Trinkwasserverordnung 2001

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1 Trinkwasserverordnung 2001 Die neuen mikrobiologischen Verfahren der TrinkwV Erfahrungen Interpretation der Ergebnisse Ernst-August Heinemeyer Niedersächsisches Landesgesundheitsamt Außenstelle Aurich

2 Neue Normen quantitative Trinkwassermikrobiologie E. coli ISO coliforme Bakterien ISO Enterokokken ISO Clostridium perfringens TrinkwV2001 Koloniezahlen EN ISO 6222 Koloniezahlen Anl. 1 Nr. 5 AF Pseudomonas aeruginosa EN ISO 12780

3 Untersuchungsdauer TrinkwV-1990 / TrinkwV2001 Parameter Untersuchungsdauer in Tagen TrinkwV1990 TrinkwV2001 neg. positive Probe neg. positive Probe E. coli coliforme Bakterien altern. Verfahren Colilert 1 1 Koloniezahlen 20 C/22 C Koloniezahlen 36 C Enterokokken Clostridium perfringens *) Pseudomonas aeruginosa (ggf.länger) *) bei Verwendung des mcp Agars; ; die Verwendung des TSC Agars erfordert weitere Subkulturen, die die Untersuchung auf etwa verlängern.

4 Koloniezahlen Koloniezahlen EN ISO 6222 Koloniezahlen Anl. 1 Nr. 5 AF

5 Vergleich der Koloniezahlbestimmungsmethoden: alte und neue Trinkwasserverordnung Methode Test 1 (n=50) Test 2 (n=100) m ± s [KBE/ml] m ± s [KBE/ml] TrinkwV 20 C, 2 d +Lupe 14,3 ± 6,6 5,0 ± 2,5 EN-ISO 22 C, 3 d - Lupe 101,9 ± 61,9 9,3 ± 4,4 TrinkwV 36 C, 2 d + Lupe 8,2 ± 3,9 1,8 ± 1,7 EN-ISO 36 C, 2 d - Lupe 17,9 ± 14,8 2,4 ± 2,1 (Mittelwerte und Standardabweichung von 10 Laboratorien der AWWR, n. Tuschewitzky)

6 Koloniezahlen EN ISO 6222 und TrinkwV-90 im Vergleich (Ringversuch 1/2003) 20 C-AF 22 C-NF 36 C-AF 36 C-NF Anzahl Mittelwert 20,7 21,1 21,0 20,6 Median

7 KBE bei 20 C und 36 C (XY-Diagramm; RV 3/2002) KBE / ml bei 20 C KBE / ml bei 36 C

8 KBE Fehlerquellen das Ablesen der KBE erfolgt ohne (korrekte) Lupe die Gießtemperatur des Agars ist zu hoch die Gießtemperatur des Agars ist zu gering (Klumpenbildung) Die Nährbodenqualität ist ungleichmäßig falsche Zusammensetzung des Nährbodens (Eigenrezepturen) keine Verwendung kalibrierter Pipetten ungenügendes Schütteln der Probenflasche vor dem Pipettieren falsche Bebrütungstemperaturen Stapelhöhe der Agarplatten

9 E. coli ISO coliforme Bakterien ISO

10 Nachweis von E. coli / coliformen Bakterien ISO (Lactose TTC Agar) Bromthymolblau coliforme Bakterien (Laktose-Vergärung) Bromthymolblau (blau bei ph 7,6) (gelb bei ph 6,0) Säurebildung Hemmung der gram positiven Begleitflora durch: Tergitol-7 7 (Natriumheptadecylsulfat( Natriumheptadecylsulfat) ) u. TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid( Triphenyltetrazoliumchlorid)

11 TTC Ringversuchsprobe I/2003

12 Laktose-positive Kolonien auf TTC Agar E. coli / coliforme Bakt. (TTC Agar, RV 2/02) Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet Gruppe A NLGA AS Aurich Z RV 2/2002 Labor ID Nr X-3S X-2S X-quer X+2S X+3S [n] Laktose+ Kolonien Abb. 3 n E. coli + colif. Bakt. / 100 ml

13 TTC negative Kultur

14 E. coli / coliforme Bakterien EN ISO Inkubation und Differenzierung Anmerkung 1: Eine Verlängerung der Inkubationszeit auf (44 ± 4) h kann eine erhöhte Sensitivität des Testes zur Folge haben und kann besonders für solche Platten nützlich sein, die nach (21 ± 3) h keine typischen Kolonien aufweisen.

15 TTC Oberseite

16 TTC Unterseite

17 Trinkwasserprobenbearbeitung im Vergleich vor- und nach der Umstellung der Bebrütungsdauer (im Januar wurden 44 h, im März nur noch 21 h bei 36 C bebrütet) t) Testmonat Untersuchungen Trinkwasserproben verdächtig nach 24 / 44 h davon positiv Januar *) März *) davon 4 Proben aus einer Untersuchungsserie

18 Testprinzip Colilert Nachweis je eines spezifischen Enzyms Coliforme Keime: β-galactosidase Laktose + H 2 O Glukose + Galaktose E. coli: zusätzlich β-glucuronidase Dauer: bei positivem Ergebnis 19 ± 1 h (grenzwertig bis 22 h)

19 TTC-Agar - Colilert (lactose + Kolonien/MPN-Zahlen) Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet [n] lactose-positive Kolonien ab hier Colilert LGA AS Aurich V 1 / 2003 Labor ID Nr X-3S X-2S X-quer X+2S X+3S lac-positive Kolonien colilert

20 Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens

21 Was sind eigentlich Coliforme Bakterien? Laktose + Gasbildung Laktose + / - Gasbildung ß-Galaktosidase Coliforme Bakterien nach Trinkw-1990 Coliforme Bakterien nach Trinkw ISO Coliforme Bakterien nach Trinkw alternatives Verfahren (Colilert)

22 Laktoseabbau und ß-Galaktosidase Farmer (Manual Clin. Microb. 1995) von 121 Enterobakterien - Species bauen 38 Spezies zu 50 % Laktose zu Säure (± Gas) ab besitzen 80 Spezies zu 50 % eine ß- Galactosidase

23 Enterokokken ISO

24 Nachweis von Enterokokken (ISO ) A Filtration + Inkubation auf Membranfilteragar nach Slanetz & Bartley 2,3,5 Triphenyl- tetrazoliumchlorid (farblos) Selektiv wirkt Na-Azid Enterokokken Formazan (rot) B Bebrütung des Filters auf Galle-Äsculin Äsculin-Azid Agar (Bestätigungstest( Bestätigungstest) Enterokokken bei 44 C 1) Äsculin 6,7 Dihydroxy-Cumarin + Glucose 2) 6,7 Dihydroxy-Cumarin + Fe +++ braun-schwarze Verbindung

25 Enterokokken auf Galle-Azid Azid-Eskulin-Agar

26 Enterokokken Filtration und Plattengussverfahren im Vergleich [n] Enterokokken / Vol-Einheit NLGA AS Aurich Z RV 2 / 2002 KBE 1 ml Original EK 50 ml Filtrat entspr. 1 ml Original Abb. 5

27 Enterokokken RV 2/2002 Methode berücksichtigte Ergebnisse Mittelwert KBE / 1ml ,8 ISO ,6 Sollbereich 2,9 55,3 Enterokokken / 100 ml Wiederfindungsrate nach ISO gegenüber dem Koloniezahl-Agar beträgt damit: WFR = 14,6 * 100 % / 17,8 WFR = 82 %

28 Clostridium perfringens in Koloniezahlagar nach Filtration auf mcp-agar (TrinkwV-2001) nach Filtration auf TSC-Agar (ISO ) (Dank an Fa. Sifin/Heipha & Oxoid)

29 Clostridum perfringens in Koloniezahl-Agar NLGA AS Aurich ZS-RV 2/2002 Labor ID [n] Cl. Perfringens / 1 ml RV Probe (anaerobe Bebrütung) Abb. 7 [n] Cl. perfringens / 1 ml Original RV-Probe - Plattenguss

30 Nachweis von Cl. perfringens mcp (membrane-clostridium perfringens) Agar Saccharose Cl. perfringens Bromkresolpurpur (purpur ph 6,8) Säure gelbe Kolonien Bromkresolpurpur (gelb ph 5,2) Phenolphthalein-diphosphat (farblos) gelbe Kolonien Cl. perfringens-phosphatase Alkalisiserung durch NH 3 Phenolphthalein (rot) rote Kolonien Hemmung der Begleitflora durch: D-Cycloserin, Polymyxin-B; 44 C Bebrütungstemperatur

31 Cl. perfringens auf mcp Agar Fertigplatten (Oxoid) 3 verschiedene Membran-Filtertypen [n] Cl. perfringens / 100 ml Filtrat Schleicher & Schüll Cellulose-ME 0,2 µm PALL-Gelman-Sci Cellulose-ME 0,45 µm Schleicher & Schüll Cellulose-ME 0,45 µm NLGA AS Aurich Lab.- Id Nr. Z RV 2/ 2002 Abb. 19 vor Ammoniumhydroxid-Bedampfung nach Ammoniumhydroxid-Bedampfung

32 Nachweis von Cl. perfringens TSC (Tryptose( Tryptose-Sulfit) Agar C. perfringens Fe 2+ + H 2 S Sulfit H 2 S schwarze Kolonien Reduktion FeS Hemmung der Begleitflora durch: D-Cycloserin,, 44 C Bebrütungstemperatur Biochemische Differenzierung (n. ISO WD ) C. perfringens zeigt schwarze/graue/gelb-braune braune Kolonien auf TSC Agar,, ist im Nitrat-Beweglich Beweglich- keitsmedium nicht beweglich, reduziert Nitrat zu Nitrit, bildet im Lactose-Gelatine Gelatine-Medium Säure aus Laktose und verflüssigt die Gelatine anaerob bei 36 C innerhalb 44 Stunden.

33 Cl. perfringens auf TSC Fertigplatten (Heipha) Schwärzung durch H2S Bildung [n] KBE / 100 ml Filtrat (entspr. 2 ml Original) NLGA AS Aurich Z-RV 2/2002 Labor - ID. Nr. KBE / 100 ml Filtrat - alle Kolonien KBE / 100 ml Filtrat - nur braun-schwarze Kolonien Abb. 10

34 C. perfringens Isolierungs- und Wiederfindungsraten - Mittelwert KBE [n] bzw. Wiederfindungsrate [%] größter Mittelwert und höchste Wiederfindungsrate Mittelwert und Wiederfindungsrate 0 LGA AS Aurich RV 2/2002 KBE TSC Sifin- Heipha TSC Sonst. mcp Sifin-H GN6 Methode mcp Sifin-H SS45 mcp Sifin-H SS20 mcp OXOID GN6 mcp OXOID SS45 mcp OXOID SS20 Abb. 23 n berück. Ergebnisse Mittelwert Mittelwert - nach Farbreaktion WFR WFR - nach Farbreaktion

35 Clostridium perfringens auf mcp-agar und Membranfiltern div. Chargen mit gleicher Bestellnummer (Wiederfindungsraten) Charge Haltbarkeit WFRate mcp/oxoid Koloniezahlagar A 08/ % 100 % A 08/ % 100 % A 08/ % 100 % B 05/ % 100 % B 05/ % 100 % B 05/ % 100 % C 12/ % 100 % C 12/ % 100 % C 12/ % 100 % D 03/ % 100 %

36 Legionellen Ring-Vor-Versuch (RV 2-03) Kolonien / 50 ml (Filter) GVPC A CellNitr B Diese Daten wurden zur Berechnung des Sollbereichs herangezogen! GVPC M GVPC A CME C GVPC: MWY H A M S C M E der Firma M X-3S X-2S X (geometr. Mittel) X+2S X+3S Legionella / 50ml Abb. 1 Verteilungsmuster für Legionellen NLGA RV 2-

37 Cellulose-Nitrat Cellulose-Mischester

38 am Ringversuch sind beteiligt: Dr. Hans-Helmut Geuenich Dr. Katrin Luden Dipl. Ing. Usha Hafermann Grete Höfes Heiko Buß