Tiermodelle zur Etablierung und Optimierung von Knorpelersatztherapien bei Knorpelschaden
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- Jürgen Dunkle
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1 42. Seminar über Versuchstiere und Tierversuche, Berlin, September 2013 Tiermodelle zur Etablierung und Optimierung von Knorpelersatztherapien bei Knorpelschaden Gundula Schulze Tanzil Shl Charité Universitätsmedizin Berlin, CBF, Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
2 heute Gelenkknorpel und Knorpelschaden Aktuelle Therapiemethoden Unmet medical need Tiermodelle Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
3 Gelenkknorpel Knorpelaufbau Gelenkk knorpel extrazelluläre Knorpelmatrix (ECM) Chondrozyten Knoch hen rot: Proteoglykane Chondrozyten Knorpelmarker: Kollagen Typ II Aggrekan Cho ndron Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
4 Knorpel Gelenkknorpelzonen, l Knorpelarten I II III Tidemark IV blau: Proteoglykane Gelenkknorpel (Kaninchen) Knochen Perichondrium Nasenseptumknorpel Ohrknorpel Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
5 subchondraler Übergang Gelenkknorpel Kapillarschlingen reichen in kalzifizierten Knorpel Tidemark kalzifizierter Knorpel Zementlinie subchondraler Knochen Spongiosa Hargrave Thomas EJ et al., 2013, J Anat: in press Madry H et al., 2010, Knee Surg Traumatol Arthrosc 18: Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
6 Knorpeldefekte Knorpel Knochen full th hickness chondral pa rtial Defektgröß ße Therapie Knorpelzell Trans Totalendoprothese plantationen OCT, Mikrofrakturierung Alter 18 Jahre 50 (55) Jahre osteochondral Mensch: meist chondrale Defekte Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
7 Knorpelzelltransplantationen ACT: Autologe Chondrozyten Transplantation Kollagenmembran Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
8 Veränderung von Chondrozyten in vitro kultivierte Chondrozyten: 1. Tag 5. Tag Dedifferenzierung Monolayerkultur: Fibroblasten ähnliche Morphologie Proliferation, Kollagen Typ II, Aggrekan Kollagen Typ I Dreidimensionale Kultur Kollagen Typ II Redifferenzierung Beispiele klinisch eingesetzter Chondrozytentransplantate Novocard 3D Novocard 3D Chondrosphere HE HE Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
9 Knorpelersatz: Beispiele Zell/Biomaterial basierte Verfahren Technik Produkt (Hersteller) 1. Generation: Zellsuspension mit Periostlappen ACT ACT-Biotissue (BioTissue), Carticel (Genzyme), ChondroCelect (TiGenix) Chondrotransplant (Co.don) 2. Generation: Zellsuspension mit Kollagenmembran ARTHROcell 3D (CellGenix/Geistlich/Ormed), Chondro Gide (Geistlich Biomaterials) 3. Generation: Zell-Matrix-Konstrukt MACT Hyaluronsäure-Vlies Hyalograft C (Anika Therapeutics) Kollagenmembran Ath ArthroMatrix ti (Orthogen), MACI (Matrix induced d autologous chondrocyte implantation (Verigen) Kollagenmatrix Polymerflies NOVOCART (TETEC) BioSeed-C (BioTissue) 4. Generation: 3D-Knorpelzellkonstrukt ACT-3D Chondrosphere (Co.don), NOVOCART inject (TETEC) Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
10 Knorpelersatz: Vorläuferzell basierte Verfahren Implantation von autologen Vorläuferzellen in Knorpeldefekt: Chondrogenese Steinwachs et al., 2011: Klinische Behandlung von Gelenkknorpelschäden mithilfe von autologen Vorläuferzellen Bundesgesundheitsbl ndheitsbl 54, 797 Aspiration von Knochenmarkblut Beladung einer Kollagenmembran Einnähen der Membran in den Defekt Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
11 Unmet medical need schnelles, einzeitiges, arthroskopisches Verfahren entwickeln Entnahmemorbidität reduzieren (alternative Zellquellen?) Dedifferenzierung in der Kultur vermeiden ideales Biomaterial: biokompatibel, biomechanisch stabil, langsam resorbierbar einfaches Handling, chondrokonduktiv Kryokonservierung viele dieser Aspekte müssen im Tiermodell erarbeitet werden Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
12 Forschungsansätze zur Gelenkknorpelrekonstruktion Tiermodell in vitro Schulze Tanzil, 2009 Ann Anat 191,
13 ) Was ist besonders an menschlichem Knorpel? cke (mm) Knorpeldi Stockwell RA 1971, Anat 109, 411 KJ Haustiere: Körpergewicht korreliert i. W. mit Knorpeldicke (Maus, Ratte, Katze, Kaninchen, Hund, Schaf, Rind) Mensch: größte Knorpeldicke, geringste Zelldichte! Knorpeldicke: Schwein: 1,5 2 mm Pferd: 22 2,2 mm Ahern BJ et al., 2009, Osteoarthritis Cartilage 17, 705 Körpergewicht (kg) Femurkondylen Spezies Gewicht (kg) Knorpeldicke (mm) Zelldichte (x 10 3 /mm 3 ) Mensch ca. 72 2,26 14,1 Rind ca ,68 19,8 Schaf ca. 50 0,84 52,9 Hund ca. 24 0,67 44,4 Kaninchen ca. 3,2 0, Katze ca. 2,3 0, Ratte ca. 0,3 0, Stockwell RA 1971, Maus ca. 0,025 0, J Anat109, 411 Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall und Wiederherstellungschirurgie
14 Was ist besonders an menschlichem Knorpel? Mensch Speziesunterschiede im Gelenkknorpel (Knie)! Schwein Kaninchen Ratte blau: Knorpel Proteo oglykane Proteoglykanverteilung: unterschiedlich Proliferation + Dedifferenzierung: Mensch < Schwein < Schaf, Pferd Pa ssage 1 Passage 0 Schulze Tanzil G et al., 2009 Histochem Cell Biol 131,
15 Pa assage 0 Was ist besonders an menschlichem Knorpel? Mensch Schwein Schaf Pferd rot: Kollagen Typ II grün: Aktin blau: Zellkerne e 1 Passage Pass sage 0 rot: Knorpel Proteoglykane blau: Zellkerne Passage 1 Schulze Tanzil G et al., 2009 Histochem Cell Biol 131,
16 Polyglykolsäure (PGA) Scaffolds in vivo (nude mice) artik kulär PGA Kultur 1 Woche 6 Wochen 12 Wochen Ø 6 mm 3 Wochen in vitro Ch hondrozyt ten aurikulä är subkutane Implantation Nacktmaus für 1, 6, 12 Wochen Zell frei naso oseptal resorbiert % Größenv veränderung artikuläre aurikuläre nasoseptale 1 Woche 6 Wochen 12 Wochen Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57 69.
17 PGA in vivo (nude mice), Proteoglykane 1 Woche 6 Wochen 12 Wochen PGA 100 µm Chondrozyten Zell frei nasoseptal aurikulär artikulär blau: K norpel Proteoglykane Fibrin resorbiert Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57 69.
18 Kollagen Typ II Ca++ Nachweis 6 Wochen 6 Wochen 12 Wochen positive Kontrolle Gelenkknorpel artikulär artikulär 100 µm 100 µm Ch ondrozyten Zell frei nasoseptal aurikulä r nasoseptal aurikulär resorbiert Zell frei Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57 69.
19 PGA in vivo (nude mice), Histologie PGA hist tologische er Score in vivo Zeit (Wochen) PGA Scaffolds articuläre artikuläre auriculäre aurikuläre nasoseptale Chondrozyten Zell frei Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57 69.
20 PGA im osteochondralen Defekt (Kaninchenmodell) 3 Wochen in vitro lebende/tote Zellen PGA loge Chon ndrozyten n läre artikulär re autol auriku 50 µm in vivo Implantation in osteochondralen Knorpeldefekt (Patellagleitlager) Analyse der osteochondralen Defektheilung ( Wochen) Lohan A et al., submitted.
21 PGA im Kaninchenmodell PGA makroskopische Beurteilung Chondrozyten artikuläre aurikuläre Zell frei Leerdefekt 6 Wochen 12 Wochen Wochen 6 14 Makroscore Le eerdefekt Ze ell frei au urikulär ar rtikulär Lohan A et al., submitted.
22 PGA im Kaninchenmodell PGA mikroskopische Beurteilung histologisc cher Score Zeit in vivo 6 Wochen 12 Wochen 0 Chondrozyten Lohan A et al., submitted.
23 Hybridschwein Schwein als Knorpelmodell juvenil (3 5 Monate) Göttinger Minipig Femur Kondylen: Minipig vs. Hybridschwein lat µm 3000 links: medial, rechts: lateral Sehne: M. extensor digitorum longus Hybridschwein Minipig pg Blutgefäße Hybridschwein Göttinger Minipig lateral Minipig lat. vs. med. ossifizierende Zellen in der Kultur Müller C et al., 2013 Exp Biol Med in press.
24 Schwein als Knorpelmodell Hybridschwein juvenil Göttinger Minipig Zellverteilung in Zone I III kultivierte Chondrozyten kultivierte Chondrozyten re elative Gene expression Kollagen Typ II Hybridschwein Göttinger Minipig Aggrekan Hybridschwein Göttinger Minipig Sox Hybridschwein Göttinger Minipig Müller C et al., 2013 Exp Biol Med in press.
25 PGA PGA im Minipigmodell 10 makroskopischer Score 8 mm chondraler full thickness Defekt in vivo 6 Monate artikulär aurikulär Leerdefekt PGA im Defekt Leerdefekt artikulär aurikulär fertige Knorpelnaht Lohan A et al., 2013 Ann Anat in press.
26 PGA im Minipigmodell 25 histologischer Score in vivo 6 Monate 10 5 gering ger 0 gesunder artikulär aurikulär Leerdefekt Knorpel a Leerdefekt artikulär aurikulär HE 500 µm Vergrö ößerung: hö öher 100 µm Kno orpeloteoglyka pro geringer ne 500 µm Lohan A et al., 2013 Ann Anat in press.
27 PGA im Minipigmodell 15 immunhistologischer Score in vivo 6 Monate 10 5 gesunder Knorpel Leerdefekt artikulär 0 aurikulär artikulär aurikulär Leerdefekt Kollag gen Typ II 50 µm Typ I Kollagen Typ X Lohan A et al., 2013 Ann Anat in press.
28 Zusammenfassung Mensch: einzigartige Anatomie und ungünstige Knorpelbiologie osteochondrale/chondrale Defektmodelle Großtiermodell Schwein: zeigt knorpelbiologische Ähnlichkeiten zum Menschen, Rasse /Linien typische Unterschiede gute Verträglichkeit des Biomaterials PGA, aurikuläre Chondrozyten als Zellquelle denkbar
29 Acknowledgement Prof. Dr. med. Wolfgang Ertel Dr. med. vet. Anke Lohan, Dr. Riccarda Müller Ulrike Marzahn, Dr. Karym El Sayed, Claudia Müller PD Dr. Andreas Hi Haisch, hdr. Katharina Söl Stölzell Carola Meier, Marion Lemke, Benjamin Kohl Claudia Conrad Bayer Innovation GmbH Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Campus Benjamin Franklin Klinik für Unfall und Wiederherstellungschirurgie mit dem Arbeitsbereich Orthopädie
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