Modification of (bio)material surfaces using hydrophobins Janssen, Meike Irene

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1 Modification of (bio)material surfaces using hydrophobins Janssen, Meike Irene IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2004 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Janssen, M. I. (2004). Modification of (bio)material surfaces using hydrophobins s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Der Gebrauch von Hydrophobinen zur Veränderung von (Bio)material-Oberflächen

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4 Deutsche Zusammenfassung Hydrophobine sind eine einzigartige Familie kleiner Proteine (ca. 100 Aminosä uren), die von fadenförmigen (filamentösen) Pilzen ausgeschieden werden. Sie erfüllen eine Reihe von Funktionen bei Wachstum und Entwicklung der Pilze [Wessels, 1997; Wösten und Wessels, 1997; Wösten, 2001]. Indem sie die Oberflä chenspannung des umgebenden Wassers verringern, ermöglichen Hydrophobine den feinen Fäden der Pilze (Hyphen) dem Substrat zu entkommen und in die Luft zu wachsen, um sporenproduzierende Strukturen, wie z.b. den Pilzhut, zu formen. Diese Luftstrukturen sind mit Hydrophobinen überzogen und werden dadurch wasserabweisend. Hierdurch kann der Pilz nicht in die nasse Umgebung zurückwachsen, die Sporen werden durch Wind und Insekten effektiv verbreitet und der Gasaustausch in den Fruchtkörpern ist möglich, auch wenn es feucht ist. Des Weiteren heften sich Hyphen mithilfe der Hydrophobine an wasserabweisende Oberflä chen. Hydrophobine erfüllen ihre Rolle in der Natur durch Bildung eines 10nm (ein Hundertausendstel Millimeter) dünnen Films an der Grenzflä che zwischen einer wasserliebenden und einer wasserabweisenden Oberflä che. Diese Grenzflä chen finden sich beispielsweise zwischen Wasser und Luft und zwischen der Oberflä che eines Pilzes und Luft oder zwischen der Oberflä che eines Pilzes und einer wasserabweisenden Oberflä che. Diese Oberflä che kann die eines Gastherrs sein (wie die einer Pflanze) oder ein Stück Teflon, das wir als Beschichtung von Antihaft-Pfannen kennen. Während der Bildung des Films, das Assemblage genannt wird, durchlä uft das Protein mehrere Konformationsä nderungen [Wösten und de Vocht, 2000]. Das lösliche Protein transformiert über eine Zwischenform, die a-helix Form genannt wird, zu der stabilen Endform, die b-faltblatt Form genannt wird. An der Grenzflä che zwischen Wasser und Teflon wird das Hydrophobin in der a-helix Form gehalten. Der Ü bergang in die b-faltblatt Form findet nur statt, wenn das beschichtete Material mit verdünnter Seifenlösung (z.b. 2 % SDS) bei hohen Temperaturen behandelt wird. Der Hydrophobin-Film hat genauso wie Seife eine wasserliebende und eine wasserabweisende Seite. Der Film ist schwer löslich und heftet stark an wasserabweisende Oberflä chen. Duch die Assemblage von Hydrophobinen an Teflon wird das Material wasseraufnahmefä hig. Das Maß der Wasser-Aufnahmefä higkeit hä ngt vom benutzten Hydrophobin ab [Wösten, 2001]. Die oberflä chen-verä ndernden Eigenschaften von Hydrophobinen sind für eine Anzahl medizinischer und technischer Applikationen von besonderem Interesse. Der Gebrauch von Hydrophobinen in medizinischen Applikationen wurde in dieser Dissertation untersucht, wobei insbesondere Implantatmaterial betrachtet wurde. SC3 und SC4 von S. commune wurden hierfür als Modell für die Hydrophobine benutzt, wä hrend Teflon als Modell für Biomaterialien diente. 97

5 Beschichtung wasserabweisender Materialien mit natü rlichen und genetisch veränderten Hydrophobinen Die geringe Wasser-Aufnahmefä hgkeit von unbehandeltem Teflon wird durch hohe Kontaktwinkel (115 ) von Wassertropfen auf diesem Material angezeigt. Die Wasser- Aufnahmefä higkeit nimmt deutlich zu, wenn Teflon mit SC3 und SC4 in a-helix Form beschichtet wird. Die Wasser-Kontaktwinkel verringerten sich zu 36 und 54, respektive [Kapitel 3, 4]. Mithilfe von Raster-Elektronenmikroskopie und X-ray-Photoelektronen- Spektroskopie wurde gezeigt, dass die Hydrophobine das Teflon gleichmäßig bedecken [Kapitel 4]. Während 1.5 mg SC3 [Wösten et al., 1994a] und 2.7 mg SC4 [Kapitel 4] an 1m 2 Teflon binden, adsorbierten nur 0.1 mg Serumalbumin und Fibronektin [Kapitel 5]. Die letzteren Proteine bedecken das Teflon auch nicht mit einer homogenen Schicht [Murthy et al., 1987]. Wenn die Hydrophobin-Beschichtungen mit heiß em 2 % SDS behandelt werden, um den Ü bergang von der a-helix Form in die b-faltblatt Form zu induzieren, wurden 20 % und 30 %, respektive, SC3 und SC4 von der Oberflä che entfernt. Dies wurde mit verringerter Wasser- Aufnahmefä higkeit (Wasser-Kontaktwinkel von 55 und 68 für SC3 und SC4, respektive) und mit der Bildung von Poren mit etwa 50nm Durchmesser [Kapitel 4] begleitet. Die Hydrophobin- Beschichtungen in der a-helix Form und in der b-faltblatt Form sind stabil in Gegenwart von Proteinlösungen [Kapitel 5]. Mit anderen Worten: Diese Proteine waren nicht in der Lage, die Hydrophobine an der Oberflä che auszutauschen. Die Eigenschaften der SC3-Beschichtung konnten durch genetische Modifikation des N-terminalen Endes des Proteins verä ndert werden [Kapitel 2]. Das Entfernen von 25 Aminosä uren (TrSC3) und/oder das Einfügen der zellbindenden Domä ne Arg-Gly-Asp (RGD) von Fibronektin (RGD-SC3 und RGD-TrSC3, respektive) hatten keinen Einfluss auf die Eigenschaft von SC3 zu assemblieren [Kapitel 2]. Auch die geringe Wasser-Aufnahmefä higkeit der wasserabweisenden Seite des Hydrophobin-Films blieb unverä ndert, wie auch die starke Adsorption dieser Seite an wasserabweisende Oberflä chen. Dagegen wurde die Wasser- Aufnahmefä higkeit der wasserliebenden Seite verä ndert. Die RGD-SC3-Beschichtung zeigte Wasser-Kontaktwinkel von 46, während die von TrSC3 und RGD-TrSC3 69 und 57, respektive, waren [Kapitel 2 und 3]. Beeinflussung der Adsorption von Molekü len an Oberflächen durch den Gebrauch von Hydrophobin-Beschichtungen Die Funktionalitä t von Biomaterialien wird oft durch aspezifische Bindung von Proteinen an der Oberflä che des Materials verringert. Verschiedene Moleküle, die diese aspezifische Adsorption vermindern, wurden beschrieben [siehe Kapitel 1]. Die Möglichkeit, Hydrophobine hierfür zu gebrauchen, wurde in Kapitel 5 untersucht. Die Adsorption von Proteinen aus Zellkulturmedien, Sera oder Trä nenflüssigkeit an Teflon, wurde nicht durch die Anwesenheit einer Hydrophobin- Beschichtung verä ndert. Nur Fibronektin schien stä rker an SC4-beschichtetes Teflon zu binden als an unbehandeltes und SC3-beschichtetes Teflon. Allerdings kann die Form des adsorbierten 98

6 Proteins durch die Hydrophobin-Beschichtung beeinflusst werden [Patent Publikationsnr. WO 04/000880]. Weil Hydrophobine scheinbar der Entfaltung von Proteinen entgegenwirken, sind diese Beschichtungen sehr interessant um Proteine in ihrer aktiven Form an eine Oberflä che zu binden. Gebrauch von Hydrophobin-Beschichtungen um das Wachstum von Zellen zu fördern SC3 und TrSC3 erwiesen sich als nicht toxisch für Mausfibroblasten-Zellen, wenn lösliche oder assemblierte Formen dieser Proteine im Medium angeboten wurden [Kapitel 3]. Dieses Ergebnis ist von groß er Bedeutung für den Gebrauch von Hydrophobinen in medizinischen Applikationen. Um zu zeigen, dass Hydrophobin-Beschichtungen gebraucht werden können, um das Wachstum von Fibroblasten auf Teflon zu fördern, ließ man ä hnliche Zellen (humane und aus Mä usen isolierte) auf unbehandeltem Teflon und auf Teflon beschichtet mit natürlichen und genetisch verä nderten Hydrophobinen wachsen [Kapitel 2 4]. Das Wachsen der humanen Fibroblasten war minimal auf unbehandeltem Teflon. Die Anzahl der Zellen war auf SC3- und SC4-beschichtetem Teflon in a-helix Form größ er. Auch die Morphologie und mitochondriale Aktivitä t der Zellen war verbessert. Allerdings war das Zellwachstum in Abwesenheit von beschichtetem und unbehandeltem Teflon immer noch am besten [Kapitel 3]. Im Gegensatz zu den humanen Zellen wuchsen die Mausfibroblasten-Zellen auf unbehandeltem Teflon. Dies kann möglicherweise durch die Tatsache erklä rt werden, dass die Mauszellen von einer Tumorzellinie abstammen. Allerdings waren die Zellen rund und nicht flach gestreckt wie Zellen in Abwesenheit von Teflon. Hieraus kann geschlossen werden, dass die Zellen schlecht anheften. Die Mausfibroblasten wuchsen besser auf Teflon beschichtet mit RGD-SC3. Die Anzahl der Zellen war noch größ er auf TrSC3- und SC4-beschichtetem Teflon, wobei auch die Morphologie der Zellen sehr ä hnlich der der Zellen war, die in Abwesenheit von Teflon wuchsen. Aus der Tatsache, dass die Aminosä urenfolge dieser zwei Hydrophobine nur zu 45 % identisch ist, aber die Wasseraufnahme an den wasserliebenden Seiten übereinstimmend ist, kann man schließ en, dass die Wasser-Aufnahmefä higkeit entscheidend für das Stimulieren von Zellwachstum ist. Auch wenn das Wachstum von Mausfibroblasten durch die Beschichtung mit natürlichen und genetisch verä nderten Hydrophobinen in der a-helix Form verbessert wurde, war die mitochondriale Aktivitä t % reduziert [Kapitel 3]. Die Abnahme war am größ ten im Fall von SC3, wä hrend TrSC3 die Aktivitä t am wenigsten verringerte. Allerdings wurde eine Minderung der mitochondrialen Aktivitä t bei SC3- und SC4-Beschichtungen in b-faltblatt Form praktisch nicht wahr genommen [Kapitel 4]. Solange die Bedeutung einer veminderten zellulä ren Aktivitä t nicht klar ist, scheinen Hydrophobine in b-faltblatt Form die vielversprechendste Beschichtung für medizinische Applikationen zu sein. Die Ergebnisse, die in dieser Dissertation beschrieben sind, zeigen, dass natürliche und genetisch verä nderte Hydrophobine in der Tat für medizinische Applikationen, wie das 99

7 Beschichten von Implantaten, gebraucht werden können. In der Zukunft müssen solche Beschichtungen weiter verbessert werden, wobei genetische Entwicklung, chemische Kopplung oder direkte Adsorption von Molekülen gebraucht werden können. 100