Medizin, Springer Spektrum, Springer Vieweg und Springer Psychologie.

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3 Essentials liefern aktuelles Wissen in konzentrierter Form. Die Essenz dessen, worauf es als State-of-the-Art in der gegenwärtigen Fachdiskussion oder in der Praxis ankommt. Essentials informieren schnell, unkompliziert und verständlich. als Einführung in ein aktuelles Thema aus Ihrem Fachgebiet als Einstieg in ein für Sie noch unbekanntes Themenfeld als Einblick, um zum Thema mitreden zu können. Die Bücher in elektronischer und gedruckter Form bringen das Expertenwissen von Springer-Fachautoren kompakt zur Darstellung. Sie sind besonders für die Nutzung als ebook auf Tablet-PCs, ebook-readern und Smartphones geeignet. Essentials: Wissensbausteine aus Wirtschaft und Gesellschaft, Medizin, Psychologie und Gesundheitsberufen, Technik und Naturwissenschaften. Von renommierten Autoren der Verlagsmarken Springer Gabler, Springer VS, Springer Medizin, Springer Spektrum, Springer Vieweg und Springer Psychologie.

4 Oksana Ableitner Einführung in die Molekularbiologie Basiswissen für das Arbeiten im Labor

5 Oksana Ableitner Graz Österreich ISSN essentials ISBN DOI / ISSN (electronic) ISBN (e-book) Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Springer Spektrum Springer Fachmedien Wiesbaden 2014 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Der Verlag, die Autoren und die Herausgeber gehen davon aus, dass die Angaben und Informationen in diesem Werk zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vollständig und korrekt sind. Weder der Verlag noch die Autoren oder die Herausgeber übernehmen, ausdrücklich oder implizit, Gewähr für den Inhalt des Werkes, etwaige Fehler oder Äußerungen. Alle Fotos vom Autor. Alle Grafiken von Natascha Eibl. Gedruckt auf säurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier Springer Fachmedien Wiesbaden ist Teil der Fachverlagsgruppe Springer Science+Business Media (

6 Vorwort Viele Menschen verbinden mit den Begriffen Biochemie und Molekularbiologie einen unverständlichen und sehr komplizierten Wissensbereich. Auch ich hatte Schwierigkeiten. Nach einer missglückten Prüfung in Biochemie hatte ich ein Minimum an Zeit, um mich für die Wiederholungsprüfung vorzubereiten. Das Internet gab mir viel zu viele Informationen; es war mir keine Hilfe im Verstehen der Grundlagen der Biochemie. Ich habe daher für mich selbst eine Methode entwickelt, um mir die kompliziertesten Formeln und chemischen Gleichungen zu merken. Um die Grundlagen der Biochemie zu verstehen, braucht man viele Bilder, die dazu dienen, abstraktes Wissen zu visualisieren. Um mit Erfolg lernen zu können, war es daher auch für mich wichtig, viel zu zeichnen und zu schreiben. Während meiner Lehrtätigkeit konnte ich meine Erkenntnisse meinen Schülern erfolgreich weitergeben. Jedes Fach wird interessant, wenn man die Grundlagen in allen Einzelheiten versteht. Dann hat man die Möglichkeit, darauf aufzubauen, und plötzlich ist man von Biochemie begeistert. Dieses Buch soll nicht nur eine Hilfe für Schüler und Studenten sein, sondern auch für alle, die sich für das Arbeiten im Molekularbiologielabor interessieren. Die Bedeutung der Molekularbiologie in unserer Zeit nimmt zu. Immer mehr molekularbiologische Labors werden gegründet, um klinische Proben mit molekularbiologischen Methoden zu untersuchen. Analysemethoden der Molekularbiologie sind sensitiv, spezifisch und schnell. Sie werden in unterschiedlichen Bereichen eingesetzt. Einige seien hier angeführt: Ermittlung der Vaterschaft Feststellung der Neigung zu bestimmten Krankheiten Bestimmung von genetisch übertragbaren Krankheiten V

7 VI Vorwort Identifizierung von Krankheitserregern (z. B. Bakterien oder Viren) Ausbruchsabklärung Feststellung der Mutationen in bestimmten Genen (Ursache für eine Krankheit) Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Genes In diesem Buch werden zuerst die grundlegenden Begriffe erklärt, die man für das Verständnis der danach folgenden molekularbiologischen Methoden benötigt. Zum Schluss wird das Wichtigste noch einmal in Stichwörtern zusammengefasst, um den Lehrstoff besser wiederholen zu können. Um bestimmte Begriffe nachzuschlagen, dient das Glossar am Ende des Buches. Neben molekularbiologischen Begriffen sollen Strukturen und Zusammenhänge Schritt für Schritt einfach erklärt und durch Illustrationen verständlich gemacht werden. Das Ziel dieses Buches ist es, den bestehenden Wissensstand möglichst verständlich zu erläutern und Leser verschiedener Altersgruppen für die Molekularbiologie zu begeistern. Oksana Ableitner

8 Inhaltsverzeichnis 1 Grundlegende Begriffe der Molekularbiologie Nukleinsäuren Träger des Erbgutmaterials Bausteine der Nukleinsäuren Räumliche Struktur der Nukleinsäuren Zusammenfassung des Kapitels Molekularbiologische Methoden Polymerasekettenreaktion (PCR) Methode zur Vervielfältigung von DNA-Fragmenten PCR-Reagenzien Vorbereitung und Durchführung einer PCR Gelelektrophorese Real-time Polymerasekettenreaktion Real-time PCR mit einer TaqMan -Sonde (TaqMan -PCR) Real-time PCR mit Hybridisierungs-Sonden. (Hybridisierungs-PCR) Vergleich zwischen TaqMan -PCR und Hybridisierungs-PCR Sequenzierung Microarray-Technologie PFGE VII

9 VIII Inhaltsverzeichnis 3 Chemisches Rechnen im Labor Stoffmenge Herstellung der Lösungen: Verdünnung Zusammenhänge zwischen Masse (m), Molmasse (M), Stoffmenge (n) und Volumen (V) Molbio in Stichworten Glossar Literatur

10 Grundlegende Begriffe der 1 Molekularbiologie 1.1 Nukleinsäuren Träger des Erbgutmaterials In einem molekularbiologischen Labor untersucht man mittels unterschiedlicher Methoden das Erbgutmaterial verschiedenster Lebewesen. Für die molekularbiologischen Methoden wurden spezielle Geräte und Werkzeuge entwickelt, die das Arbeiten mit sehr kleinen Flüssigkeitsvolumen (1 µl = 0, L) erlauben. Um sich so kleine Volumina vorzustellen, genügt es einen Wassertropfen zu betrachten, der zwischen 25 und 50 µl Wasser enthält. Die gesamte Information aller Merkmale eines Lebewesens ist in einer sehr langen Kette aus verschiedenen Molekülen festgelegt. Auf dieser Kette befinden sich viele unterschiedlich lange Abschnitte, die für bestimmte Eigenschaften eines Lebewesens verantwortlich sind. Jeder Abschnitt repräsentiert jeweils ein Gen und ist nur für ein Merkmal verantwortlich. In Abb. 1.1 ist der Baukasten des Lebens dargestellt. Von unten nach oben gelesen, bilden drei verschiedene Moleküle jeweils ein Nukleotid, das man als Baustein des Lebens bezeichnen kann. Die Nukleotide verbinden sich zu einer Kette. Ein bestimmter Abschnitt dieser Kette, z. B Nukleotide lang, ist ein Gen. Viele Gene bilden eine sehr lange Kette, die Nukleinsäure genannt wird. Die Nukleinsäure enthält den genetischen Code eines Lebewesens. Alle erwähnte Begriffe werden in den folgenden Kapiteln genauer erklärt. Es gibt zwei Arten von Nukleinsäuren: 1. Des-oxy-ribo-nuklein-säure (DNS), eng. DNA (das A bei DNA steht für acid ). 2. Ribo-nuklein-säure (RNS), eng. RNA (das A bei RNA steht für acid ). Springer Fachmedien Wiesbaden 2014 O. Ableitner, Einführung in die Molekularbiologie, essentials, DOI / _1 1

11 2 1 Grundlegende Begriffe der Molekularbiologie Abb. 1.1 Baukasten des Lebens. Struktureinheiten des genetischen Codes Nukleinsäure (genetischer Code) viele Gene Gen Ein Abschnitt aus vielen Nukleotiden Nukleotid Phosphat + Zucker + Stickstoffbase Auf die Unterschiede zwischen diesen beiden Nukleinsäuren wird in weiteren Kapiteln näher eingegangen. Die Beispiele der Lebewesen mit den beiden Nukleinsäurearten sind in Tab. 1.1 aufgeführt. Die früheste Entdeckung der Nukleinsäuren wurde in den Kernen der menschlichen Leukozyten (weiße Blutkörperchen) gemacht. Daher tragen sie in der Bezeichnung das Wort Nuklein (lat. nucleus = Kern). Säuren heißen sie, weil die Bausteine der Kette, die Nukleotide, Säuren sind. In den meisten Lebewesen liegt die DNA in Form von zwei Ketten, doppelsträngig, vor. Das bedeutet, dass zwei Einzelstränge (Ketten) durch kleine Brücken, Wasserstoffbindungen, zusammengehalten werden. Die RNA dagegen existiert in der Regel in Form eines Einzelstranges. 1.2 Bausteine der Nukleinsäuren Die Struktureinheit der Nukleinsäure, das Nukleotid, besteht aus drei verschiedenen Komponenten. Das sind: ein Phosphat, ein Zucker und eine Stickstoffbase (Base) (Abb. 1.2). Tab. 1.1 Vorkommen der DNA und RNA in den Lebewesen Lebewesen Beispiel Träger der Erbinformation Viren Hepatitis-B-Virus DNA oder RNA (DNA)Tollwut-Virus (RNA) Länge der DNAbzw. RNA-Kette ca. 1 µm = 0, m Bakterien Salmonella Zirkuläre DNA ca. 1 mm = 0,001 m Eukaryoten Mensch Chromosomale ca. 1 m (Zellkernhaltige) DNAim Zellkern

12 1.2 Bausteine der Nukleinsäuren 3 Abb. 1.2 Schematische Darstellung der Komponenten eines Nukleotids Die erste Komponente des Nukleotids ist das Phosphat. Aufgrund der Eigenschaften des Phosphates besitzt die DNA eine negative Ladung. Diese Eigenschaft der DNA wird für die analytischen Methoden, z. B. für die Gelelektrophorese, genutzt. Um die Entstehung dieser negativen Ladung verstehen zu können, betrachtet man zuerst das Molekül der Phosphorsäure (Abb. 1.3). Aufgrund der Wechselwirkungen mit Wasser, befindet sich die Phosphorsäure in der wässrigen Lösung, ebenso wie die Nukleinsäure, in einem Gleichgewicht zwischen einem neutralen Molekül der Säure und einem negativ geladenem Phosphat-Anion. In Abb sind diese beiden Übergangsformen (Säuremolekül und Phosphat-Anion) der Phosphorsäure abgebildet. In dem Phosphat-Anion entsteht eine negative Ladung durch Verlust von Wasserstoffatomen (H) bei drei Sauerstoffatomen (O). Die zweite Komponente des Nukleotids ist Zucker. In den Nukleotiden können zwei Zuckerarten vorkommen: Ribose (in der RNA) und Desoxyribose (in der DNA). Den Unterschied zwischen diesen zwei Molekülen kann man in Abb. 1.4 erkennen. Bei der Desoxyribose fehlt ein Sauerstoffatom O bei dem zweiten Kohlenstoffatom C ( desoxy bedeutet ohne einen Sauerstoff). Man nummeriert die Atome im Fünfeck der Ribose im Uhrzeigersinn, ab dem ersten rechten Kohlenstoffatom. Die Kohlenstoffatome im Fünfeck der Zucker bezeichnet man mit einer Zahl und einem Hochstrich. Abb. 1.3 Übergangsformen der Phosphorsäure

13 4 1 Grundlegende Begriffe der Molekularbiologie a b Abb. 1.4 Strukturformeln von Ribose (a) und Desoxyribose (b) Abb. 1.5 Strukturformeln von Stickstoffbasen Die dritte Komponente des Nukleotids ist eine Stickstoffbase, die aus einem oder zwei Kohlenstoffringen bestehen kann. Es gibt fünf Arten von Stickstoffbasen, die in den Nukleinsäuren vorkommen: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G), Cytosin (C) und Uracil (U). Die Strukturformeln dieser fünf Basenarten zeigt Abb Die ersten vier Stickstoffbasen