Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Abteilung Lebensmittelsicherheit Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin
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1 BUNDESINSTITUT FÜR RISIKOBEWERTUNG Aktuelle Aspekte der Risikobewertung von Nanomaterialien in Lebensmitteln Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Abteilung Lebensmittelsicherheit Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin
2 Potentielle Aktionsfelder von Nanotechnologie im Lebensmittelbereich Material Verpackungen Produkte NANO LM Sicherheit von Lebensmitteln Landwirtschaft Zusatzstoffe Quelle: eigene Darstellung nach Meili (2005) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 2
3 Natürliche Nanopartikel in Lebensmitteln In Milch Im Hühnerei Bei Fetten und Fettbegleitstoffen Stoffwechsel Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 3
4 Organische Nanopartikel als Trägerstoffe, Carrier, Kapseln Aquanova, Deutschland Nanotechnologie zur Herstellung von Mizellen - um unlösliche bioakive Substanzen in Lösung zu bringen - um Wasser/Fettlöslichkeit von Inhaltsstoffen zu ändern - Vitamine A, C, D, E, K - -carotin - Isoflavone - Omega-Fettsäuren Oder Nutralease TM Co-enzyme Q10 (Ubiquinon) Lutein Lycopene Phytosterol Vitamin D, E, A, beta-carotine Omega 3 FS Isoflavone, Phytosterine www. Aquanova.de Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 4
5 Bratöl Canola Active Oil enthält Nano-Phytosterolkapseln (30 nm) - Cholesterinsenkung, Hersteller- und Vertriebsland: Israel Nano-Grüntee - bessere Verfügbarkeit des in Teeblättern enthaltenen Selens: Steigerung der antioxidativen Wirkung (Hersteller- und Vertriebsland: USA im Internet) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 5
6 Anwendungsbeispiele für Nanobeschichtungen von Verpackungen Vermeidung von Schwitzwasserbildung (Anti- Beschlag-Effekt) Vereinfachung der Restentleerung von Tuben und Flaschen Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 6
7 Anorganische Nanomaterialien Titandioxid (z.b. als Schokoladenüberzug zur Verbesserung des Aussehens von Schokoladen oder zum Aufhellen von Salatdressings) Gefahrenpotenzial TiO 2 induziert DNA-Veränderungen u. genet. Instabilität in vivo (Maus); Trouiller et al., 2009 Siliziumdioxid bzw. Kieselsäure (zur Verbesserung der Fließeigenschaften z.b. von Ketchup und als Fließhilfsmittel für pulverförmige Lebensmittel) Effekte im Zellkern- Störung der Replikation u. Transkription Aluminiumsilikate (ebenfalls als Fließhilfsmittel für pulverförmige Lebensmittel) Neubewertung bei Verwendung von Nanopartikeln erforderlich Laut BLL keine Anwendung i.d. Lebensmittelindustrie Analytik von Nanomaterialien in Lebensmitteln wird in zentralen Lebensmitteluntersuchungsämtern aufgebaut! Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 7
8 Titanium dioxide* approved food additive (E171) contains a significant fraction (~36%) of the particles in the nano-scale; used in cake icings, sweets, chewing gum, etc insoluble and persistent material; Children have highest intake (Adult 1 mg Ti/kg /day child 2-4 times more) Silica** approved food additive (E551) contains a significant fraction (43 to 50%) in the nanoscale; used in e.g. coffee creamers, soup powders, etc * Weir, A., Westerhoff, P., Fabricius, L., Hristovski, K. and von Goetz, N. (2012) Titanium Dioxide Nanoparticles in Food and Personal Care Products, Environ. Sci. Technol., 46: ** Dekkers S, Krystek P, Peters RJ, Lankveld DP, Bokkers BG, van Hoeven-Arentzen PH, Bouwmeester H, Oomen AG (2011) Presence and risks of nanosilica in food products, Nanotoxicology 5(3): Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 8
9 Durch Nanoformulierungen unterschiedlichster Art können Effekte erzielt werden: Verbesserung bzw. Veränderung der Löslichkeit und homogenere Verteilung von Substanzen durch Beeinflussung der Polarität Dadurch auch eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit (Gefahr einer Überdosierung) Schutz vor Einflüssen des Produktionsprozesses, z.b. Zerstörung von Substanzen durch Hitzeeinwirkung oder Lagerungseinflüsse (Aroma, Farbe) Veränderung der optischen Eigenschaften, z.b. können üblicherweise trübende Substanzen klare Lösungen ergeben, oder es können durch optische Effekte Farbänderungen erfolgen. Diese potentiellen Anwendungen und noch andere stellen ein reichhaltiges Instrumentarium dar für das Designen von Lebensmitteln bzw. neuartigen Lebensmittel, Funktionellen Lebensmittel oder Nahrungsergänzungsmitteln dar. Auch Im Kosmetikbereich werden diese Möglichkeiten und weitere nutzbar sein. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 9
10 Nanoprodukte in Forschung, Entwicklung und Anwendung Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 10
11 Kaufbereitschaft von Nanoprodukten als Maß der Verbraucherakzeptanz (BfR, 2006) Oberflächenversieglung und -pflege Kleidung Kosmetik Lebensmittel % 20% 40% 60% 80% 100% Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 11
12 Risikobewertung erforderlich hinsichtlich - Zulassung geregelter Stoffe - Vorhandensein von NP als potentielle Kontaminanten in Lebens- und Futtermitteln - Allgemeine Anfragen zur Applikation von NT in LM Produktion Auswirkungen auf Bioverfügbarkeit, Nährwert etc. Risikoforschung notwendig Immer noch viele offene Fragen: Physikochemische Eigenschaften industrieller NP als potentielle LM-Zusatzstoffe Binden diese an andere LM-Bestandteile oder bleiben sie als freie NP im GI-Trakt? Haben NP als LM-Zusatzstoffe Effekte auf GI-Funktionen oder auf GI-Mikroflora? Größenbeschreibung der veränderten Absorption und BV und toxikologische Signifikanz Abgrenzung zu Novel Food Risiken durch indirekte Kontamination? Migration aus Verpackungen? Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 12
13 Anorganische Verbindungen - Kupfer Niere Akute Toxizität von Kupfer: Vergleich von Micro- und Nanopartikel Hintergrund: - Cu ist ein Mikronährstoff Cu-Toxizität führt zu Hämolysis und zu Leber sowie Nierenschädigungen Ziel: Vergleich Akute Toxizität von Cu-Mikro- und Nanopartikel nach oraler Gabe Nano-Cu (23 nm, SSA 2, cm 2 /g, 1, (Partikel Anzahl) /µg) Micro-Cu (17 µm, SSA 3, cm 2 /g, 44/µg Maus, Einzeldosis (oral), Gewebe nach 48 h analysiert) Rel. Toxizität: Ionisch > NP > MP Micro-Cu Nano-Cu Kontrolle Niere keine - Nekrosis, Glomerulitis Milz keine - Atrophie, Fibrosis Leber keine - Schädigung, ALP, Cr (Chen et al., 2006) SSA; Specific Surface Area) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 13
14 Anorganische Verbindungen - Kupfer Milz Die Größenunterschiede hatten unterschiedlichen biologische Effekte zur Folge Wahrscheinlich indirekte Wirkung durch die Freisetzung der Cu Ionen Vergleich der biologischen Aktivitäten zeigt, die Oberfläche/Masse Angaben (SSA) im Vergleich zu mg/kg erscheinen besser Daten demonstrieren, dass nicht-toxische Substanzen nicht unbedingt nicht-toxisch bleiben, wenn Partikel verkleinert werden Wenn physikalische Eigenschaften sich ändern, ist es erforderlich, die biologischen Effekte zu untersuchen Toxische Effekte von NP (v.a. Oxide, Metalloxide) nach oraler Aufnahme bisher wenig untersucht; Langzeitstudien/Kanzerogenitätsstudien bisher nicht durchgeführt. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 14
15 Toxicity studies with nanoparticle after oral uptake in vivo Gold 4, 10, 28, 58, nm mice Copper Zinc Cu-Ions 23,5 nm 17 µm 58 nm nm mice mice Selenium nm mice Zinc, Iron, Silicium Titanium Dioxid 300 nm, 100 nm nm nm nm mice 21 nm mice Intestinal uptake Distribution acute toxicity liver, kidney, spleen injury Blood diagnostics Blood diagnostics Blood coagulation histopathology acute toxicity liver injury bioavailability Distribution Effect on Se-Enzymes acute toxicity Genotoxicity (DNA deletion, Comet, micronuclei, strand breaks, oxidative damage) Hillyer and Albrecht, 2001 Chen et al., 2006 Wang et al., 2006 Zhang et al., 2007 Cha and Muyung, 2007 Trouillier et al., 2009 Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 15
16 Generelle Aspekte nanoskaliert im Vergleich zu mikroskaliert - Höhere Exposition hinsichtlich Teilchenanzahl pro Masseneinheit - Geringe Größe, große Oberfläche könnte vermehrt ROS (reaktive Sauerstoff Radikale) produzieren - Expositionswege können differieren z.b. olfaktorischer Transport - Verschiedene Verteilung im Gewebe aufgrund verschiedener Größe oder Oberflächen-Chemie (z.b. inflammat. Immunantwort ist mehr induziert durch feines und ultrafeines (~21 nm) TiO 2 ) - Neue Eigenschaften von nanoskalierten Material kann einen neuen Wirkmechanismus zur Folge haben. Notwendigkeit einer Risikoforschung für Risikobewertung 1. nanoskalierte Substanzen können durchaus im Vergleich zum Ursprungsmaterial verschiedene physikalische und chem. Eigenschaften besitzen Folge: mögliche Änderungen der toxikologischen Eigenschaften 2. Dosis-Wirkungsbeziehungen von nanoskaligen Material adäquat experimentell untersuchen (inklusive sehr guter Charakterisierung) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 16
17 Aufnahme, Distribution, Elimination = Toxikokinetik nach oraler Aufnahme Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 17
18 Faktoren, die die orale Aufnahme von NP beeinflussen Durchmesser unter 1 µm, abnehmender Durchmesser führt zu zunehmender Aufnahme Oberflächenladung nicht ionische NP werden besser aufgenommen Form und Elastizität Form hat keinen klaren Effekt, Elastizität fördert Durchgang durch Kapillaren Physikalische und chemische Stabilität Aggregatbildung; chemische Stabilität beeinflusst die Abbaubarkeit und die Freilassung von eingekapseltem Material Physiologie der GI-Traktes (normal vs geschädigt) Verteilung im Körper Größenabhängigkeit Elimination wenig bekannt Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 18
19 Artificial digeston of Nanoparticles Tagat TO TM Tween TM 20 Ag core diameter about 17 nm spherical particles Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 19
20 Physico-Chemical Characterization I (prior to digestion) Cooperation Hydrodynamic radius (r H ) DLS (dynamic light scattering) Core dimensions (r SAXS ) SAXS (small angle X ray scattering) Separation of NP`s based on their hydrodynamic diameter A4F (asymmetric flow field flow fractionation) element concentrations ICP MS Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 20
21 q y Intensity (a. u.) AgPure before digestion R (nm) q (nm -1 ) p 1 in water p 1 water UV-absorption (a.u.) Prior to Digestion Hydrodynamic Radius: 14 nm 1.0 Core Radius: 7 nm AgPure before digestion Time (min) AgPure before digestion Intensity (a.u.) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 21 Hydrodynamic radius (nm)
22 Artificial Digestion artificial digestion based on DIN Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 22
23 Physico-Chemical Characterization II (after digestion) After Digestion Hydrodynamic Radius: in saliva: 25 nm in gastric juice: 100 nm in intestinal juice: 76 nm Core Radius: 7 8 nm (main part, 60%) + fractions of di and trimers Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 23
24 Cytotoxicity Tests (X-celligence impedance measurements) only digestion fluid (all three fluids together) Results 1. cells loose cell cell contacts 2. cells become spherical digested nanoparticles 3. cells die (at about µg/ml Ag) BUT digestion reduces toxicity undigested nanoparticles Böhmert et al., 2013: Nanotoxicology (in press) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 24
25 Scientific opinion on potential risks arising from nanoscience and nanotechnologies on food and feed safety. Question No EFSA-Q a, Adopted on 10 February 2009 Scientific Opinion of the Scientific Committee Übersicht über das gegenwärtige Wissen, definiert die Erfordernisse für die Risikobewertung von hergestellten Nanomaterialien, identifiziert Lücken Wesentliches Ergebnis: Das Paradigma der Risikobewertung (hazard identification, hazard characterization, exposure assessment and risk characterization) ist auf Nanomaterialien anwendbar. jedoch, Die spezifischen Eigenschaften der Nanomaterialien sollten berücksichtigt werden. Feststellung, dass nur sehr wenige Daten über eine orale Aufnahme existieren. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 25
26 Guidance on the risk assessment of the application of nanoscience and nanotechnologies in the food and feed chain Question No EFSA-Q , Adopted on 06 April 2011 EFSA Scientific Committee The guidance complements existing guidance documents for substances and products submitted for risk assessment in view of their possible authorisation in food and feed. Guidance is provided on the physico-chemical characterisation requirements of engineered nanomaterials and the testing approaches to identify and characterise hazards arising from the nanoproperties. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 26
27 Nanopartikel für Ernährungszwecke Träger für Mikronährstoffe und andere Substanzen (Liposomen, Mizellen, Vesikel) zwecks Erhöhung ihrer Bioverfügbarkeit aus Lebensmitteln Funktionelle Lebensmittel und Nahrungsergänzungsmitteln ( Nanoceuticals ) Inverkehrbringen als Lebensmittel ohne vorherige Genehmigung? Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 27
28 Novel Food Verordnung (EG) 258/97 Umfasst a)..... (f) Lebensmittel und Lebensmittelzutaten die mit neuartigen Prozessen hergestellt wurden, die zu signifikanten Änderungen in der Zusammensetzung oder Struktur der Lebensmittel bzw. der Zutaten führen können, die Einfluss auf ihren Nährwert oder ihren Metabolismus haben können... müssen vor dem Inverkehrbringen einer Risikobewertung im Rahmen eines Genehmigungsverfahrens unterzogen werden. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 28
29 Novel Food Revision (failed in March 2011) Draft definition of engineered nanomaterials: Any intentionally produced material One or more dimensions of the order of 100 nm or less that is composed of discrete functional parts, many of which have one or more dimensions of the order of 100 nm or less Including structures, agglomerates or aggregates which may have a size above the order of 100 nm but retains properties that are characteristics of the nanoscale Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 29
30 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Nanotechnologie kann die Formulierung wie die Löslichkeit von Stoffen ändern bei gleichen oder anderen physiologischen Eigenschaften Nanotechnologie kann die Bioverfügbarkeit von schlecht absorbierbaren Lebensmittelinhaltstoffen verbessern Anwendung der gültigen Risk Assessment Paradigmen hier möglich (EFSA) Lebensmittel mit neuen Eigenschaften durch Verwendung von Nanotechnologie fallen unter der Novel Food VO Aktuelle Fortschritte: Analytik von Nanopartiel in Lebensmitteln Expositionsmessungen werden möglich Erste Informationen zur ADME nach orale Aufnahme Es bleiben noch viele offene Fragen Definition und Unterscheidung (NP, synthetisch vs natürliche NM, matrixgebunden, frei) validierte Methoden zur Analyse/Erfassung notwendig hinsichtlich Risikoabschätzung Bedarf hinsichtlich Standardierung und Referenzmaterialien (EU-Projekte) Notwendigkeit von toxikologischen Daten (v.a. nach oraler Exposition, Toxikodynamik) Notwendigkeit von Expositionsdaten Risikokommunikation (Lernen aus den Erfahrungen mit grüner Gentechnik ) Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 30
31 Acknowledgement: U. Hansen L. Böhmert Thank you very much Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Abteilung Lebensmittelsicherheit Bundesinstitut für Risikobewertung Thielallee D Berlin Tel Fax Alfonso.Lampen@bfr.bund.de Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 31
32 in vitro digestion of AgPure DIN (2004) AgPure 15 ml saliva 35 ml gastric juice 50 ml intestinal juice analytics + cytotoxicity 5 min, ph 6,4 2 h, ph 2 2 h, ph 7,5 37 C 5min spittel (15mL) 25mg NaCl 7,5mg NaSCN 27,5mg NaSO 4 7,5mg NaHCO 3 22,5mg KCl 30mg KH 2 PO 4 7,5mg CaCl 2 2H 2 O 12,5mg α Amylase 0,5mg Harnsäure 5mg Harstoff 2h gastric juice (35mL) 145mg NaCL 35mg KCl 13,5mg KH 2 PO 4 150mg Mucin 50mg Pepsin 2h intestinal juice (50mL) 15mg KCl 25mg CaCl 2 2H 2 O 10mg MgCl 2 6H 2 O 50mg NaHCO 3 450mg Galle 15mg Harnstoff 450mg Pankreatin 15mg Trypsin 37,5mg Mucin Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 32
33 Substanzen zugelassen als Lebensmittelkontaktmaterial Siliciumdioxid (SiO X ) nanopartikuläre Oberflächenbeschichtung für Kunststoffflaschen < 100 nm Herstellung: Verwendung: Zweck: in situ aus Hexamethyldisiloxan und Hexamethyldisilazan an Innenseite von Polyethylenterephthalat (PET)-Flaschen als Gasbarriere Siliciumdioxid wurde als Oberflächenbeschichtung für diese Applikation von der EFSA bewertet (The EFSA Journal (2007) ). Titannitrid Verwendung als Additiv in Materialien für den Lebensmittelkontakt Herstellung: Verwendung: Zweck: inerte Titaniumnitrid Nanopartikel, unlöslich in allen getesteten Lebensmittelsimulantien Additiv für Lebensmittelkontaktmaterialien, in PET-Flaschen (bis zu 20mg/kg) zur Produktionssteigerung Titannitrid wurde als Nanopartikel für diese Applikation von der EFSA bewertet (The EFSA Journal (2008) ). Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 33
34 Einfluss physikalischer Eigenschaften von anorganischen Nanopartikeln auf die Bioaktivität Berücksichtigung bei der Risikobewertung Form Verhältnis Größe zu Oberfläche Elektrische Leitfähigkeit Feldstärke Ladung Zusammensetzung Löslichkeit Biodispersion Clearance Quelle: verändert nach S.T. Stern and S.E. McNeil, 2007 Lösung von tox. Substanzen Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 34
35 Forschungsschwerpunkte im BfR: Abteilung Lebensmittelsicherheit: Aufnahme und Lokalisation von Nanopartikeln aus Metalloxiden in zellulären Modellen der Darmbarriere Aufklärung potentiell toxischer molekularer Mechanismen mittels Transkriptomic s und Proteomic s-techniken Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 35
36 Eigenschaften von NP, welche die biologische Wirkung beinflussen können Form Größe/Oberfläche elektr. Leitfähigkeit Feldstärke Ladung Komposition Kristall-Struktur Löslichkeit Biodispersion Clearance Lösung von tox. Substanzen Quelle: verändert nach S.T. Stern and S.E. McNeil, 2007 Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 36
37 Anorganische Verbindungen SiO 2 (Siliziumdioxid), Synthetisch amorphe Kieselsäure: Verwendung als Lebensmittelzusatzstoff (E 551) Als Fließhilfsmittel von Bedeutung (Tomatenpulver, Speisesalz, Gewürze) Als Eintrags- u. Dispergierhilfe (z.b. Vitaminzusätze) Spezifikation enthält keine Beschränkungen hinsichtlich Partikelgröße Bericht, dass SiO 2 -Materialien (amorphe Kieselsäure) im Organismus von Enzymen aufgelöst werden können. Gefährungspotential In vitro Hinweise Effekte auf Zellkern Ansammlung von NP (40-70 nm) im Zellkern, Störung Replikation und Transkription, Cytotox Assay jedoch negativ. Herstellerfirmen bezweifeln, dass NP vorliegen Herstellungsverfahren (Flammhydrolyse) erzeugen größere Agglomerate (1-25 µm) Nassverfahren (ca. 500 µm), Gelverfahren (ca. 1 µm). > Neubewertung bei Verwendung von Nanopartikeln erforderlich TiO 2 (Titandioxid): Verwendung als Lebensmittelzusatzstoff (E 171) Hinweise auf ein Verfahren, bei dem TiO 2 -Nanopartikel auf Oberfläche von Schokoriegeln aufgetragen werden Haltbarkeit Verbesserung TiO 2 induziert DNA-Veränderungen u. genet. Instabilität in vivo (Maus); Trouiller et al., 2009 Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen Size Matters Nano auf dem Teller Seite 37
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