Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung von Maissaatgut auf GVO- Verunreinigungen (Frühjahr 2016)

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1 Abschlussbericht Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung von Maissaatgut auf GVO- Verunreinigungen (Frühjahr 2016)

2 Impressum Herausgeber: Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Naumburger Str. 98, Jena Tel.: , Fax: Mail: Autoren: Abteilung Untersuchungswesen Dr. Sabine Domey Dipl. Ing. (FH) Maren Schmidt März 2016 Copyright: Diese Veröffentlichung ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die des Nachdrucks von Auszügen und der fotomechanischen Wiedergabe sind dem Herausgeber vorbehalten.

3 Inhaltsverzeichnis Seite 1 Aufgabenstellung Material und Methoden Anzahl und Menge der Proben Probenaufbereitung DNA-Extraktion Untersuchung der gentechnischen Veränderung... 4 mittels Real-time PCR 3 Ergebnisse Zusammenfassung

4 1 Aufgabenstellung Auf Grundlage des gemeinsamen Erlasses des Thüringer Ministeriums für Soziales, Familie und Gesundheit (TMSFG) jetzt Thüringer Ministerium für Migration, Justiz und Verbraucherschutz (TMASGFF) - und des Thüringer Ministeriums für Landwirtschaft, Forsten, Umwelt und Naturschutz (TMLFUN) jetzt Thüringer Ministerium für Infrastruktur und Landwirtschaft (TMIL) - vom 28. Januar 2003, zuletzt geändert am , sollten im Auftrag des Thüringer Landesverwaltungsamtes (TLVwA) 35 Maissaatgutproben mit ausländischem Erzeugerland von der Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft (TLL) gezogen und auf Verunreinigungen mit gentechnisch-veränderten Organismen (GVO) im I. Quartal 2016 untersucht werden. 2 Material und Methoden Die molekularbiologische Diagnostik basierte auf der Subsamplingmethode der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 28b GenTG zum Nachweis von gentechnischen Veränderungen in Saatgut (G , 2012). 2.1 Anzahl und Menge der Proben Die Probenahme erfolgte durch Mitarbeiter des Außendienstes der TLL unter Anleitung des Referates Saatgut nach den dafür geltenden Vorschriften im Zeitraum vom Beprobt wurden Saatguthändler und landwirtschaftliche Betriebe laut Empfehlung der Bund/Länderarbeitsgemeinschaft Gentechnik (LAG) unter besonderer Berücksichtigung von zertifiziertem Importsaatgut (Drittstaaten und EU-Mitgliedstaaten). Es wurden insgesamt 35 Proben geprüft. Für jede Probe existiert eine amtlich verschlossene Rückstellprobe, die im Referat Saatgut hinterlegt ist. Alle Proben gelangten trocken, amtlich verschlossen und gut beschriftet in das Gendiagnostiklabor der TLL. Da für Saatgut noch kein Schwellenwert für GVO-Verunreinigungen festgelegt wurde, besteht Nulltoleranz. Für die sichere Detektion eines GVO-Samens ist nach statistischer Berechnung eine Probenmenge von rund Samen (mindestens Samen) erforderlich, um die Hypothese, dass kein GVO-Samenkorn vorhanden ist, mit 95 %iger Sicherheit zu widerlegen. Das entspricht bei Mais unter Zugrundelegung des durchschnittlichen Tausendkorngewichtes ca. 1 bis 1,3 kg. Unter Berücksichtigung einer technisch realisierbaren Erfassungsgrenze von 0,1 % wurden die Proben in drei Teilproben von jeweils Samen unterteilt (Subsampling). 2.2 Probenaufbereitung Die Maisproben wurden in jeweils drei Teilproben mit je Samen mittels Körnerzählgerät unterteilt und jede Teilprobe getrennt vermahlen, homogenisiert und analysiert. Zum Mahlen der Samen diente die Küchenmaschine TM 21 der Firma Vorwerk. 2.3 DNA-Extraktion Zur DNA-Extraktion wurden jeweils 3 g Maismehl jeder Teilprobe eingesetzt und mit 10 ml PL1- Lysepuffer aus dem Invisorb Spin Plant Mini Kit (Fa. Stratec) versetzt. Nach 30 minütiger Inkubation bei 65 C im Schüttelwasserbad und anschließender Zentrifugation (10 min bei Maximum) wurde ein Aliquot von 400 µl des Überstandes entsprechend des Kit-Protokolls weiterbehandelt. Zur Kontrolle der Reinheit der Extraktion mittels nachfolgender real-time PCR sind jeweils zwei Kontrollen ohne Probenmaterial angelegt worden (Extraktionskontrolle). Die durchschnittliche DNA-Ausbeute wurde mit dem NanoDrop ermittelt. Proben mit DNA- Gehalten deutlich über 40 ng/µl wurden auf etwa diesen Gehalt verdünnt, um mögliche Inhibitionen während der PCR zu verhindern. 2.4 Untersuchung der gentechnischen Veränderung mittels real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) Der Nachweis einer gentechnischen Veränderung erfolgte anhand eines Screenings nach dem 35S-Promotor (p35s-camv) und dem NOS-Terminator (T-nos) mittels Real-Time PCR im Duplexansatz (ASU L , 2008). Es gelangte der GoTaq Probe qpcr Master Mix der Firma Promega zum Einsatz. Anhand dieses Screenings können außer LY038 und DAS alle der gegenwärtig weltweit bekannten und methodisch analysierbaren GVO-Maislinien erfasst werden. Für die eventspezifischen Nachweise von DAS (EURL, 2012) und LY038 4

5 (EURL, 2008) wurden die vom EURL veröffentlichten Methoden genutzt. Als negative Vergleichskontrolle diente nicht gentechnisch veränderter konventioneller Mais, als Positivkontrolle für das GVO-Screening MON683 0,38 % sowie für die eventspezifischen Nachweise DAS % des IRMM (ERM BF433d) und ein Kontroll-Plasmid LY cp/µl (pengl-00-01/06-01, EURL). Die Kontrolle der Amplifizierbarkeit der extrahierten DNA basierte auf der Vervielfältigung des maisspezifischen hmg-gens (EURL, 2008) bzw. einer konservierten Chloroplasten-Leu-tRNA- Sequenz (Methodensammlung der LAG). Zum Ausschluss einer möglichen Kontamination während des PCR-Ansatzes existierte jeweils eine Wasserkontrolle. Alle Probenextrakte und Kontrollen unterlagen einer PCR-Doppelanalyse. Der PCR-Lauf war auswertbar, wenn die Negativkontrollen (unbehandelter Mais, Extraktionsund Wasserkontrolle) kein Signal zeigten und die Positivkontrollen zu einem deutlichen Signal der erwarteten Größenordnung führten. 3 Ergebnisse Um Doppeluntersuchungen in den Ländern zu vermeiden und bei positiver Testung unverzüglich benachrichtigen und handeln zu können, wurden die Ergebnisse aus den einzelnen Probeneingängen kontinuierlich an die Verantwortlichen mitgeteilt. Der Eintrag der Ergebnisse erfolgte in die Saatgut-Datenbank am Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) und ist für alle registrierten Nutzer einsehbar. Die Untersuchungen waren am 17. März 2016 beendet. Tabelle: Ergebnisse der Maissaatgutuntersuchung für Thüringen 2016 Lfd Nr. Probenehmer SVK-Nr. Sorte Anerkennungs-Nr. Erzeugerland GVO 1 TH 06/28/15 BEJM-Hybrid H-1-180/ Ungarn n.d. 2 TH 06/29/15 PRALINIA-hybrid Ungarn n.d. 3 TH 06/30/15 DKC 3333 F0076R1293ME Y Frankreich n.d. 4 TH 06/31/15 SY Feeditop Hibrid H /0540 Frankreich n.d. 5 TH 14/28/15 SY Werena F0389R Frankreich n.d. 6 TH 14/29/15 SCHOBBI CS F164R5N9827 Frankreich n.d. 7 TH 14/30/15 NK Falkone H /1235 Ungarn n.d. 8 TH 06/32/15 KWS STABIL F0841R Frankreich n.d. 9 TH27/16/15 LG30222 F0964R025151RI Frankreich n.d. 10 TH27/17/15 LG30224 F0964R026998NZ Frankreich n.d. 11 TH27/18/15 LG3216 F0964R03235TNZ Frankreich n.d. 12 TH07/28/15 Futurixx F0111R Frankreich n.d. 13 TH07/29/15 Indexx F0111R Frankreich n.d. 14 TH07/30/15 ES Metronom F0440R Frankreich n.d. 15 TH06/33/15 SCHOBBI CS F0252R4T0484 Frankreich n.d. 5

6 Lfd Nr. Probenehmer SVK-Nr. Sorte Anerkennungs-Nr. Erzeugerland GVO 16 TH06/34/15 SY WERENA H /0956 Ungarn n.d. 17 TH14/31/15 AMAVERDE F0298R Frankreich n.d. 18 TH14/32/15 KWINNS F5552R Frankreich n.d. 19 TH14/33/15 OSTERBI CS F0252R5P0674 Frankreich n.d. 20 TH25/29/15 SY GIBUTI F0424R276452S Frankreich n.d. 21 TH25/30/15 SY CAMPONA F0164R Frankreich n.d. 22 TH11/31/15 RICARDINIO F1551R Frankreich n.d. 23 TH11/32/15 FABREGAS Hyb. 3voies F0841R Frankreich n.d. 24 TH11/34/15 MAXIM XL A5P Österreich n.d. 25 TH11/35/15 SY Comandor F0424R242870S Frankreich n.d. 26 TH11/36/15 LG F 0964R025728NZ Frankreich n.d. 27 TH25/31/15 Saludo F0111R Frankreich n.d. 28 TH25/32/15 Colisee hibrid 5BR39715BR04 Rumänien n.d. 29 TH25/33/15 SYWerena F0389R Frankreich n.d. 30 TH25/34/15 XXIRA F0111R Frankreich n.d. 31 TH06/36/15 AMANATIDIS F0491R Frankreich n.d. 32 TH06/37/15 ES PROGRESS F0440R187781C Frankreich n.d. 33 TH11/37/15 SY Unitop H /0094 Frankreich n.d. 34 TH11/38/15 P 8609 A Österreich n.d. 35 TH11/39/15 SY Talisman F0389R Frankreich n.d. n.d... not detected In keiner der untersuchten Teilproben konnte eine gentechnische Veränderung nachgewiesen werden. 4 Zusammenfassung Im Rahmen der amtlichen Kontrolle wurden im Frühjahr 2016 im Zeitraum vom (Beginn der Probenahme) bis (letztes Untersuchungsergebnis) in Verantwortung der Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft 35 Maissaatgutproben unterschiedlicher Sorten aus dem Saatguthandel auf GVO-Verunreinigungen untersucht. Die gendiagnostische Kontrolle des Saatguts basierte auf dem Handlungsleitfaden der Bund/Länderarbeitsgemeinschaft Gentechnik (LAG) zur Harmonisierten experimentellen Saatgutüberwachung auf GVO-Anteile sowie auf dem Vorschlag der LAG für ein bundeseinheitliches Vorgehen. In keiner Probe konnte eine gentechnische Veränderung nachgewiesen werden. 6

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