Amyloid fibrils seen by solid-state NMR structure, dynamics, interactions

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1 DISS. ETH NO Amyloid fibrils seen by solid-state NMR structure, dynamics, interactions A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by JULIA GATH Diplom-Chemikerin Julius-Maximilians-Universität Würzburg born April 27, 1984 citizen of Germany accepted on the recommendation of Prof. Dr. Beat H. Meier, examiner Prof. Dr. Roland Riek, co-examiner Dr. Anja Böckmann, co-examiner 2013

2 Abstract Protein aggregation into amyloid fibrils historically is associated with neurodegenerative diseases, such as Alzheimer s disease and Parkinson s disease. Recent findings suggest that amyloid fibrils also might have biological functions, such as human skin pigmentation or movement and attachment in bacteria. Amyloid fibrils are highly ordered protein aggregates, but do not form crystals and are insoluble due to their high-molecular weight. Thus, they cannot be studied by X-ray crystallography and solution-state NMR to atomic resolution, making solid-state NMR a preferential method to obtain structural and dynamic information. In the scope of this thesis, three different amyloid fibrils were studied: human α-synuclein, the human peptide hormone β-endorphin and the prion-forming domain of the fungal protein HET-s. α-synuclein is a cytosolic protein, found in presynaptic nerve terminals. Its physiological function remains yet unknown. Aggregates of α-synuclein are found in Parkinson s disease patient s brains and are believed to be the major pathogen involved in the spread of the disease within the human brain. β-endorphin is an opioid peptide hormone that is released upon exercise, excitement and pain. It is hypothesized that it is stored in an amyloid-like conformation in secretory granules in the pituitary gland. Upon stimulus, granule secretion would be considerably faster than de novo peptide synthesis. The HET-s prion invokes a programmed cell death reaction preventing the fusion of two genetically distinct fungi, the so-called heterokaryon incompatibility. In this thesis, the prion forming domain is studied in isolation and as a model protein. However, its structure is conserved in the full-length amyloid fibril. In Chapter 2 of this thesis two polymorphs of α-synuclein amyloid fibrils, called fibrils and ribbons, were sequentially assigned. Even though obtained under almost identical fibrillization conditions, those polymorphs were shown to differ considerably in terms of toxicity and seeding capacities. Both polymorphs form in-register parallel stacked fibrils with a high β-sheet content. The extent of the ordered core region however varies between fibrils and ribbons. In the ribbons, the first 97 residues are ordered, while the core region of the fibrils extends from Leu38 to Phe94. This latter region is generally believed to form the core of α-synuclein fibrils. The last 40 residues are found to be flexible in both forms. 11

3 12 Abstract A structural model of β-endorphin in its fibrillar storage form is proposed in Chapter 3. β-endorphin fibrils exhibit the cross-β pattern typical for amyloid fibrils. Three β-strands forming parallel β-sheets along the fibrillar axis could be identified. The fibrils are stacked in-register parallel with one monomer per layer of the fibril. The triangular core is composed of a hydrophilic and a hydrophobic compartment. Interestingly, the side chain of Glu8 points towards the inside of the fibrillar core and is protonated as reflected by its chemical shifts. The exact position of the three β-sheets with respect to each other still needs to be verified. Chapter 4 describes the heterogeneous dynamics of the flexible 40 C-terminal residues of α-synuclein ribbons. For most of the molecules, the C-terminus almost behaves solution like, with long T 2 relaxation times and chemical shifts close to the known literature values for α-synuclein monomers in solution. However, in some molecules the dynamics of the C- terminal residues must be either slowed down or spatially restricted, so that some residual dipolar couplings remain. These residual dipolar couplings are strong enough to allow for CP transfer, while the T 2 relaxation times are still sufficiently long for INEPT transfer steps. The chemical shifts are averaged by the dynamics and correspond thus to the random-coil values. These findings explain, why flexible parts of proteins usually said to be invisible to solid-state NMR can be observed using dipolar transfer steps under certain circumstances. The influence of chemical exchange on polarization transfer over the water-protein interface is described theoretically in Chapter 5. Heteronuclear CP transfer and homonuclear HORROR transfer were investigated. The transfer from an exchangeable proton to another nucleus of the protein is slowed down in the presence of chemical exchange with the water bath. For long mixing times however, full polarization can be reached as the water bath is assumed to be infinitely large. The interference of the stochastic chemical-exchange process with the coherent polarization transfer can be described using a spectral-density approach. Its effect is biggest, when the exchange rate constant is in the same order of magnitude as the relevant dipolar coupling. The predicted effects could be observed experimentally on the prion-forming domain of HET-s.

4 Zusammenfassung Die Bildung von Amyloidfibrillen wird häufig mit neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer-Kranheit oder der Parkinson-Krankheit, in Verbindung gebracht. Neuere Forschungsergebnisse legen nahe, dass Amyloidfibrillen auch biologische Aufgaben, wie die Pigmentierung der menschlichen Haut oder die Fortbewegung von Bakterien und deren Anhaften auf Oberflächen, erfüllen könnten. Amyloidfibrillen sind hoch geordnete Proteinaggregate, allerdings kristallisieren sie nicht und sind aufgrund ihres grossen Molekulargewichts unlöslich. Daher lassen sie sich nicht mittels Röntgenkristallographie und Lösungs-NMR- Spektroskopie mit atomarer Auflösung untersuchen. Festkörper-NMR-Spektroskopie bietet die Möglichkeit solche strukturellen und dynamischen Informationen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden drei verschiedene Amyloidfibrillen untersucht: menschliches α-synuclein, das menschliche Peptidhormon β-endorphin und die prionenbildende Domäne des Pilzproteins HET-s. α-synuclein kommt im Cytosol der Synapsenendknöpfchen vor. Seine physiologische Bedeutung ist noch ungeklärt. α-synuclein-aggregate lagern sich in Gehirnen von Parkinson-Patienten ab. Vermutlich sind sie oder ihre Vorläufer das Hauptpathogen, das für die Ausbreitung der Krankheit im menschlichen Gehirn verantwortlich ist. β-endorphin ist ein opioides Peptidhormon, das bei Anstrengung, Aufregung und Schmerz freigesetzt wird. Es wird vermutet, dass es in einer amyloidähnlichen Konformation in Sekretionsgranula in der Hypophyse gelagert wird. Bei Auftreten eines Stimulus wäre die Freisetzung des Hormons durch Exocytose der Granula deutlich schneller als die Synthese des Peptids. Das HET-s-Prion führt einen programmierten Zelltod herbei, der das Mischen zweier genetisch unterschiedlicher Fadenpilze verhindert. Diese Reaktion wird Heterokaryon-Inkompatibilität genannt. In dieser Arbeit dient die prionenbildende Domäme als Modellprotein und wird als Fragment des Volllängenproteins untersucht. Die Struktur der prionenbildenden Domäne ist im Fragment und der vollständigen Amyloidfibrille identisch. In Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit, wird die Zuordnung der Resonanzfrequenzen zu den Atomen zweier α-synuclein-polymorphe, ribbons und fibrils, beschrieben. Obwohl beide Polymorphe unter fast identischen Fibrillisierungsbedigungen erhalten wurden, unterscheiden 13

5 14 Zusammenfassung sie sich in ihrer Toxizität gegenüber Zellen und ihrer Fähigkeit als Keim eine Fribrillisierung zu initiieren. Beide Fibrillen bilden in-register angeordnete Fibrillen mit einem hohen Anteil an parallelen β-faltblättern. Die Länge der geordneten Kernregion der Fibrille variiert stark zwischen ribbons und fibrils. Die ersten 97 Aminosäuren sind in den ribbons geordnet, während der Amyloidkern der fibrils nur von Leu38 bis Phe94 reicht. Der zweite Bereich wird gemeinhin als Kern der α-synuclein-fibrillen betrachtet. Die letzten 40 Aminosäuren sind in beiden Formen flexibel. Ein Strukturmodell für die fibrilläre Aufbewahrungsform von β-endorphin wird in Kapitel 3 vorgeschlagen. β-endorphin weisst die typische Kreuz-β-struktur von Amyloidfibrillen auf. In der Fibrille sind die β-endorphin-monomere in-register gestapelt, wobei ein Monomer eine Lage der Fibrille bildet. Drei parallele β-faltblätter entstehen so entlang der Fibrillenachse. Der dreieckige Kern besteht aus einem hydrophilen und einem hydrophoben Teil. Interessanterweise zeigt die Seitenkette von Glu8 in der Kern hinein und ist protoniert, was sich aus ihrer niedrigen chemischen Verschiebung ableiten lässt. Die genaue Position der β-faltblätter relativ zu einander muss noch bestätigt werden. Kapitel 4 beschrebt die heterogene Dynamik der 40 C-terminalen Aminosäuren in α-synuclein ribbons. In den meisten Molekülen verhält sich der C-Terminus in der Fibrille fast so wie der C-terminus in α-synuclein-monomeren in Lösung. Die T 2 -Relaxationszeiten sind lang und die chemischen Verschiebungen liegen nahe an den bekannten Werte für gelöste α-synuclein-monomere. In einigen Molekülen muss die Dynamik jedoch verlangsamt oder räumlich eingeschränkt sein, so dass die Dipolkopplung nicht vollständig ausgemittelt wird. Die verbleibenden Dipolkopplungen sind immer noch stark genug um Kreuzpolarisierung zu ermöglichen und die T 2 -Relaxationszeiten gleichzeitg lang genug für INEPT-Transferschritte. Die chemischen Verschiebungen werden durch die Dynamik zu den Random-Coil-Werten gemittelt. Diese Ergebnisse erklären, warum es in gewissen Fällen möglich ist, flexible Teile von Proteinen auch in Festkörper-NMR-Spektren zu beobachten. Der Einfluss von chemischem Austausch auf Polarisationstransfer über Wasser-Protein- Grenzflächen wird in Kapitel 5 behandelt. Heteronukleare Kreuzpolarisierung und homonuclearer HORROR-Transfer wurden untersucht. Der Transfer von einem austauschenden Proton zu einem der anderen Proteinkerne wird durch den chemischen Austausch mit dem umgebenden Wasser verlangsamt. Für lange Mischzeiten lässt sich jedoch volle Polarisation auf dem Protein erreichen, da das Wasserbad als unendlich gross angenommen wird. Die Wechselwirkung zwischen dem stochastischen chemischen Austausch und dem kohärenten Polarisationstransfer kann mit Hilfe einer spektralen Dichtefunktion beschrieben werden. Der

6 Zusammenfassung 15 Effekt ist dann am stärksten, wenn die Austauschratenkonstante und die relevante Dipolkopplung in der gleichen Grössenordnung liegen. Die vorhergesagten Effekte konnten auf der prionenbildenden Domäne von HET-s experimentell beobachtet werden.