) Fluoreszenz ECD (Elektro-Chemical-Det.) elektrochemisch selektiv für UV/VIS-aktive Analyte (ca nm) Analyte mit unterschiedlichem Brechungsindex zum Eluenten (temperaturabhängig, keine Gradientenelution, wenig empfindlich) selektiv nur für fluoreszierende Analyte selektiv, nur für oxidierbare bzw. reduzierbare Analyte ca. 0,3 ng/ml 1 x 10 4 ca. 0,7 g/ml 3 x ,2 pg/ml (!) ca. 1,0 pg/ml (!) - CD (Conductivity-Det.) Leitfähigkeit ELSD (Evaporative-Light- Scattering-Det.) Verdampfungslichtstreuung. MSD (Mass-Selective-Det.) Masse Selektiv für Ionen a) ca Relativ Universell aber wenig empfindlich Relativ universell aber Analyte müssen ionisierbar sein. a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen. Abb. I.7.4: häufig eingesetzte HPLC-Detektoren modellabhängig - modellabhängig -
37 I.8. Software 37 Abb. I.8: Software Open LAB ChemStation C.01.04
38 I.9 Die Methode des Internen Standards 38...warum der Aufwand, wenn man exakt quantifizieren will?...warum ist eine externe Kalibrierung oft nicht ausreichend? Es kann zu ganz normalen Schwankungen zwischen den Läufen kommen, wie: Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen (Luftblasen, manuelle Injektion). Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes. Veränderungen der Umgebungstemperatur etc.
39 I.9 Die Methode des Internen Standards 39 t R (X 1 ) t R (X 2 ) t t t R (X) S (X) m Interner Standard t m Abb. I.9: t S (X 1 ) Zeit [s] t S (X 2 ) Zugabe eines internen Standards (Tracer)
40 I.9 Die Methode des Internen Standards 40 Die Fläche eines Peaks ist mit der eingespritzten Stoffmenge bzw. der Massenkonzentration m i des Stoffes proportional: a = m (1) i f i i Fläche der Komponente i Responsefaktor der Komponente i Massenkonzentration der Komponente i
41 I.9 Die Methode des Internen Standards 41 zu bestimmende Substanz i Tracer Substanz f i = a i m i (2) f Tr = a Tr m Tr (3) Tr = Tracer KF = i f Tr f i = m m K i K Tr Kalibrierfaktor der Komponente i a a K Tr K i (4) K = Kalibrierlösung
42 I.9 Die Methode des Internen Standards 42 f Tr f i = m m x i x Tr a a x Tr x i (5) x = Probenlösung Auflösen nach Massekonzentration der Komponente i m x f = KF Tr i m i i x Tr (6) f i a x a Tr Aus Kalibriermessung vorher ermittelt
43 I.10 Fragen zum Theoretischen Teil (Auswahl) 43 1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Adsorptionschromatographie unterschieden werden? 2.) Erklären sie den Begriff endcapping. 3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.b. basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele)? 4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu NP-Phasen aufweisen. 5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie? 6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2)? 7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution? 8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe binärer, ternärer und quaternärer Gradient. 9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten. 10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung 11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert? 12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen muß. 13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines VWD-Detektors und eines DAD-Detektors. 14.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang der Ausdruck: Inverse Optik. Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.
44 Kapitel II Experimenteller Teil 44
45 Kapitel II: Experimenteller Teil 45 II.1 II.2 II.2.1 II II II II.2.2 II.3 Einleitung (siehe Skript Praktikum) Versuchsdurchführung Vorbereitung der Lösungen (siehe Skript) Vorbereitung der Stammlösungen (siehe Skript Praktikum) Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung) (siehe Skript Praktikum) Vorbereitung der Probenlösungen (siehe Skript Praktikum) Durchführung der HPLC-Analysen Aufgaben zum experimentellen Teil
46 II Experimenteller Teil Coffein 46
47 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 47 Abb. II.2.2.1: Die Pumpen-Programmierung
48 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 48 Abb. II.2.2.2: Die Programmierung des Injektionsvolumens
49 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 49 Abb. II.2.2.3: Die Detektorprogrammierung (DAD)
50 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 50 Abb. II.2.2.4: Die Programmierung des Säulenthermostaten
51 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 51 Abb. II.2.2.5: Die Einstellung der Integrationsparameter
52 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 52 Abb. II.2.2.6: Die Programmierung des Autosamplers
53 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 53 Abb. II.2.2.7: Das Starten der Probensequence
54 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 54 Abb. II.2.2.8: Der Menüpunkt: Data-Analysis
55 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 55 Abb. II.2.2.9: Das Erstellen der Kalibriertabelle
56 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 56 Abb. II : Das Erstellen des Quantitativen Reports
57 II Experimenteller Teil II.3 Fragen zum experimentellen Teil (Auswahl) 57 1.) Was versteht man unter der chromatographische Durchbruchszeit t m. 2.) Welche apparativen Einflüsse können zu einer deutlichen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)? 3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit t R (X) von Benzophenon. 4.) Berechnen sie die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase u m in [cm/min] bei einer gegebenen Durchbruchszeit von t m = 1,33 min (Länge der Säule = 150 mm). 5.) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen V m der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen V R von Benzophenon. 6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon. 7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein. 8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originallösungen (Caffee- Lösung / Red Bull / Coca-Cola). 9.) Der Energy-Drink Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-sulfonsäure. Geben Sie die entsprechende chemische Formel an. 10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum Coffeinpeak in etwa erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage. 11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin.
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