Nucleotide und Nucleinsäuren

Transkript

1 Nucleotide und Nucleinsäuren

2 Bausteine Phosphorsäureester Base N-glykosidisch gebunden

3 Bausteine

4 Adenosin-5 -monophosphat Adenosin-5 -monophosphat Adenosin-5 -triphosphat 5 -AMP 5 -damp ATP ATP: energiereiche Säureanhydridbindungen

5 S-Adenosylmethionin (SAM) Methylgruppenübertragung 3,5 -cyclo-amp camp, cgmp: second messengers Intrazelluläre Signale, aus NTP durch Cyclasen

6 Nucleinsäuren

7 Basenpaarung A : T = 1:1 G : C = 1:1

8 Watson/Crick DNA Doppelhelix rechtsgängig DNA Stränge antiparallel innen hydrophobe Basen (aufeinander geschichtet) außen hydrophile Zucker und negativ geladene Phosphodiester

9 DNA in vivo: B-Form 0,33 nm /Base ~10 Basen/ Drehung rechtsgängig M = major groove M = minor groove

10 weniger Hydratisierung: A-Form in vivo: DNA/RNA Helix breiter, ~11 Basen/ Drehung rechtsgängig kleine minor groove tiefe major groove

11 Zucker- Konformation: C3 -endo in A-Form (RNA) C2 -endo in B-Form (native DNA)

12 Z-Form linksgängig selten, GC-reiche Sequenzen

13 Relative DNA - Gehalte / Zelle Konturlänge der DNA: Säuger (diploid) 1,9 m E. Coli 1,36 mm

14 Bakterielle DNA (ca 4 Mbp) ringförmig gefaltet, in Zytoplasma, keine Histone

15 Eukaryonten DNA mit Histonen kondensiert, im Zellkern

16 Histone

17 Mendel schen Gesetze Merkmale = Faktoren (heute : Gene) in 2 Formen (heute: Allele) Allele von je einem Elternteil gleich (homozygot) verschieden (heterozygot)

18 Humane Chromosomen Chromosom: Centromer Telomer Somatische Zellen (diploid, 2N): 46 Chromosomen Gameten (haploid, N) 23 Chromosomen

19 Mitose S-Phase Metaphase Cytokinese Anaphase

20 Humane Chromosomen in der Metaphase (Bandenbildung nach Giemsa- Färbung)

21 Meiose crossing over Homologe Rekombination

22 Dogma der Molekularbiologie

23 Prinzip der biologischen Informationsspeicherung Gene: Information als lineare Sequenz der DNA Basen Genetischer Code: 3 Basen Codon = Basentriplett 4 3 = 64 Worte

24 Der genetische Code Codon auf RNA (in Klammern: auf DNA-Ebene) gelb hydrophob orange hydrophil braun amphiphil 3 Stop- Codons ( Ende )

25 Transfer RNA (t-rna)

26 RNA - verschiedene Klassen (E. Coli:) ~5 % ~15% ~80%

27 Nucleinsäure-Reinigung DNA (z.b. Plasmid): Zell-Lyse (z.b. alkalische Lyse) RNA- Entfernung (Rnase) Phenolextraktion von Proteinen CsCl Ultrazentrifugation Ethanolfällung Alternativ: Ionenaustauschchromatographie RNA: alkali-labil

28 DNA Analyse durch Elektrophorese Lambda-Phagen DNA (nach Verdau) EtBr

29 Denaturieren/Renaturieren von DNA Schmelztemp.

30 Southern Blot Southern : Hybridisierung von DNA Banden mit komplementärer DNA-Sonde Northern: Hybridisierung von RNA Banden mit RNA oder DNA-Sonde (Western: Detektion von Protein Banden mit Antikörper oder Protein-Liganden)

31 Spaltung durch Nukleasen Ribonucleasen Desoxyribonukleasen Spaltung proximal (p) distal (d) zur Base (3 )

32 Restriktionsendonukleasen Eco RI

33 DNA- Sequenzierung nach Sanger (didesoxyntp)

34 Automatisierte DNA Sequenzierung

35 Humane Genome Project

36 Publikationen 15./

37 Shotgun sequencing approach (whole genome or hierarchical) Humanes Genom 2.9 Gb, (nur) 27,000-39,000 Gene

38 Zelluläre Strukturen

39 Typische eukaryote Zelle (tierisch) Plasmamembran Stoff- und Signal-Austausch; Rezeptoren Cytoplasma Zellkern Kernmembran, Nucleolus Endoplasmatisches Reticulum rauhe ER: Proteinsynthese; Glykosylierung von Proteinen Golgiapparat Glykosylierung von Proteinen Vesikel Endosomen, Lysosomen Mitochondrien Energieerzeugung Cytoskelett Form, Polarität, Beweglichkeit

40 Plasmamembran Lipiddoppelschicht (Phosphoglyceride, Spingolipide, Cholesterin) Membranproteine (integral- oder peripher an Oberfläche - gelegen) Proteinglykosylierung: immer auf Außenseite

41 Zusammensetzung verschiedener Membranen

42 Direkte Verbindung zwischen zwei Zellen: gap junctions Connexine Halbkanäle aus 6 Molekülen

43 Membrankanäle Kanalproteine mit -helicalen Transmembrandomainen Substratspezifische wäßrige Pore Oft Liganden- / Spannungs-reguliert Kein energieabhängiger Transport (gegen Konzentrationsgradienten) Beispiel: nikotinischer Acetylcholin-Rezeptor (Na + durchlässig nach Ligandenbindung)

44 Transportproteine (Carrier) für Ionen und niedermolekulare Verbindungen Oft (aber nicht immer) Kopplung von Transport und ATP-Verbrauch Kinetik ähnlich Enzymprozessen (hyperbolisch, Sättigung) - Carrier-vermittelter Transport (z.b. Glucose; ohne Energieverbrauch) - Aktiver Transport (energieabhängig gegen Konzentrationsgradienten)

45 Aktiver Transport 1) Durch die Membran (Membrankanäle) Primär aktiver Transport : direkt mit ATP Spaltung gekoppelt P-ATPasen: Na + /K + oder H + /K + Antiport, Ca ++ Uniport; energiereiche Asp- Phosphorylierung für Konformationsänderung (Aufbau von Membranpotentialen; Magensäure; Ca ++ Export) V-ATPasen: H + -Uniport (Ansäuern von Vesikeln: Endosomen, Lysosomen) F-ATPasen: H + -Uniport (z.b. Mitrochondrien, ATP Synthese) Sekundär aktiver Transport: ATP-Verbrauch eigener Schritt (z.b. Glucosetransport in intestinalen Epithelzellen) 2) Über zelluläre Vesikel Endocytose, Pinocytose, Phagocytose

46 Ca-ATPase: primär aktiver Transport, Beispiel für P- ATPase

47 Sekundär aktiver Glucosetransport (intestinale Epithelzellen)

48 P-Glycoprotein, MDR (multi drug resistance) -Protein Gehört zur ABC- Transporter- Familie Eigene Klasse an ATPasen Export von Cytostatika aus der Zelle ATP-Binding-Cassette

49 Interzelluläre Verbindungen Tight junctions (Zonula occludens) (strenge physikalische Trennung von Kompartimenten) Zonula adherens (Cadherin-vermittelt) Desmosom (Cadherin-vermittelt) z.b. Darmepithelzellen Zell-Zell-Kontakte: Cadherin-Catenin-Actin (Ca-abhängig); Cell Adhaesion Molecules (CAMs), z.b ICAM - LFA Zell-Matrix Kontakte: Integrine - Actin oder - Intermediärfilamente (Ca-abhängig)

50 Zellkern Doppelmembran Kernporen Nucleolus Chromatin - Euchromatin (locker gepackt) -Heterochromatin (dicht gepackt; wenig zugänglich für Transkription)

51 Beziehungen Zellkern - Cytosol

52 Kernpore R = Ringprotein Radiale Arme Kernseite Passiver Transport nur unter 60 kda Aktiver Transport von größeren Molekülen/Partikel

53 Mitochondrien 2-4 µm lang; Innenmembran (IM) mit Einstülpungen: Cristae (große Oberfläche) I.M.: oxidative Phosphorylierung (Energiegewinnung), biologische Oxidation; Matrixraum (MR): Fettsäureoxidation, Citratcyclus, Teile des Harnstoff-cyclus Eigene DNA (16 kb; rrnas, trnas) Eigene Ribosomen, 15% eigene Proteine Endosymbionten: aufgenommene Prokaryonten C(r) = Cristae; G = Granula Ä.M. = äußere Membran; M.R. = Matrixraum IMR = Intermembranraum

54 ER, Golgi, Lysosomen Lysosomen: Abfallbeseitigung Golgi: Adressierung von Proteinen Glykosyltransferasen Sekretion, oder lysosomales Targeting

55 Aufnahme durch Rezeptor-vermittelte Endocytose Über Clathrin - coated pits

56 4 Arten von Rezeptorvermittelter Endocytose Transferrin / TfR

57 Zytoskelett a: Mikrotubuli (Beispiel Epithelzelle) 25 nm Durchmesser b: Actinfilamente (Beispiel Muskelzelle) 7 nm Durchmesser c: Intermediärfilamente (Beispiel Leberzellen)

58 Assemblierung und Funktion von Mikrotubuli Intrazellulärer Transport GTP-abhängiger Prozess Polare Struktur Wachstum am Plusende