Theorie. BEACHTE die unterschiedliche Terminologie Chromatographie: Trennprinzip Analysenmethode (Trennung+Detektion+Signalverarbeitung)
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- Matilde Küchler
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1 Definition der Chromatographie Theorie Physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen eine stationär angeordnet ist und die andere sich in einer definierten Richtung bewegt. BEACHTE die unterschiedliche Terminologie Chromatographie: Trennprinzip Analysenmethode (Trennung+Detektion+Signalverarbeitung) Symbole Abkürzung IUPAC Veraltet k Retentionsfaktor k (Kapazitätsfaktor) A Peakfläche F w Peakbreite b w b Peakbreite an Basis b w w h Peakbreite in halber Höhe b 0,5 H Höhe eines theoretischen Trennbodens H eff Höhe eines effektiven Bodens H N Anzahl der theoretischen Böden n N eff Anzahl der effektiven Böden N h St d reduzierte Bodenhöhe Standard Durchmesser h, HETP
2 sehr komplexer Vorgang Der chromatographische Prozess I 1. Stofftransport einer Substanz i durch eine Säule Multiplikative Verteilung Folge vieler nichtstationärer Verteilungsvorgänge zwischen stationärer und mobiler Phase Stofftransport erfolgt in mobiler Phase Aufenthalt (Retention) in stationärer Phase entsprechend Verteilungskoeffizient K i geringere Wanderungsgeschwindigkeit der Substanz i als mobile Phase (u i < u m ) Phasenübergänge erfordern Diffusion der Substanz i senkrecht zur Strömungsrichtung der mobilen Phase an die Phasengrenzfläche große gemeinsame Grenzflächen beider Phasen Theoretischer Boden (Trennstufe) gedachter Längsabschnitt der Säule, der für eine Gleichgewichtseinstellung benötigt wird (soll möglichst klein sein). Verbreiterung der Substanzzonen (unerwünscht) durch unerwünschte Diffusionsprozesse und unvollständige Gleichgewichtseinstellungen Verdünnung der Substanzen in der mobilen Phase erschwert die Trennung
3 Der chromatographische Prozess II 2. Trennung zweier Komponenten A und B wenn K A K B (Nernst scher Verteilungskoeffizient) unterschiedliche Verweildauer von A und B in stationärer Phase (selektive Verzögerung) unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten (ua ub) Trennung (Auflösung), wenn Abstand der Substanzzonen > Breite der Substanzzonen (Selektivität ) (Effizienz N) 3. Ziel geeignete stationäre Phase (GC) bzw. Phasensystem (LC) (damit K A K B ) Selektivität: GC stationäre Phase und Säulentemperatur LC stationäre und mobile Phase geringe Verteilung der Substanzzonen (schmale Peaks) Strömungsoptimum der mobilen Phase Günstige Säulendimensionen und -parameter ausreichende Trennstufenzahl je kleiner = K B /K A, desto mehr Trennstufen werden zur Trennung benötigt KGC HPLC Säulenlänge m cm Trennstufenzahl trennbare Peaks
4 Elutionschromatogramm t 0 t M t i t Ri Ausschlusszeit Mittlere Wanderungszeit hinreichend großer inerter Moleküle, die auf Grund ihrer Größe nicht in das Porensystem der Kompaktphase eindringen können. Zeit, die das Volumen V 0 zu Ausfluss aus der Trennsäule benötigt. Durchflusszeit (Totzeit, Mobilzeit, Leerzeit) Mittlere Wanderungszeit einer Inertkomponente, die in alle (zugänglichen) Poren eindringen kann. Zeit, in der das Volumen V M aus der Trennsäule fließt. Zeit, während der sich die Inertkomponente im Mittel innerhalb von V i aufhält: t i =t M -t 0 Gesamtretentionszeit (Bruttoretentionszeit) des i-ten Peaks t Ri effektive (adjusted) Retentionszeit (Nettoretentionszeit) des i-ten Peaks: t R = t M + t R b/a w b f Symmetrieparameter: Leading <1 < Tailing Peakbreite (z) Ordinatenwert im Peakmaximum w h Peakbreite in halber Höhe (z 0,5 )
5 Parameter eines Gauß-Peaks h Peakhöhe w b Basisbreite (Peakbreite zwischen den Wendetangenten an der Basislinie; umfasst 96% der Peakfläche) w h Peakbreite in halber Höhe w 0,606 Peakbreite zwischen den Wendepunkten Die Peakbreiten werden in den Größen der Retention (Zeit- oder Volumeneinheiten) angegeben Zusammenhang zwischen Standardabweichung und den Peakbreiten für Peaks in der Form von Gaußkurven:
6 Retention einer Substanz t R = t M + t R = t M (1+k) k Retentionsfaktor: k = t R /t M u i lineare Wanderungsgeschwindigkeit des Schwerpunktes einer Komponente i u i = L/t Ri mittlere Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase über die gesamte Säulenlänge = L/t M = u 0 j u 0 Auslassgeschwindigkeit am Säulenausgang j Kompressionskorrekturfaktor der mobilen Phase K c Verteilungskonstante (-koeffizient) Phasenverhältnis der Säule = V M /V S V M,V S Volumen der mobilen bzw. stationären Phase in der Säule
7 Bestimmung der Durchflusszeit t M t M Durchflusszeit, Mobilzeit, Totzeit, hold-up time Aufenthaltszeit in der mobilen Phase 1. Gaschromatographie Dosierung einer nicht bzw. kaum retardierten Inertsubstanz (t R = t M ), die vom verwendeten Detektor angezeigt wird z.b. FID Methan, Propan WLD Luft, Methan ECD Methylenchlorid Durch Regressionsrechnung aus den Retentionszeiten von n- Alkanen oder anderen homologen Reihen log t R(z) = log (t R - t M )z = a+b z Kapillarsäulen Berechnung aus Säulendimensionen und Gasdrücken L Säulenlänge (T) Viskosität des Trägergases bei der Säulentemperatur T bzw. Starttemperatur bei Temperaturgradienten r Radium des Säule p i Absoluter Säulenvordruck (Eingangsdruck p i = p o + p) Absoluter Säulenausgangsdruck (Druck am Säulenende) p 0
8 Bestimmung der Durchflusszeit t M 2. HPLC Dosierung einer Markersubstanz, die nicht bzw. kaum retardiert wird nicht vom Porensystem ausgeschlossen wird vom verwendeten Detektor angezeigt wird Beispiele: Säule Detektor Markersubstanz Normalphase UV Benzol, Tetrachlorethylen RI Cyclohexan, Benzol Umkehrphase UV Thioharnstoff Uracil (2,4-Dihydroxypyrimidin) RI D 2 O, CD 3 OD, CD 3 CN Überprüfung (Verifizierung) durch Berechnung Porosität der Säulenfüllung total poröse Partikel unporöse Partikel =0,8 =0,4 t totale Porosität t = V M /V c F Fluss der mobilen Phase Faustregel Für Säulen mit ID=4,6 mm und porösen Partikeln ist t M (min) 0,1 L (cm)
9 Verbreiterung der Elutionsprofile ( Peakverbreiterung ) In der Säule mit zunehmender Retentionszeit werden die Peaks breiter und flacher nimmt die Verdünnung der Substanzen mit der mobilen Phase zu annähernd GAUSS-Profil wirkt der Trennung entgegen erschwert die Erkennung von Peakanfang, Maximum und Peakende erschwert die Detektion von Spurenelementen Außerhalb der Säule Injektor, Detektor, Verbindungsleitungen
10 Bandenverbreiterung in der Säule I Bodentheorie liefert eine Maßzahl zur Charakterisierung des Wirkungsgrads (Trennleistung, Effizienz) einer Säule; erlaubt einen Säulenvergleich gilt nur für isotherme Arbeitsweise Theoretischer Boden (Trennstufe) benötigt Längsabschnitt der Säule für eine (in Wirklich nicht erreichbare) Gleichgewichtseinstellung Zahl der theoretischen Böden N Standardabweichung Bezug der Peakbreite auf die Retentionszeit w h Peakbreite in halber Höhe Basispeakbreite w b Höhe eines theoretischen Bodens H H = HTS = HETP = L/N L Säulenlänge Effektiver Boden nur ein Teil der Trennstufen wird für die Trennung wirksam, da in t R die Transportzeit t M enthalten ist: Zahl der effektiven Böden Höhe eines effektiven Bodens
11 Bandenverbreiterung in der Säule II Beschreibung H/u-Funktion mittlere Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase Van Deemter gepackte GC-Säulen H = A + B/ + Cu A B C Eddy-Diffusion (Streudiffusion in der Säulenpackung, Wirbeldiffusion, Mehrwegeffekt beim Umwandern der Partikel) Longitudinaldiffusion in der mobilen Phase (Diffusion in bzw. entgegengesetzt zur Stömungsrichtung) Massenaustauschterm Stoffaustauschverzögerung beim Phasenübergang Minimum bei:
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13 Van-Deemter-Gleichung für GLC in gepackten Säulen abgeleitet in der ursprünglichen Form wurde die Stoffaustauschverzögerung in der mobilen Phase (C-Term) nicht berücksichtigt H = A + B/ + C Korrektur für die Unregelmäßigkeit der Säulenfüllung Faktor für die Verschlungenheit der Gaswege durch die Säule dp Teilchendurchmesser (cm) D G Diffusionskoeffizient in der Gasphase (cm²/s) D L Diffusionskoeffizient in der Flüssigphase (cm²/s) mittlere Gasströmungsgeschwindigkeit (cm/s) df mittlere wirksame Filmdicke der Trennflüssigkeit k Verteilungskoeffizient F L Volumen an Trennflüssigkeit in der gesamten Säulenfüllung (ml) F G Gasvolumen in der gesamten Trennsäule (ml) k kxf L /F G (dimensionslos) Für eine optimale Trennung müssen alle drei Terme minimiert werden
14 Bandenverbreiterung in der Säule III Golay: Dünnfilm-Kapillarsäulen Kein A-Term, da Kapillarsäule (keine Packung!) B Longitudinaldiffusion B=2xD i C M Massentransport- oder Massenübergangsterm (Widerstand gegen Massentransfer) in der mobilen Phase C S Massentransportterm in der stationären Phase D i D ik d c d f Diffusionskoeffizient des Analyten i in der mobilen Phase (Gasphase) Diffusionskoeffizient des Analyten i in der stationären Phase (Trennflüssigkeit) Innendurchmesser der Säule Filmdicke der stationären Phase
15 Schlussfolgerungen aus der H/u-Kurve Der Wirkungsgrad (Trennleistung, Effizienz) einer Säule hängt von der Strömungsgeschwindigkeit der mobilen Phase ab: Für jede Säule existiert eine optimale Geschwindigkeit u opt, bei der H min am geringsten ist maximale Trennstufenzahl beste Auflösung u opt ist nicht identisch für alle Probenkomponenten Die Lage des Strömungsoptimums ist abhängig von: Innendurchmesser der Säule bzw. Partikelgröße der Packung Art der mobilen Phase (D M -Wert) Probekomponente (D M -Wert, k-wert) In der Praxis wird oft bei höheren Lineargeschwindigkeiten als u opt gearbeitet Es lässt sich ableiten, welche Trennstufenhöhen bestenfalls erreichbar sind (Leistungsgrenzen): gepackte Säule H min /d p 2-8 GC H min 1 mm HPLC H min 0,01 mm Kapillarsäule H min /d 1-2 GC H min 0,2-0,5 mm
16 Einfluss der Trägergasart auf die H/u-Kurve Säule: Stat. Phase: Temperatur: Testsubstanz: 25 m x 0,25 mm ID (d f = 0,25 m) Polymethylsiloxan OV C n-c 17 (k=5) u opt N 2 He H 2 cm/s
17 Auflösung R S Definition R S beschreibt Grad der Auftrennung benachbarter Peaks R S t/w b(2) R S = 1,5 Basislinientrennung (>99,5%) Auflösungsgleichung für Peaks mit nahezu gleicher Breite Beschreibt das Zusammenwirken von Säuleneffizienz, Selektivität und Verzögerung bezüglich der Trennbarkeit Aussagen 2 prinzipielle Wege zur Verbesserung der Auftrennung eines Substanzpaares Verringerung der Peakbreite: Effizienz Vergrößerung des Peakabstandes: Selektivität
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