Manual. JBS Proteinkristallisation Starter Kit. Einführung und Theorie der Kristallisation

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1 Cat. No. CS-401DE Nur für in vitro Anwendungen Haltbarkeit: 12 Monate Lagerung: 4 C Amount 1 Kit Einführung und Theorie der Kristallisation Zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins stehen heute zwei wesentliche Methoden zur Verfügung. Das sind zum einen die Kernresonanzspektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance = NMR) und zum anderen die Röntgenstrukturanalyse. Da mit der NMR-Methode nur Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von etwa Dalton (25 kda) untersucht werden können, ist man zur Strukturbestimmung von größeren Proteinen oder von Protein-Komplexen auf die Röntgenstrukturanalyse angewiesen. Die ersten mit dieser Methode aufgeklärten Strukturen waren die des Myoglobin (1950) und des Hämoglobin (1955), die im Jahr 1962 mit dem Nobelpreis für Chemie honoriert wurden. Der erste Schritt für eine Strukturaufklärung mittels Röntgenstrukturanalyse - und auch gleichzeitig die Hauptschwierigkeit - ist das Züchten von ausreichend großen Einkristallen. Ein Kristall ist eine dreidimensional periodische Anordnung von Bausteinen, das heißt in unserem Fall von Proteinmolekülen. Wie bekommt man nun ein solch kompliziertes Molekül wie ein Protein dazu, Kristalle zu bilden? Um von der gelösten Form zur kristallinen Form zu gelangen, muss zuerst die Löslichkeit des Moleküls verringert werden. Dabei kommt es dann in aller Regel zur Bildung eines amorphen Niederschlags. Hat man die Bedingungen aber so gewählt, dass zueinander komplementäre Bereiche auf der Oberfläche der Proteinmoleküle vorliegen, so kommt es zu spezifischen Wechselwirkungen zwischen den Proteinmolekülen. Liegen diese geometrisch günstig, so kann es zur Kristallbildung kommen. Bei der Kristallisation unterscheidet man prinzipiell zwei Schritte: 1. die Keimbildung (Nukleation) und 2. das Kristallwachstum. Beide Schritte erfolgen bei richtig gewählten Bedingungen in einem Bereich des Phasendiagramms, der als übersättigte Lösung bezeichnet wird (siehe Abbildung 1). Allerdings benötigt man ein höheres Maß an Übersättigung für die Keimbildung als für das Kristallwachstum. Der Keimbildungsbereich wird auch als labile Zone bezeichnet, der Wachstumsbereich als metastabile Zone. Zur Keimbildung muss man also die labile Zone erreichen. Allerdings kommt es dann auch gleich zum schnellen Wachstum der Keime, und es besteht damit die Gefahr, dass zwar Kristalle entstehen, diese aber sehr zahlreich und sehr klein sind. Da man aber an möglichst großen Kristallen interessiert ist (ca. 0,5 mm Kantenlänge), ist es wichtig, dass nicht zu viele Keime entstehen. Das bedeutet für das Experiment, dass man sich sehr langsam an den Nukleationsbereich annähern muss, so dass den entstehenden Keimen genug Zeit zum Wachsen bleibt. Abb. 1: Schematisches Phasendiagramm eines Protein-Fällungsmittel-Gemischs Der Übergang von einer stabilen Lösung zu einer übersättigten Lösung kann ganz einfach durch die Verschiebung der Lage im Phasendiagramm beschrieben werden. Dies wird im Wesentlichen entweder durch eine Erhöhung der Proteinkonzentration oder durch eine Erhöhung der Fällungsmittelkonzentration erreicht. Seite 1 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

2 Die physikalischen Prozesse, die man ausnutzen kann, um eine Konzentrationsänderung herbeizuführen, sind die Dialyse und die Diffusion. Beide sind durch den Transport von Materie charakterisiert. Besonders die Diffusion durch den Gasraum hat sich für die Proteinkristallisation als geeignet erwiesen. Ein schematischer Versuchsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Methode wird auch als "Hängetropfenmethode" (hanging drop) bezeichnet. Die Proteinlösung befindet sich in dem Tropfen, der an der Unterseite eines Mikroskopdeckgläschens hängt. Die Tropfengröße beträgt üblicherweise 0,5 µl bis etwa 20 µl. Die Reservoirlösung im unteren Bereich der Vertiefung enthält eine hohe Konzentration an Fällungsmittel (Präzipitans) und hat damit einen niedrigeren Dampfdruck als die Proteinlösung. Im Laufe der Zeit diffundiert Wasser aus dem Tropfen in das Reservoir (ca. 1 ml Volumen). Damit erhöht sich die Proteinkonzentration im Tropfen und auch die Konzentration der anderen Stoffe, die neben dem Protein noch vorhanden sind. Bei richtig gewählten Bedingungen kommt es nach einigen Tagen bis Wochen zur Kristallbildung. Prinzipiell benutzt man hier also ein System (Tropfen plus Reservoir), welches sich nicht im thermodynamischen Gleichgewicht befindet. Die Einstellung dieses Gleichgewichts sollte möglichst langsam erfolgen. Welche Stoffe kommen als Fällungsmittel in Frage? Im Prinzip kann jede Substanz, die Einfluss auf die Löslichkeit des Proteins hat (und die das Protein auch in hohen Konzentrationen nicht denaturiert), als Fällungsmittel eingesetzt werden. Man unterscheidet die verschiedenen Fällungsmittel, die üblicherweise in der Proteinkristallisation verwendet werden, nach dem Effekt, den sie in der Lösung hervorrufen. So verändern Salze wie (NH 4) 2SO 4, NaCI, LiCI, KH 2P0 4 etc. die lonenstärke der Lösung. Die Löslichkeit von Proteinen in Abhängigkeit von der lonenstärke ist in Abbildung 3 gezeigt. Der Bereich links des Maximums wird auch als Einsalzbereich, der Bereich rechts davon als Aussalzbereich bezeichnet. Abb. 3: Abhängigkeit der Löslichkeit S von der lonenstärke l Abb. 2: Die Hängetropfenmethode Im Einsalzbereich erhöht sich die Löslichkeit zunächst, bedingt durch die Erhöhung der Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels. Das führt dazu, dass die Ladungen auf der Proteinoberfläche besser mit der Umgebung wechselwirken können. Im Aussalzbereich verringert sich die Löslichkeit wieder, weil die Ladungen des Fällungsmittels mit den Ladungen auf der Proteinoberfläche um Wassermoleküle konkurrieren. Organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Propanol, MPD (2-Methyl-2,4-pentandiol), Acetonitril oder andere erniedrigen die Löslichkeit, indem sie die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels herabsetzen. Auf dieselbe Art und Weise wirken organische Polymere wie zum Beispiel PEGs Seite 2 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

3 (Polyethylenglykole), die in verschiedenen Molekulargewichtsbereichen (400 bis Da) erhältlich sind. Ein weiterer wichtiger Parameter, der die Löslichkeit von Proteinen beeinflusst, ist der ph-wert. Die Löslichkeit ist in aller Regel am isoelektrischen Punkt (IEP) des Proteins am geringsten, da am IEP das Protein eine Nettoladung von Null trägt. Aufgrund der Vielzahl der Parameter, die die Kristallisation beeinflussen können, und der relativ geringen Proteinmenge, die man üblicherweise zur Verfügung hat, ist es praktisch unmöglich, alle Parameterkombinationen über den gesamten Bereich zu testen. Es muss daher eine Strategie entwickelt werden, die es ermöglicht, mit begrenztem Einsatz an Material (Protein) schnell ans Ziel zu kommen. Eigenschaften von Proteinkristallen Proteinkristalle sind prinzipiell genau wie Kristalle kleiner Moleküle oder Salzkristalle aufgebaut. In Bezug auf die Packung der Moleküle und die Symmetrie gelten die gleichen Regeln. Allerdings gibt es auch einige fundamentale Unterschiede. Diese erstrecken sich auf mechanische und optische Eigenschaften von Kristallen sowie auf deren Zusammensetzung. Proteinkristalle sind sehr weich und enthalten in der Regel 30% bis 70% Wasser, welches relativ ungeordnet im Kristall vorliegt. Der Kristall ist aus gleich angeordneten Proteinmolekülen aufgebaut, die große Hohlräume besitzen und mit Wasser bzw. Puffermolekülen gefüllt sind. Dadurch liegen die Proteinmoleküle im Kristall in einer quasi natürlichen, d.h. wässrigen Umgebung, vor. Die native Struktur (Faltung) des Proteinmoleküls ist die wesentliche Voraussetzung für die Aktivität eines Proteins. Beides bleibt im Proteinkristall erhalten und lässt sich durch Aktivitätstests von Enzymen in kristalliner Form nachweisen. In manchen Fällen ist die kristalline Form sogar eine natürliche Speicherform, wie beispielsweise beim Insulin. Ein weiterer Beweis für das Vorliegen der nativen Konformation im Kristall kommt von der NMR- Spektroskopie. In allen bisher untersuchten Fällen, in denen man die Strukturen des gleichen Proteins in Lösung (NMR) und im Kristall (Kristallographie) kennt, sind diese bis auf Messungenauigkeiten identisch. Der Der Proteinkristallisation Starter Kit von Jena Bioscience beinhaltet das notwendige Material, um anhand eines Beispielproteins (Lysozym aus Hühnereiweiß) die ph-abhängigkeit der Kristallisation in Gegenwart von NaCI als Fällungsmittel zu untersuchen. Dabei wird zum einen der ph-wert in kleinen Schritten verändert, während zum anderen die Konzentration des Fällungsmittels stufenweise variiert wird (Grid-Screen). Des Weiteren beinhaltet das Kit Material, um Lysozym nach der Batch-Methode zu kristallisieren. Dabei werden Kristallisationslösung und Proteinlösung direkt zusammengegeben, wobei ohne Konzentrationsausgleich über die Gasphase Kristalle entstehen. Bestandteile des Kits: well SuperClear TM Platten für die Hanging- Drop-Kristallisation 2. Eine Spritze mit 5 ml Silikonfett zum Abdichten der Platten Deckgläser für die Hanging-Drop- Kristallisation 4. 1 Objektträger ml 20% (m/v) NaCl-Lösung 6. je 3 ml 2 Na-Acetatpuffer ph 4,0; 4,4; 4,8 und ph 5,2 7. Lysozymlösung in Wasser, 20 mg/ml 8. 1 ml Kristallisationslösung für die Batch- Kristallisation (30% (m/v) PEG 5000-MME, 1 M NaCl, Na-Acetat ph 4,4) Weitere benötigte Materialien, die dem Kit nicht beiliegen: 1. Eppendorf-Pipetten oder ähnliches, mit der Möglichkeit, 1 µl bis zu pipettieren 2. Passende Pipettenspitzen 3. Destilliertes oder deionisiertes Wasser (A. dest.) 4. Eine Pinzette 5. Einen einigermaßen gleichmäßig temperierten Raum (20 22 C) 6. Ein Mikroskop (50 100fache Vergrößerung) zum Betrachten der Kristalle Seite 3 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

4 Durchführung des Hanging-Drop- Experiments Im Hanging-Drop-Experiment (siehe Abbildung 2) wird Lysozym kristallisiert, indem der verdünnte Protein/Kristallisationslösung-Tropfen in einer dicht verschlossenen Kristallisationsplatte gegen die Kristallisationslösung im Reservoir equilibriert wird. Hierfür kommt ein Na-Acetat/NaCl-System zum Einsatz, wobei die Abhängigkeit der Kristallisation vom ph-wert des Puffers und der NaCl-Konzentration deutlich wird. Es wird ein ph-bereich von ph 4,0 bis ph 5,2 und eine NaCl-Konzentration von 4 bis 9% in Kombination getestet. Ablauf des Experimentes: 1. Einfetten der Kristallisationsplatten mit Silikonfett: Fetten Sie mit dem Silikonfett aus der beiliegenden Spritze den Rand der einzelnen Vertiefungen (Wells) der Kristallisationsplatten gleichmäßig ein. Es sollten keine Verdickungen im Fettrand zu sehen sein und keine Fäden über die Wells gezogen werden. 2. Pipettieren der Reservoirlösungen nach dem Pipettierschema (Abbildung 4): Das Gesamtvolumen pro Reservoir soll 1 ml betragen und die Pufferkonzentration nach dem Mischen mit dem Fällungsmittel und Wasser. 3. Pipettieren der Kristallisationstropfen: Pipettieren Sie jede Reihe (A-D) separat. Zuerst wird 1 µl Proteinlösung auf das Deckglas aufgebracht. Anschließend pipettiert man zu jedem Tropfen die zugehörige Reservoirlösung. Dabei wird die Öffnung der Pipettenspitze vorsichtig auf die Oberfläche des Proteintropfens aufgesetzt und die Reservoirlösung herausgedrückt, ohne dass Blasen im Tropfen entstehen. Nach jedem Tropfen muss die Pipettenspitze gewechselt werden. 4. Aufsetzen der Deckgläser: Nun werden die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette aufgenommen, umgedreht und mit dem Tropfen nach unten auf die Vertiefungen aufgesetzt. Danach sollten sie leicht angedrückt werden, so dass das Fett den Innenraum der Vertiefungen luftdicht abschließt. 5. Zum Schluss wird der Deckel vorsichtig auf die Platte gesetzt. Bewahren Sie die fertig pipettierten Platten anschließend in einem geeigneten Raum mit möglichst konstanter Temperatur (20 22 C) auf. Zum Betrachten der Tropfen unter dem Mikroskop ist es günstig, den Deckel der Platten zu entfernen. Es sollte darauf geachtet werden, dass das Mikroskopobjektiv nicht durch Fett verschmutzt wird und dass der Proteintropfen richtig fokussiert wird. Polarisiertes Licht ermöglicht die Unterscheidung zwischen geordneten Proteinkristallen und amorphem Niederschlag. Kristalle sind im Gegensatz zu amorphem Niederschlag doppelbrechend (optisch anisotrop) und spalten einfallendes Licht in zwei Strahlen auf, die senkrecht aufeinander stehen. Unter dem Polarisationsmikroskop funkeln sie so wie typische Kristalle. Abbildung 5 zeigt die Kristallisationstropfen unter dem Mikroskop (40fache Vergrößerung) nach 20 Stunden. Die an den Bildern angegebenen Koordinaten (A - D, 1 6) entsprechen dabei den Koordinaten auf der Kristallisationsplatte. Es wird deutlich, dass die Zahl der Kristalle mit wachsender NaCl-Konzentration ansteigt. Dabei wird ein Optimum an Kristallqualität bei einer etwas geringeren als der maximalen NaCl-Konzentration erreicht, entsprechend dem in Abbildung 1 gezeigten Phasendiagramm (vgl. Keimbildung und Kristallwachstum in der Einführung dieses Manuals). Dementsprechend nimmt die Keimbildung mit wachsendem ph-wert des Puffers ab, was sich in einer Verringerung der Kristallanzahl mit steigendem ph-wert äußert. Durchführung des Batch-Experimentes Beim Batch-Versuch pipettiert man analog zum Hanging-Drop-Experiment je einen Tropfen der Kristallisationslösung und einen Tropfen Proteinlösung zusammen auf ein Deckglas. Hierbei ist die Zusammensetzung der Kristallisationslösung derart optimiert, dass die Kristallisation des Proteins umgehend einsetzt. Nach ca. 20 Minuten sind unter dem Mikroskop erste kleine Kristalle zu sehen, die im Laufe der nächsten Minuten schnell größer werden. Seite 4 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

5 Auf diese Weise erhält man Lysozymkristalle deutlich schneller als mittels Hanging-Drop-Methode. Ablauf des Experimentes: 1. Pipettieren der Kristallisationslösung: Pipettieren Sie 4 µl der Batch-Kristallisationslösung auf den Objektträger. 2. Pipettieren der Proteinlösung: Pipettieren Sie nun 2 µl der Proteinlösung zum Tropfen der Kristallisationslösung dazu. Beobachten Sie den Tropfen unter dem Mikroskop. Die Kristallisationslösung/Protein-Verhältnisse können auch variiert werden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit des Kristallwachstums und einer unterschiedlichen Menge an Kristallen führt. Dank Wir danken Herrn Dr. Manfred S. Weiss für die Idee und die Mithilfe beim Zustandekommen dieses Kits. Große Teile dieses Manuals basieren auf Versuchsanleitungen von Herrn Dr. Weiss. Rechtliches Alle Abbildungen dieses Manuals sind Copyright Dr. Manfred S. Weiss. Alle Rechte an den Abbildungen verbleiben beim Eigentümer. Vervielfältigung auch auszugsweise dieses Manuals Bedarf der schriftlichen Genehmigung der Jena Bioscience GmbH. Seite 5 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

6 Endkonzentration 20 % NaCl 4 % 5 % 6 % 7 % 8 % 9 % ph 4,0 2 Natriumazetat ph 4,4 ph 4,8 ph 5,2 20 % NaCl 2 Na-Azetat Destilliertes Wasser Abb. 4: Pipettierschema für das Hanging-Drop-Experiment Seite 6 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015

7 A B C D Abb. 5: Ansicht der Tropfen des Hanging-Drop-Experiments nach 20 Stunden (40fache Vergrößerung) Seite 7 von 7 Letzte Aktualisierung: 7. April 2015