LC VL) (HP ie I asold 1 R. Chromatographie I atograp 10/1 HPLC HPLC Vo V rlesung Chrom WS 20 HPLC

Transkript

1 1 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Chromatographie I HPLC Vorlesung

2 2 R. Analytik - Abteilung Institut für Organische Chemie Prof. B. König

3 3 Kapitel I: Einführung Kapitel II: Grundprinzipien Kapitel III: Der chromatographische hi h Prozeß Kapitel IV: Kapitel V: Literatur Das Chromatogramm

4 Kapitel I: Einführung 4 Chromatographie I (HPLC VL) WS 2010/11 R.

5 I Einführung HPLC? I1 I.1 Was heißt HPLC 5 H P igh P erformance-pressureressure L C iquid C hromatography ( = Hochleistungs/Druck -Flüssig-Chromatographie)

6 I Einführung HPLC? I2 I.2 Was bedeutet HPLC 6 Unterschied zwischen moderner HPLC und klassischer Säulen-Chromatographie hi? wesentlich höhere Auflösung bei Trennung (Trennung von bis zu 100 Komponenten/Lauf u. mehr) Drastische Verkürzung der Analysendauer (h Bereich von Minuten) Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit (ca g[ [ng] bis g [pg])

7 I Einführung I3 I.3 Wann wird HPLC angewendet? 7 Notwendige Voraussetzung ist die Löslichkeit der zu analysierenden Substanz in einem geeignetem Solvens Die HPLC wird eingesetzt, wenn: Substanzen schwer flüchtig oder nicht flüchtig sind (sonst alternativ Einsatz von GC) Substanzen mit rel. hohem Molekulargewicht vorliegen (MW > 500) es sich um thermisch instabile (leicht zersetzliche) Substanzen handelt.

8 I Einführung I4 I.4 Wo wird HPLC eingesetzt? 8 Zur Reinheits- und Produktkontrolle chem. Substanzen Zur Analyse von Arzneistoffen Zur Bestimmung von Wirkstoffen in biolog. Matrices Zur Bestimmung von Schadstoffen (Umweltanalytik) l tik) Zur Trennung und Reinigung von Biopolymeren (Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden...) Standardmethode in fast allen chem. Laboratorien

9 I Einführung I5 I.5 Wie wird die HPLC durchgeführt? 9 1 Pumpe Injektor 2 3 Mobile Phasen 4 Detektor Säule 5 Computergesteuerte Auswertesoftware Abb. 1: Schematische Darstellung einer HPLC-Anlage

10 I Einführung I5 I.5 Wie wird die HPLC durchgeführt? 10 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Abb. 2: Moderner HPLC-Arbeitsplatz

11 11 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Kapitel II: Grundprinzipien

12 II Grundprinzipien II.1 Grundbegriff: Chromatographie 12 Historie: M. Tswett (1906) Der Begriff Chromatographie wurde 1906 bei der Beobachtung geprägt, als sich ein Extrakt aus grünen Blättern auf einer mit gepulvertem Zucker gefüllten Säule in verschieden gefärbte Einzelfarbstoffe ( Chlorophyll, Carotin etc. ) auftrennen ließ. Chroma = Farbe / Graphein = schreiben Definition: iti Chromatographie hi Mit dem Ausdruck Chromatographie bezeichnet man einen Trennprozess,, bei welchem das Probengemisch zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen im sog. chromatographi- schen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine Hilfsphase (stationäre Phase) ruht dabei, während die andere Hilfsphase Michail Semjonowitsch Tswett (Zwet) (mobile Phase) an ihr vorbei strömt

13 II Grundprinzipien II.2 Grundbegriff: Hilfsphasen 13 Stationäre Phase: Meist ist in der Chromatographie die stationäre Phase fest (Chromatographiebett). Selten ist die stationäre Phase flüssig (dann aber als unbeweglicher stationärer, flüssiger Film auf der Oberfläche eines Feststoffes aufgebracht z.b. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie). Mobile Phase: Die mobile Phase kann sein: gasförmig flüssig Gaschromatographie Liquidchromatographie GC LC/HPLC

14 II Grundprinzipien II.3 Grundbegriff: Verteilungskoeffizient K 14 beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärer Phase und mobiler Phase: K c s (X) c m (X) (1) K = Verteilungskoeffizient c s (X) = Stoffmengenkonzenztration der Substanz X in der stationären Phase c m (X) = Stoffmengenkonzentration der Substanz X in der mobilen Phase

15 II Grundprinzipien II.4 Grundbegriff: Kapazitätsfaktor k 15 beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärer Phase und mobiler Phase : k k n s(x) n m (X) (2) = Kapazitäts- oder Retentionsfaktor n = Stoffmenge der Substanz X in der (X) s stationären Phase n m (X) = Stoffmenge der Substanz X in der mobilen Phase

16 II Grundprinzipien II.4.1 Zusammenhang zwischen k und K 16 da n = c V Kapazitätsfaktor Verteilungskoeffizient LC VL) k n (X) c s (X) V (X) c (X) V s (X) n m (X) m st mob V st K Vmob (3) Chroma atograph hie I (HP V st V mob = Volumen der stationären Phase i. d. Säule = Volumen der mobilen Phase i. d. Säule Die unterschiedliche Wechselwirkung von Substanzen in zwei nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl unterschiedlicher Chromatographiearten:

17 II Grundprinzipien 17 II.5 Chromatographiearten (Auswahl) Trennung durch Adsorption Stationäre Phase Adsorptions-Chromatographie hi flüssig / fest (NP/RP-HPLC) mobile Phase Trennung durch Löslichkeit Verteilungs-Chromatographie flüssig / flüssig Stationäre Phase

18 II Grundprinzipien II.5 Chromatographiearten (Auswahl) 18 Trennung durch Ladung (vereinfacht) Stationäre Phase Ionenaustausch- Chromatographie Chroma atograph hie I (HPLC VL) Trennung durch Ladung (realistisch) Ionenaustausch- Chromatographie Stationäre Phase

19 II Grundprinzipien II.5 Chromatographiearten (Auswahl) 19 Trennung durch Größe/Gestalt Stationäre Phase Ausschluß-Chromatographie SEC, GPC Chroma atograph hie I (HPLC VL) Trennung durch Affinität Affinitäts-Chromatographie z.b. Antigen/Antikörper Stationäre Phase

20 II Grundprinzipien II.6 Strategie der Trennung (HPLC) 20 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Abb. 3: Schema zur Auswahl der passenden Chromatographieart

21 II Grundprinzipien II.7 Die Säulenauswahl (HPLC) 21 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Abb. 4: Beispiel verschiedener HPLC-Säulen

22 22 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Kapitel III: Der chromatographische Prozeß

23 III Der chromatographische Prozeß III.1 Der Trennvorgang 23 1 min 5 min A 10 min 15 min 20 min Abb. 5: Zeitlicher Verlauf einer chromatographischen Trennung B C

24 III Der chromatographische Prozeß III.2 Definitionen Definition: Chromatogramm Mit dem Ausdruck Chromatogramm bezeichnet man die graphische Auftragung der Größenwerte einer Größe (z.b. der Absorption), die am Ende der stationären Phase, also z.b. am Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen die Zeit oder das Volumen der mobilen Phase. 24 Definition: Retentionsvolumen / -Zeit Das Volumen der mobilen Phase, das die stationäre ti Phase vom Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz X als Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das Retentionsvolumen der Substanz X: der Substanz X: V R (X) Retentionszeit: t R (X). Die zugehörige Zeit nennt man die Retentionszeit

25 III Der chromatographische Prozeß III.3 Das RetentionsvolumenV V R (X) 25 V R (X) = F t (X) (4) R Retentionsvolumen [ml] Retentionszeit [min] Volumenfließgeschwindigkeit [ml min -1 ]

26 III Der chromatographische Prozeß U III.4 Die lineare Fließgeschwindigkeit U m 26 u m F F F Af A r 2 (5) u m : lineare Fließgeschwindigkeit i it der mobilen Phase [cm s - 1 ] F : Volumenfließgeschwindigkeit i it [ml s - 1 ] A f : freie Säulenquerschnittsfläche [cm 2 ] A r : Säulenquerschnittsfläche [cm 2 ] : Säulenradius [cm] : Interpartikel-Porosität der Säule ( Kieselgel 0.8)

27 III Der chromatographische Prozeß III.4.1 Die Interpartikelporosität 27 Vc Vst V V V c st 0 c (6) LC VL) : Interpartikelporosität Chroma atograph hie I (HP V c V St V 0 : geometrisches Säulenvolumen [cm 3 ] : Volumen der stationären Phase [cm 3 ] : Interpartikelvolumen der Säule [cm 3 ]

28 III Der chromatographische Prozeß III.5 Zusammenhang zwischen u m und u(x) Die lineare Wanderungsgeschwindigkeit u(x) der Substanz X muß der linearen Wanderungs-(Fließ) (Fließ)-Geschwindigkeit der mobilen Phase u m direkt proportional sein. 28 LC VL) dh d.h. u(x) wird idi immer kleiner u m oder höht höchstens gleich u m sein. Chroma atograph hie I (HP u (X) u und u u m (X) m (7)

29 III Der chromatographische Prozeß III.5.1 Der Proportionalitätsfaktor m (X) 29 Der Proportionalitätsfaktor m (X) muß also zwischen 0 und 1 liegen. u (X) = m (X) um (8) Es kann sich bei m (X) nur um den Stoffmengenanteil der Substanz X in der mobilen Phase handeln, weil ja die Substanz X nur dann überhaupt mit der Geschwindigkeit u m transportiert (d.h. mitgenommen) werden kann. Dieser Stoffmengenanteil ist wie folgt definiert:

30 III Der chromatographische Prozeß III.6 Zusammenhang m (X) (X) und k 30 m (X) n (X) m (X) 1 1 n n (X) (9) s (X) nm (X) s k 1 1 n (X) m (X) u( (X) = m (X) k = Retentions-/Kapazitätsfaktor u m = u u m u(x) 1 k + 1 u m (10) k 1 (11)

31 III Der chromatographische Prozeß III.6.1 Grenzfälle u (X) = m (X) u m = 1 k + 1 u m (10) 31 Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: Erhält man zwei Grenzfälle: 1.) Für Für (X) (X) = 0 u (X) 0 (X) 1 m d.h. es befindet sich keine Substanz X in der mobilen Phase - alles ist an die stationäre Phase gebunden, d.h. keine Wanderung der Substanz m (X) = 0 u (X) = m 2) 2.) Für m (X) = 1 (X) u d.h. es befindet sich die gesamte Substanz X in der mobilen Phase die Substanz X hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre Phase, d.h. Wanderungsgeschwindigkeit von X gleich der der mobilen Phase.

32 III Der chromatographische Prozeß III.7 Die Totzeit t 0 32 Die Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz X auf die Säule und dem Auftauchen der Substanz X im Detektor, die im 2. Fall verstreicht, wenn also keine Wechselwirkung der Substanz X mit der stationären Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. Totzeit der Säule t 0. Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog. Totvolumen V 0 der Säule bezeichnet. Der Gebrauch dieser Bezeichnungen V 0, t 0 wird von der IUPAC jedoch wegen vieler Verwechslungsmöglichkeiten heute nicht mehr empfohlen. t

33 III Der chromatographische Prozeß III.8 Die Durchbruchszeit t m So ist mit dem sog. Totvolumen V 0 oft nicht nur das eigentliche Totvolumen der Säule gemeint gewesen, sondern zudem das Totvolumen Totvolumen, das durch das apparative Chromatographiesystem verursacht wird (z.b. durch die Volumina der Verbindungskapillaren,, der Anschlüsse,, der Konnektoren etc.) Dies wird alles berücksichtigt in den Ausdrücken: Durchbruchsvolumen bzw. Durchbruchszeit Als Symbole von der IUPAC empfohlen: V m und t m 33

34 III Der chromatographische Prozeß III.8.1 Durchbruchsvolumen V m und -zeit t m 34 LC VL) Definition: Durchbruchsvolumen / -zeit Als Durchbruchsvolumen V m bzw. -zeit t m wird dasjenige Volumen (bzw. die dazu korrespondierende Zeit) ) bezeichnet, das benötigt wird, um eine nicht-retardierende Substanz von der Injektionsstelle bis zur Detektionsstelle zu befördern. Dieses Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen der mobilen Phase im Säulenbett V mob die Totvolumina Totvolumina des Gerätes z.b. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im Detektor etc.. Chroma atograph hie I (HP t m Ist für alle Sunstanzen gleich Die Auftrennung unterschiedlicher h Substanzen kommt ausschließlich dadurch zustande, daß sich diese auf Grund ihrer chemischen Beschaffenheit unterschiedlich lange in der stationären Phase aufhalten und somit zu unterschiedlichen Retentionszeiten eluieren, d.h. getrennt werden

35 III Der chromatographische Prozeß III.8.1 Durchbruchsvolumen V m und -zeit t m 35 Anmerkung! Da bei modernen HPLC-Anlagen diese eigentlichen Totvolumina des apparativen Systems auf ein Minimum reduziert sind (durch minimale Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), können diese Parameter zur Vereinfachung der Problematik hier vernachlässigt werden, und es wird im Folgenden davon ausgegangen, daß t m ausschließlich von der Säulenlänge beeinflußt wird, und sich die Wanderungsgeschwindigkeiten u(x) um u m bei konstanter Flußrate auf die Säulenlänge beziehen.

36 III Der chromatographische Prozeß III.8.2 Zusammenhang t m, t R (X) (X) und t S 36 t R (X 2 ) t (X) t (X) t R (X) S (X) m t R (X 1 ) t m t S (X 1 ) t S (X 2 ) Zeit [s] Abb. 6: Musterchromatogramm mit t S (X) als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phase

37 III Der chromatographische Prozeß III.8.3 Bestimmung von t m und und t R(X) 37 Wovon sind Durchbruchszeit t und m Retentionszeit t R (X) abhängig? von den Abmessungen der Säule (Länge: g L) ) von den Wanderungsgeschwindigkeiten u m, u(x) Durchbruchsvolumen h Retentionsvolumen ti t m V m L V m L t um F R (X) VR (X) F u(x) (12) (13)

38 Pause 38 Chromatographie I (HPLC VL) WS 2010/11 R.

39 III Der chromatographische Prozeß III.8.4 Zusammenhang t m, t R (X) (X) und und k 39 t R (X) V R (X) u m (14) t m V m u(x) berücksichtigt man die bekannte Beziehung u (X) = m (X) u m = 1 u m (10) k + 1 ergibt sich:

40 III Der chromatographische Prozeß III.8.4 Zusammenhang t m, t R (X) (X) und und k 40 t R (X) t m VR (X) k 1 (15) V m LC VL) V (X) V ( k 1 ) (16) R (X) m Chroma atograph hie I (HP t (X) t ( k 1) R (X) m (17)

41 III Der chromatographische Prozeß III.9 Berechnung des Kapazitätsfaktors k 41 Auflösen von Gleichung (17) nach k dem Kapazitäts- oder Retentionsfaktorfaktor: LC VL) k t R (X) tr (X) tm ts (X) 1 (18) t t tm m m Chroma atograph hie I (HP ts (X) k tm k t (X) k t t k 1 R m m (19)

42 III Der chromatographische Prozeß III.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors k 42 k t (X) t 1 (20) R (X) t m Definition: iti Kapazitäts-(Retentions)faktor t ti Um Chromatogramme, die z.b. an verschieden langen oder unterschiedlich h dicken Säulen oder bei unterschiedlicher h Flußgeschwindigkeit gemessen wurden, vergleichen zu können, bedient man sich einer dimensionslosen Größe,, dem Kapazitäts-(Retentions)faktor k. Der Kapazitäts-(Retentions)faktor k einer Substanz X ist eine auf die Durchbruchszeit normierte Elutionsgröße.

43 III Der chromatographische Prozeß III.9.2 Beispiele 43 k t (X) R t m 1 t (X) t ( k 1) R (X) m (20) (17) LC VL) Substanz eluiert unverzögert t R = t m k =0 Chroma atograph hie I (HP Literaturangabe k = 5 mit eigener Säule (gleiches Material aber andere Dimensionen) z.b. t m = 2.5 min zu erwarten t R = 15 min

44 III. Der chromatographische Prozeß III.10 Die Theorie der Böden 44 Es gibt mehrere Möglichkeiten, den chromatographischen Trennprozess genauer zu beschreiben. A B C Zeit Ziel: Die Position jeder einzelnen Komponente im chromatographischen Trennsystem und ihre dortige Konzentrationsverteilung in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt zu können.

45 III. Der chromatographische Prozeß III.10 Die Theorie der Böden 45 Ein möglicher Ansatz: Theorie der Böden (theoretisches ti h Trennstufenmodell) Übertragung g der Theorie der fraktionierten Destillation auf die Säulenchromatographie Übernimmt Begriffe von Bodenhöhe und Bodenzahl Anschaulich, aber natürlich nur näherungsweise richtig, da die Annahme einer wiederholten Einstellung separater Gleichgewichte beim Vorliegen einer bewegten mobilen Phase eher unrealistisch ist

46 III Der chromatographische Prozeß III.10 Die Theorie der Böden 46 LC VL) Bodenhöhe Boden Chroma atograph hie I (HP Abb. 7: Beispiel eines Destillationsturms

47 III Der chromatographische Prozeß III Trennstufenhöhe und Trennstufenzahl Bodenhöhe = Trennstufenhöhe H Bodenzahl = Trennstufenzahl N z Definition: Trennstufenhöhe Die Trennstufenhöhe H (die Höhe eines Theoretischen Bodens), oder HETP (height equivalent to one theoretical plate) ist die Strecke, auf der sich beim Fließen der mobilen Phase das Gleichgewicht einmal einstellt. Wovon sind Trennstufenhöhe H und Trennstufenzahl N z in der Chromatographie abhängig? 47

48 III Der chromatographische Prozeß III Beeinflussung von H und N Z Trennstufenhöhe und Trennstufenzahl werden beeinflußt von: Länge der Säule 48 H L Nz N z L H (21) (21a)

49 III Der chromatographische Prozeß III Bedeutung von H und N Z 49 Bedeutung: LC VL) H minimal N Z maximal Trennung optimal Chroma atograph hie I (HP N Z charakterisiert somit die Leistungsfähigkeit einer Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die Trennstufenzahl und somit die Trennleistung.

50 III Der chromatographische Prozeß III Einfluß von u m auf H und N Z Gegeben sind z.b.: Dimensionen d. Säule: (Länge, Dicke) Füllung d. Säule (Material, Porenweite Partikelgröße etc.) 50 Für den Experimentator einzig variierbar soll sein: Fluß, bzw. die Fließgewschwindigkeit g u der m mobilen Phase durch die Säule. Je größer der Fluß, desto weniger oft kann sich das Gleichgewicht einstellen -> Trennung schlechter!!! Je niedriger der Fluß, desto mehr kommen z.b. Diffusionsvorgänge ins Spiel -> Trennung schlechter!!!

51 III Der chromatographische Prozeß III Das H/u-Diagramm 51 e H [µm] fenhöhe ennstuf Tre 50 H/u-Kurve 30 Minimum 10 bei LC ca cm/s (GC: cm/s) 0,5 1,0 1,5 Fließgeschwindigkeit u [ cm/s ] Abb. 8: H/u-Diagramm zur Bestimmung des optimalen Flusses

52 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die van Deemter-Gleichung Hierbei handelt es sich um eine empirische Gleichung mit folgenden Größen: 52 H B A C um (22) u m Chroma atograph hie I (HPLC VL) Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) A-Term Longitudinal- Diffusion B-Term Stoffaustausch -Anteil C-Term

53 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die van Deemter-Gleichung 53 Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) A-Term beschreibt die Bandenverbreiterung, die von der Geometrie der Festphasenteilchen und von der Packung dieser Teilchen in der Säule herrührt. Statistisch gesehen haben einige Probenmoleküle einen relativ kurzen Weg, während andere gezwungen sind, einen Umweg zu machen.

54 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die van Deemter-Gleichung 54 Longitudinal- Diffusion B-Term berücksichtigt: Strömungsverteilung! Laminare Strömung (Molekültransport) ist in der Mitte zwischen zwei Partikeln größer als in der Nähe der Packungspartikel. berücksichtigt: Diffusion der Moleküle! beschreibt im H/u-Diagramm eine Hyperbel und ist in der LC zu vernachlässigen.

55 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die van Deemter-Gleichung 55 Stoffaustausch -Anteil C-Term berücksichtigt: Kinetische Beiträge! Geschwindigkeit des Stoffaustausches zwischen stationärer und mobiler Phase. Geschwindigkeit des Massentransportes der Probenmoleküle in die Poren der stat. Phase und aus ihnen heraus.

56 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die van Deemter-Gleichung Die H/u-Kurve erhält man nach Addition aller drei Terme der van-deemter Deemter- Gleichung: 56 µm] öhe H [µ stufenhö Trenn B-Term 0,5 H/u-Kurve 1,0 1,5 C-Term A-Term Fließgeschwindigkeit u [cm/s] Abb. 9: H/u-Diagramm mit den Termen der Van-Deemter-Gleichung

57 III Der chromatographische Prozeß III.12 Facit der van Deemter Gleichung 57 In der Chromatographie hi ist man bestrebt, bt gute Trennungen in relativ kurzen Analysenzeiten durchzuführen. D.h. man versucht eine minimale Trennstufenhöhe bei möglichst flacher H/u Kurve zu erzielen. Dies läßt sich erreichen durch: Geringe Korngrößen (Einfluß auf A-Term und C-Term Term) Enge Korngrößenverteilung bzw. dichte Packung (Einfluß auf B-Term Term) Geringer Säulendurchmesser (Einfluß auf A-Term und B-Term)

58 III Der chromatographische Prozeß III.13 Bedeutung in der Praxis 58 Bei gut gepackten HPLC-Säulen liegt H beim Doppelten bis Fünffachen des mittleren Teilchendurchmessers d p. LC VL) Trennstufenhöhe HPLC: : µm Trennstufenzahl HPLC: Chroma atograph hie I (HP Trennstufenhöhe GC: mm Trennstufenzahl GC:

59 Kapitel IV: Das Chromatogramm 59 Chromatographie I (HPLC VL) WS 2010/11 R.

60 IV Das Chromatogramm IV.1 Qualitative Aussagen 60 z.b. Zuordnung von Substanzen über identische Retentionszeit identische Retentionszeit t R (x). Ggf. Injektion von Referenzsubstanzen. z.b. Identifizierung von Substanzen über UV-APEX APEX-Spektren (Diodenarray), siehe Seminar und Praktikum. z.b. Identifizierung von Substanzen über Isoplot und 3-D-Plot.

61 IV Das Chromatogramm IV Der Isoplot 61 0 mau Absorption 100 mau Chroma atograph hie I (HP LC VL) Well enlänge e [nm] Abb. 10: Isoplot einer chromatographischen Trennung Zeit [min]

62 IV Das Chromatogramm IV.1.2 Der 3D-Plot 62 Abb. 11: n [mau] bsorption Ab 3D-Plot einer chromatographischen Trennung

63 IV Das Chromatogramm IV.2 Quantitative Aussagen 63 Die Fläche eines Peaks ist der eingespritzten Stoffmenge proportional Dadurch hat jede Substanz für jede Chromatographiebedingung ihren eigenen Proportionalitätsfaktor. Diese Proportionalitätsfaktoren können durch Injektion von Kalibriergemischen, die die zu bestimmenden Substanzen in bekannter Konzentration enthalten, ermittelt werden (Methode des Internen Standards - siehe Seminar und Praktikum)

64 IV Das Chromatogramm IV.3 Kenngrößen des Chromatogramms 64 t R (X 2 ) t (X) t (X) t R (X) S (X) m t R (X 1 ) LC VL) t m Chroma atograph hie I (HP Abb. 12: t S (X 1 ) t S (X 2 ) Zeit [s] Musterchromatogramm mit t S (X) als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phase

65 IV Das Chromatogramm IV.4 Berechnungsbeispiele 65 Beispiel: t m = 2 min 120 s t R R( (X1) = 5 min 300 s t R (X2) = 10 min 600 s k k 1 2 tr (X ) 1 tm 300 s 120 s t 120 s t R m (X ) 2 tm 600 s 120 s tm 120 s Angabe der Flächenwerte in [mau s - 1 ] 15, 40,

66 IV Das Chromatogramm IV.5 Bewertung der Retentionsfaktoren 66 Optimale Trennung bei 1,5 < k < 5 LC VL) k < 1,5 Zu wenig Wechselwirkung zwischen Substanz und stationärer Phase Chroma atograph hie I (HP k > 5 Zu lange Analysenzeiten Zu breite Peaks

67 IV Das Chromatogramm IV.6 Das Problem schlecht getrennter Peaks 67 Chroma atograph hie I (HPLC VL) Abb. 14: t R (X1) t R (X2) Zeit [min] Chromatogramm mit schlecht aufgelöstem Peakpaar

68 IV Das Chromatogramm IV.7 Die Selektivität (Trennfaktor) α 68 beschreibt die Güte der Trennung zweier benachbarter Peaks Wird gebildet aus dem Quotienten der beiden Retentionsfaktoren k 2 und k 1 k2 ts (X 2 ) mit k k k t (X 1 ) = = 1 1 s (X 2 1 Keine Trennung 1< < < 5 optimale Trennung

69 IV Das Chromatogramm IV.8 Die Auflösung R S 69 Die geometrische Definition lautet: R S ( t (X 2 ) t R (X 1 ) ) R (X 05, ( t (X 1 ) tw (X 2 ) ) w (X 1 w 2 Basisbreite vom Peak Basisbreite vom Peak der Komponente X1 der Komponente X2

70 IV Das Chromatogramm IV.9 Das Gaußprofil 70 t R (X 1 ) t R (X 2 ) h 1 p t m Abb. 13: 2 τ (X 1 ) t S (X 1 ) 2 τ (X 2 ) 0.61 h 1 p t w w( (x 1 ) = 4 τ τ( (X 1 1) t w w( (x 2 ) =4 τ τ( (X2) t S (X 2 ) h 2 p 0.61 h 2 p Musterchromatogramm mit t w als Basisbreite und τ (X) als Diffuse Bandenverbreiterung Zeit [s]

71 IV Das Chromatogramm IV.10 Bewertung der Auflösung R S 71 R S = 1 Peaks liegen um ihre mittlere Basisbreite auseinander d.h. Überlappung 3% LC VL) 1< R S < fast vollständige (meist ausreichende) Trennung Chroma atograph hie I (HP 1.25 < R S < 1.5 R S > 1.5 vollständige, gute Trennung meist unnötig gute Trennung d.h. zu lange Retentionszeit ti it

72 Kapitel V: Literatur 72 Chromatographie I (HPLC VL) WS 2010/11 R.

73 V Literatur HPLC 73 Snyder L.R., LR Kirkland Kikl djj J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography,, John Wiley. Meyer V.R., VR Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie, Salle+Sauerländer. Unger K.K., Handbuch der HPLC,, GIT Verlag. Scott R.P.W., Chromatographic Detectors,, Jack Cazes, Cherry Hill, New Jersey Huber L., George,S.A., Diode Array Detection in HPLC,, Jack Cazes, Cherry Hill, NewJersey