Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf die Freisetzung. von Monomeren aus dentalen Kompositen

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1 Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund-, und Kieferheilkunde der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Abteilung für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf die Freisetzung von Monomeren aus dentalen Kompositen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2011 von Catherine Huberty geboren in Luxemburg

2 Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. E. Hellwig 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. R. Schmelzeisen Jahr der Promotion: 2011

3 Meinen lieben Eltern in Dankbarkeit gewidmet

4 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT KOMPOSITE Zusammensetzung Organische Matrix Disperse Phase Verbundphase Einteilung der Komposite Makrofüller-Komposite Mikrofüller-Komposite Hybridkomposite Kompomere Flowkomposite Ormocere Silorane Polymerisation von Kompositmaterialien Freisetzung von Restmonomeren Degradation von Restmonomeren TOXIZITÄT Symptome und Beschwerden Allergien Metabolisierung von Monomeren Zytotoxizität von Monomeren Mutagenität von Monomeren Einfluss von Monomeren auf die Pulpa Östrogenität von Monomeren STAND DER FORSCHUNG ANALYTISCHE METHODEN ZUR MONOMERQUANTIFIZIERUNG... 21

5 HPLC Massenspektrometrie ZIEL DER STUDIE MATERIAL UND METHODE MATERIAL Komposite Ceram X TM (Dentsply DeTrey GmbH Deutschland) Filtek TM Supreme XT (3M ESPE Dental Products, Seefeld, Deutschland) Elutionsmittel Ethanol Aceton Natriumchlorid Speichel Zusätzliche Materialien Monomere für die Herstellung der Standards Polymerisationslampe METHODE Herstellung der Proben Herstellung der Kalibrierlösungen Extraktionsbedingungen Analytische Methode HPLC Massenspektrometrie Statistische Auswertung ERGEBNISSE DISKUSSION DISKUSSION DER MATERIALIEN Komposite Elutionsmittel DISKUSSION DER METHODE... 43

6 Herstellung der Proben Analytik DISKUSSION DER ERGEBNISSE Schlussfolgerung ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG LEBENSLAUF... 74

7 1. Einleitung In den letzten Jahren ist die Anfrage nach ästhetischen, zahnfarbenen Restaurationen in der Zahnarztpraxis stetig gewachsen. Durch ihre guten mechanischen Eigenschaften, ihre hohe ästhetische Qualität, ihre Dentinhaftung und ihre einfache Handhabbarkeit haben sich Kompositmaterialien zunehmend etabliert. Die von Bowen 1962 eingeführten Komposite verdrängen Amalgam immer mehr aus der restaurativen Zahnmedizin und stellen eine preiswerte Alternative zu Keramikversorgungen dar. Doch neben Kriterien der Verarbeitung ist auch die Gewebeverträglichkeit für den klinischen Erfolg eines zahnärztlichen Materials bedeutsam. In den letzten Jahren wurde die Biokompatibilität von Kompositmaterialien sehr intensiv untersucht (Schedle et al., 2003; Finer & Santerre, 2004; Wada et al., 2004; Nalcaci et al., 2006; Sideridou et al., 2005; Brackett et al., 2007; Moharamzadeh et al., 2007). Diese Studien deuten darauf hin, dass verschiedene Inhaltsstoffe der kunststoffhaltigen Materialien wie z. B. Restmonomere oder Additiva an das orale Umfeld abgegeben werden können. Außerdem gibt es Berichte über einen möglichen zytotoxischen, mutagenen oder östrogenen Effekt einiger Monomere. Daten zur potentiellen Mutagenität der Materialien liegen allerdings in der zugänglichen Literatur kaum vor (Schmalz, 1985; Geurtsen, 1987; Schmalz, 1995). Obwohl in den letzten Jahren viele Studien über die Freisetzung von Monomeren aus Kompositen durchgeführt wurden, sind Elutionsmittel und ihr Einfluss auf die Freisetzung bisher nicht untersucht worden. Manche Autoren haben 75-prozentiges Ethanol verwendet (Rogalewicz et al., 2006; Polydorou et al., 2007), andere benutzten Wasser oder Speichel (Spahl et al., 1998; Moharamzadeh et al., 2007). Systematische Untersuchungen der Freisetzung von Monomeren aus Kompositen in Abhängigkeit von Elutionsmittel fehlen aber bisher. Dies ist jedoch notwendig, um klinisch relevante Ergebnisse zu erhalten und die unterschiedlichen Studien vergleichen zu können. Ziel der vorliegenden in-vitro Studie ist es den Einfluss vier verschiedener Lösungsmittel auf die Freisetzung von Restmonomeren aus Kompositen zu untersuchen. 1

8 2. Literaturübersicht 2.1. Komposite Komposite sind Kunststoffe die hauptsächlich als Füllungsmaterialien im Front- und Seitenzahngebiet verwendet werden. Sie können aber auch in ähnlicher Zusammensetzung als Fissurenversiegler, Befestigungskomposit für Keramik- und Komposit-Inlays oder als Stumpfaufbautenmaterial unter Kronen eingesetzt werden. Darüber hinaus finden sie neuerdings Anwendung als Wurzelkanalsealer. Außerdem werden diese Werkstoffe für provisorische Kronen bzw. Brücken von der Industrie angeboten Zusammensetzung Moderne zahnärztliche Komposite bestehen aus drei Hauptbestandteilen. Diese werden in folgenden Gruppen zusammengefasst: die organische Matrix, die disperse Phase aus anorganischen Mikro- und Makrofüllern und die Verbundphase aus Silanen und Kopolymeren Organische Matrix Die organische Matrix besteht aus hochmolekularen langkettigen Monomeren, wobei sich die Struktur der Monomere hauptsächlich von der Methacrylsäure ableitet. Durch Verbindung der Moleküle entstehen Polymere. Überwiegend werden Bisphenol A-Glycidylmethacrylat (BisGMA, Bis-4(2-hydroxy-3- methacryloxypropyloxy)-phenyl-propan) und Urethandimethacrylat (UDMA) verwendet (Ruyter, 1985; Peutzfeldt, 1997). Andere gebräuchliche Monomere sind BisEDMA (modifizierte BisGMA) oder EGDMA (Ethylenglycoldimethacrylat) (Janda, 1988). Den Matrixmonomeren BisGMA und UDMA werden wegen ihrer hohen Viskosität niedrigmolekulare Verdünner (Comonomere) zugesetzt. Komposite lassen sich so besser verarbeiten und die Mengen an zuführbaren Füllstoffen kann erhöht werden. Das Mengenverhältnis von Matrixmonomer und Comonomer bestimmt wesentlich die 2

9 chemischen und physikalischen Eigenschaften des Komposites (Schmalz und Arenholt-Binslev, 1998). Wird der Verdünner im Überschuss zugegeben, führt dies zu sehr flüssigen Kompositen und in der Folge davon zu geringeren Raten der Monomer-Polymer-Konversion, starker Polymerisationsschrumpfung sowie Randspaltbildung (Brauer et al., 1981; Rueggeberg und Tamareselvy, 1995). Man verwendet als Comonomere Methacrylate oder Dimethacrylate. Der am häufigsten verwendete Verdünner ist Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA), die anderen Comonomere werden meist nur bei speziellen Anwendungen eingesetzt (Bowen, 1979; Peutzfeldt, 1997). TEGDMA spielt eine besondere Rolle, da diese Substanz die Viskosität des Werkstoffes deutlich verringert, wodurch wiederum der Füllergehalt erhöht werden kann. Hinzu kommen noch verschiedene Additiva wie Fotoinitiatoren (z.b. Campherchinon), Koinitiatoren (z.b. DMABEE, DEAEMA), Inhibitoren (z.b. BHT), UV-Absorber, Fotostabilisatoren und Pigmente. Die Initiatoren zerfallen durch Lichtaktivierung oder durch einen chemischen Aktivator zu Radikalen. Diese Radikale reagieren dann mit den Doppelbindungen der Monomere, was zur Ausbildung von Polymerketten führt (Kullmann, 1990; Hellwig et al. 1999). Stabilisatoren vermeiden eine vorzeitige Polymerisation der Komposite (Hellwig et al. 1999) und verlängern so die Polymerisationszeit zugunsten der Verarbeitungszeit. Verwendete Stabilisatoren sind Hydrochinon, Hydrochinon-Monomethylether sowie verschiedene Phenole, die sich als wirksam und farbstabil erwiesen haben. Anorganische Pigmente werden in kleinen Mengen hinzugefügt, damit die Farbe des Komposites zur Zahnhartsubstanz passt. Als Additiva fungieren Hilfsstoffe wie optische Aufheller und Lichtschutzmittel Disperse Phase Die organische Matrix ist niedrig viskös. Um die physikalischen und mechanischen Eigenschaften der Kunststoffmatrix zu verbessern, werden ihr anorganische Füller zugesetzt. Diese anorganischen Füller bilden die sogenannte disperse Phase. Die früheren Komposite enthielten E-Glas-Fasern, SiO 2 -Glaspartikel, Natriumcarbonat oder Calciumphosphat (Soderholm, 1993). Später wurde Quarz das Material der Wahl, bedingt durch den mit BisGMA vergleichbaren Brechungsindex. 3

10 Die anorganischen Füller bestehen heute hauptsächlich aus fein gemahlenem Quarz, Borosilikat, Lithium-Aluminium-Silikat-Gläsern und aus hochdispersem, amorphem Siliziumdioxid. Sie werden eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften der organischen Matrix zu verbessern. Schon 1953 wies Pfaffenberger auf die Verbesserung der Dimensionsstabilität bei Kunststoffen durch die Verwendung von Füllstoffen mit niedrigem thermischen Ausdehnungskoeffizienten hin. So werden die Polymerisationsschrumpfung (Janda, 1988), der thermische Expansionskoeffizient (Hashinger und Fairhurst, 1984) und die Wasseraufnahme (Roulet, 1982) durch die Füllerpartikel verringert. Druck-, Zugfestigkeit, Elastizitätsmodul und Verschleißfestigkeit werden gesteigert (Kollmansperger und Venz, 1980). Die Radioopazität wird durch den Zusatz spezifischer Gläser, die z.b. Barium, Strontium oder Zink enthalten, erreicht (Yamada et al., 1990; Oysaed und Ruyter, 1986; Söderholm, 1990; Willems et al., 1993). Der Fülleranteil bei modernen zahnärztlichen Kompositen beträgt Vol.-% bzw Gew.-% (Willems, 1993). Die Größe der Füllerpartikel bei modernen Hybridkompositen variiert von 0,04 µm (Mikrofüller) bis zu 8-12 µm (Makrofüller). Neuerdings verwendete Nanofüller haben eine Partikelgröße bis zu 5 nm. In Hybridkompositen (Gemischen) werden meist Partikel von 0,6-1 µm eingesetzt, die mit Mikrofüllern oder Nanofüllern vermischt sind. Größe und Verteilung der Füllerpartikel bestimmen wesentlich die technischen Materialeigenschaften des Komposits. Im Allgemeinen wird durch die Erhöhung der Füllkörpergröße eines Komposits die Festigkeit und der Elastizitätsmodul erhöht während die Polierbarkeit und Ästhetik abnehmen Verbundphase Um für eine stabile Bindung zwischen den anorganischen Füllern und der Kunststoffmatrix zu sorgen, werden trifunktionelle Alkoxysilane, sogenannte Silane, verwendet. Dieser Verbund, auch Silanisierung genannt, wird durch Si-OH-Gruppen erreicht. Die ungesättigten Methacrylgruppen polymerisieren mit den Basismonomeren und den Comonomeren. Die hydrophile Oberfläche der Füllkörper wird auf diesem Weg in eine hydrophobe umgewandelt und erleichtert so die 4

11 Eingliederung in die hydrophobe Oberfläche der Kunststoffgrundsubstanz (Roulet, 1987; Söderholm et al., 1998). Die Art der verwendeten Silane ist vom verwendeten Füller abhängig Einteilung der Komposite Komposit-Kunststoffe werden üblicherweise nach Art und Größe der Füller eingeteilt: Makrofüller-Komposite Konventionelle Komposite, auch als Makrofüllerkomposite bekannt, enthalten rein anorganische Partikel aus Quarz, Glas oder Keramik. Glasfüllkörper sind mit einer Größe zwischen 5 und 10 µm in die Kunststoffmatrix eingebettet. Obwohl die verwendeten Füller gute physikalische Werte aufweisen, haben sie den Nachteil, dass sie unter Funktion im Ganzen aus der Füllung herausbrechen und so Löcher im Gefüge hinterlassen (Hellwig, 1996). Die Oberfläche wird nach der Politur schnell wieder rau. Komposite mit Makrofüllern lassen sich also nur ungenügend polieren, was die Qualität der Füllung zusätzlich verschlechtert. Gleichzeitig wird eine Plaqueablagerung begünstigt. Heute werden Makrofüllerkomposite in der Füllungstherapie nicht mehr eingesetzt (Sutalo, 1991) Mikrofüller-Komposite Bei Mikrofüllerkompositen sind flammenpyrolytisch hergestellte kleine Teilchen aus pyrogener Kieselsäure mit einer Größe zwischen 0,01 und 0,1 µm in die Kunststoffmatrix eingebettet. Die geringe Füllkörpergröße bedingt eine hohe Viskosität mikrogefüllter Komposite. Je höher der Anteil an Mikrofüllern, desto größer wird die Viskosität. Um eine ausreichende Verarbeitbarkeit zu gewähren, beschränkt sich der Fülleranteil auf 50%. Daraus wiederum resultieren eine erhöhte Polymerisationsschrumpfung, eine geringere Vickershärte und ein geringerer Elastizitätsmodul. Mikrofüller-Komposite lassen sich sehr gut polieren und behalten 5

12 ihren Oberflächenglanz (Beun, 2008). Sie sind verschleißfester als die makrogefüllten Komposite, da die Partikel deutlich kleiner und gleichmäßiger an der Oberfläche verteilt sind. Daher bieten sie wenig Retentionsfläche für füllerherauslösende Verschleißprozesse. Die Nachteile der Makrofüller-Komposite, wie zum Beispiel die schlechte Polierbarkeit und das Herausbrechen der Füllkörper, treten dadurch nicht mehr auf. Wegen der kleinen Füllkörper ist außerdem die Verarbeitung nicht optimal Hybridkomposite Will man die positiven Eigenschaften beider Kompositsysteme miteinander verbinden, so muss man die Füllkörperpartikel in einem Material kombinieren. Bei Hybridkompositen setzen sich die Füllkörper aus mehreren Einzelkomponenten zusammen: eine Vermengung der pyrogenen Kieselsäure (10-15 Gew.-% Mikrofüller) und der Gläser aus den Makrofüllern (85-90 Gew.-%) sollen optimale physikalische Eigenschaften bewirken, ohne die jeweiligen Nachteile in Kauf nehmen zu müssen(hellwig et al., 2006) Aufgrund ihrer physikalischen und mechanischen Eigenschaften sind sie, neben ihrer guten Polierbarkeit, auch geeignet große Schneidekantenaufbauten und Kaulast tragende Füllungen im Seitenzahnbereich dauerhaft zu restaurieren. Sie werden als Universalkomposite bezeichnet. (Ernst et al., 2003; Manhart, 2006). Die Hybridkomposite werden je nach Größe der durch die Mahltechnik gewonnenen Makrofüller unterschieden (Tabelle 1). Füllkörpergröße Normales Hybridkomposit bis zu 10 µm Feinpartikelhybridkomposit bis zu 5 µm Feinstpartikelhybridkomposit bis zu 3 µm Tabelle 1: Einteilung der Hybridkomposite nach Lutz (1983) In jüngster Zeit nehmen Nanofüllerkomposite eine Zwischenform zu den Hybridkompositen ein, mit Füllkörpergrößen von ca. 20 nm (20 nm = 0,02 µm; also in der 6

13 Größenordnung der Mikrofüller). Möglich wurde dies durch physikalische und chemische Veränderungen, so dass freie, nicht agglomerierte Mikrofüller, sogenannte Nanomere, in die Matrix eingebaut werden können. Durch technische Innovationen weisen diese Materialien einen höheren Füllkörpergehalt auf und somit eine geringere Polymerisationsschrumpfung. Durch eine chemische Veränderung der Mikrofüller sind diese frei in die Matrix eingebaut, was die natürliche Agglomeration verhindert. Die Größe der Füllkörper wird bei den Nanofüllern nicht mehr durch einen Mahlprozess, sondern durch einen gezielten chemischen Aufbau bestimmt. Es entstehen genau definierte Korngrößen. Nanofüllerkomposite sind viel stärker belastbar, sehr abrasionsbeständig und erfüllen hohe Ansprüche bei Ästhetik, Transparenz, Politurbeständigkeit und Handling-Eigenschaften. Sie werden als Universalkomposite im Front- und Seitenzahnbereich eingesetzt (Mitra et al., 2003) Kompomere Kompomere sind mit Polyazid-Gruppen modifizierte Komposite und werden für Restaurationen in gering belasteten Bereichen und in der Kinderzahnheilkunde empfohlen. Die aus Glasionomer- und Kompositbestandteilen zusammengesetzten Kompomere sind Hybridfüllungsmaterialien und verfügen über die Eigenschaft Fluoride freizusetzen (Friedl et al., 1995; Hotz et al., 1996). Der Fülleranteil, ein röntgenopakes, flouridhaltiges Silikatglas, reicht von 42 bis 67 Vol.-%, die durchschnittliche Füllerpartikelgröße von 0,8 5,0 µm. Die Aushärtung findet primär durch lichtaktivierte Polymerisation statt. Es tritt jedoch auch eine Säure-Base- Reaktion auf, da Kompomere nach dem Einbringen und bei Kontakt mit Speichel Wasser absorbieren. Die Wasseraufnahme ist auch für den Fluoridtransfer wichtig Flowkomposite Bei Flowkompositen handelt es sich um fließfähige Abkömmlinge der Hybridkomposite, die diese Eigenschaft durch Verwendung von Materialien mit einem geringeren Füllstoffanteil (<10%) oder Viskositätsverdünner wie TEGDMA erreichen. Sie werden hauptsächlich bei Fissurenversiegelungen und als Stressbrecher in schwer zugänglichen Kavitäten zwischen Zahnhartsubstanz und 7

14 dem Komposit verwendet Ormocere Die Ormocere stellen eine relativ neuartige Materialgruppe dar und sind eine Gemeinschaftsentwicklung der Fa. Degussa und des Frauenhofer-Instituts für Silikatforschung. Es handelt sich um einen organisch modifizierten, nichtmetallisch anorganischen Verbundstoff. Der Wortursprung stammt aus dem Englischen organically modified ceramic. Im Gegensatz zum herkömmlichen Komposit besteht die Matrix dieses Füllungsmaterials zum Teil aus einem anorganischen, bereits vorpolymerisierten Netzwerk, welches in einem Sol-Gel-Prozess mit organischen Methacrylatgruppen versetzt ist. Im anschließenden Härtungsschritt erfolgt die Polymerisation mit einer geringen Schrumpfung. Durch die vorhandene anorganische Si-O-Si-Struktur wird insbesondere die Abriebfestigkeit deutlich erhöht (Moszner et al., 2008). Aufgrund der speziellen chemischen Zusammensetzung lassen sich aus dem Füllungsmaterial weniger Restmonomere nach der Aushärtung eluieren (Polydorou et al., 2009). Die Vorteile der Ormocere sollen in der verringerten Polymerisationsschrumpfung und dem geringeren toxikologischen und allergologischen Potential liegen, da die organischen Bestandteile an das anorganische Gerüst (Si-O-Ketten und CH2-Gruppen) gekoppelt sind (Manhart et al., 2000). Die bei der Ormocer-Matrix fest verankerten Methacrylat-Gruppen können so gut wie nicht eluiert werden, was die ausgezeichnete Bioverträglichkeit bedingt. Mittlerweile konnten klinische Untersuchungen die erwünschte bedeutende Schrumpfung des Materials bestätigen (Yap und Soh, 2004; Gerdolle et al., 2008) Silorane Silorane, eine Kombination aus Siloxanen und Oxiranen, basieren auf einer neuartigen Chemie. Sie verzichten auf Methacrylate und setzen neue Monomere ein: Siloran (3,4-Epoxycyclohexaylcyclopolymethylsiloxan), Epoxy-Mono-Silanole und epoxyfunktionellen Di- und Oligo-Siloxanen. Sie gleichen so die Volumenkontraktion bei der Polymerisation via Ringöffnung der Monomere aus. Der entscheidende Vorgang findet auf molekularer Ebene statt: Bei der Polymerisation eines 8

15 siloranbasierten Komposites verbinden sich ringöffnende Monomere, indem sie sich öffnen, abflachen und sich zueinander hin ausdehnen. Das Ergebnis ist eine signifikant geringere Volumenschrumpfung im Vergleich zu Kompositen auf Methacrylat-Basis. Silorane zeigen weniger Volumenschrumpfung (<1%) als herkömmliche Komposite (Weinmann et al., 2005). Klinische Risiken von herkömmlichen Kompositen können dadurch deutlich reduziert werden. Dazu gehören Mikrorisse zwischen Füllungsmaterial und Zahn, Mikroleakage, Sekundärkaries sowie Adaptationsprobleme und Höckerdeformationen. Darüber hinaus verfügen Silorane über eine niedrige Wasseraufnahme, sehr gute mechanische Werte und eine ausgezeichnete Umgebungslichtstabilität (Ilie und Hickel, 2009; Lien und Vandewalle, 2010). Das abgestimmte Silorane System Adhäsiv ermöglicht zudem einen starken Haftverbund mit der Zahnsubstanz (Mine et al., 2010) Polymerisation von Kompositmaterialien Komposite härten durch Polymerisation. Dabei kommt es zu einer Radikalkettenpolymerisation der Doppelbindungen an den beiden Methacrylatresten der Matrix-Monomere. Die Polymerisationsreaktion wird durch geeignete Startermoleküle (Initiatoren) oder Katalysatoren ausgelöst und durchläuft prinzipiell die drei Phasen Kettenstart, -wachstum und -abbruch. Die als Initiatoren verwendeten Moleküle sind bei Energieeinwirkung (z.b. Wärme, Licht, chemische Energie) in der Lage Radikale zu bilden. Die Radikale öffnen die ungesättigte Doppelbindung des Monomermoleküls und übertragen ein freies Elektron. Dieses aktivierte Molekül reagiert als Radikal mit anderen Monomeren. Die Verkettung bricht erst ab, wenn zwei Radikale miteinander reagieren. Ein Abbruch erfolgt aber auch, wenn keine weiteren Monomermoleküle mehr vorhanden sind oder deren Konzentration zu niedrig ist. Die nicht umgesetzten Moleküle verbleiben als Restmonomere. Im Falle der chemischen Härtung startet ein Initiator die radikalische Kettenpolymerisation der Basismonomere und Comonomere mit der Bildung freier Radikale (Bowen, 1979). Dibenzoylperoxid (DBP) ist ein häufig verwendeter Initiator, 9

16 der im Zusammenwirken mit einem tertiären aromatischen Amin als Redoxpartner die Polymerisationsreaktion beschleunigt. Die lichtaktivierte Polymerisation erfolgt mittels Licht mit einer Wellenlänge zwischen 450 und 500 nm. Campherchinon, ein 1,2-Diketon, ist der am häufigsten verwendete Photoinitiator (Bowen, 1979; Quast et al., 1986). Die Konversionsrate ist die Anzahl der geöffneten und in die Reaktion eingehenden Doppelbindungen. Theoretisch ist eine Konversionsrate von 100% möglich, praktisch beträgt sie jedoch nur zwischen 35% und 70% (Antonucci und Toth, 1983; Asmussen, 1982; Chung und Greener, 1988; Ruyter und Oysaed, 1987; Spahl et al., 1991; Ferracane, 1990; 1994; 1995). Die Konversionsrate ist bei fotochemisch härtenden Kompositen abhängig von einer ausreichenden externen Lichtzufuhr (Caughman et al., 1991). Dabei spielt die Eindringtiefe des Lichts in den Komposit- Kunststoff eine besondere Rolle: bei 2 mm Tiefe wird die Ausgangslichtintensität um das 10- bis 100-fache reduziert (Phillips, 1991). Das bedeutet, dass ein kleiner Prozentsatz der initialen Doppelbindungen auch im abgebundenen Kunststoff erhalten bleibt. Bei verkürzter Belichtungszeit kommt es zu einer erhöhten Löslichkeit des Komposits (Pearson und Longman, 1989). Der Prozentsatz an nicht umgesetzten Doppelbindungen kann mit Hilfe der Infrarot (IR)-Spektroskopie bestimmt werden. Er beträgt je nach Schichttiefe 20-70%, wobei sowohl die Bestrahlungszeit als auch die Beschaffenheit der Oberflächenschicht eine Rolle spielen (Hellwig et al., 1999) Freisetzung von Restmonomeren Die Polymerisation zahnärztlicher Komposite ist nie vollständig, da nicht alle Methacrylatgruppen der Dimethacrylatmonomere reagieren. Es verbleiben bis zu 45% Restdoppelbindungen (Ruyter und Svendsen, 1978; Ruyter, 1984). Ein hoher Anteil an Monomeren und kurzkettigen Polymeren liegt demnach auch in ausgehärteten Kompositen ungebunden vor. Ein Teil dieser ungebundenen Monomere kann in die Mundhöhle abgegeben werden. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass alle Bestandteile der Kompositmaterialien in Lösung gehen können (Braden et al. 1976; Pearson, 1979). Unpolymerisierte Bestandteile können auch in 10

17 der Kunststoffmatrix verbleiben oder es entstehen während der Polymerisation neue Reaktionsprodukte, die im Ursprungsmaterial nicht enthalten waren. Von der Konversionsrate zu unterscheiden ist die Menge an Monomeren die durch Lösungsmittel aus der Kunststoffmatrix freigesetzt werden kann. Nach Inoue und Hayashi (1982) repräsentiert der Restmonomergehalt nur etwa 2% des Anfangsgewichtes des Komposits. Nahezu alle organischen Komponenten lassen sich aus polymerisierten Kompositmaterialien mit organischen Lösungsmitteln wie Ethanol extrahieren. Als eluierbare Restmonomere der heute gebräuchlichen Komposite wurden Bisphenol A-Glycidyldimethacrylat (BisGMA), Urethandimethacrylat (UDMA), Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA) und 2- Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) in wässrigen Medien nachgewiesen (Geurtsen, 1987; Tanaka et al., 1991; Gerzina und Hume, 1994; Ferracane, 1994). Ferracane und Condon (1990; 1994) haben gezeigt, dass 75% der eluierbaren Substanzen schon innerhalb weniger Stunden herausgelöst werden. Sie haben ebenfalls nachgewiesen, dass der größte Teil der eluierbaren Substanzen bereits nach einem Tag Liegezeit in Wasser oder Ethanol aus dem Komposit-Kunststoff freigesetzt wird. Polydorou et al. (2007) konnten hingegen zeigen, dass die Freisetzung von TEGDMA und BisGMA ein Monat nach der Polymerisation noch sehr hoch ist. In organischen Extraktionsmittel werden 0,4-1,5 Gew.% Bis-GMA oder 4,6-11% des Ausgangsgewichts aller Monomere freigesetzt (Geurtsen, 1998; Inoue und Hayashi, 1982). In wässrigen Extraktionsmitteln, wie z. B. im wässrigen Milieu der Mundhöhle, wird vergleichsweise wesentlich weniger BisGMA freigesetzt (Inoue und Hayashi, 1982), jedoch mehr kleine, hydrophile und gut wasserlösliche Monomere wie z. B. TEGDMA (Spahl et al., 1998). Zudem wurde festgestellt, dass in einem wässrigen Milieu 90% aller freigesetzten Substanzen in den ersten 24 Stunden nach dem Anmischen eluiert werden (Geurtsen, 1998). Von Bedeutung ist auch Formaldehyd, welches, insbesondere bei Vorliegen einer Sauerstoffinhibitionsschicht, in hohen Mengen freigesetzt wird (Oysaed et al., 1988). Laut einer Stellungnahme der DGZMK (1997) können die Formaldehydkonzentrationen in verschiedenen Dentalmaterialien außerordentlich stark variieren. 11

18 Degradation von Restmonomeren Laut Geurtsen (1998) werden im Anschluss an die Polymerisation verschiedene Substanzen durch Degradation oder Erosion aus Matrix und Füller freigesetzt. Generell wird Degradation definiert als Zerlegung von Verbindungen der Polymerkette, bei der Oligomere oder, seltener, auch Monomere entstehen. Die Degradation verändert die Mikrostruktur des Polymerisationsgeflechts. Es entstehen Poren, durch die Oligomere und Monomere freigesetzt werden können. Des Weiteren wird der ph-wert in diesen Poren erheblich von den Degradationsprodukten bestimmt, was dazu führt dass der ph-wert sinkt (Brunner et al., 1998). Die Polymerdegradation kann durch chemische, thermische oder mechanische Faktoren hervorgerufen werden. Die chemische Degradation eines Komposits kann durch Hydrolyse und Enzymkatalyse entstehen (Göpferich, 1996). Unspezifische Esterasen und Enzyme des Speichels können die organische Matrix des Komposites angreifen, wodurch verschiedene Substanzen freigesetzt werden können. Schweineleberesterasen etwa verursachten eine Erweichung der Kunststoffoberfläche nach 48 Stunden, was zu einer erhöhten Abnutzung führte (Freund und Munksgaard, 1990; Larsen und Munksgaard, 1991). Ebenfalls kann das Eindringen von Lösungsmittel eine chemische Degradation des Kompositmaterials verursachen, wodurch Monomere aus dentalen Kunststoffen freigesetzt werden können. Dabei können auch Reaktionsprodukte entstehen. Die Art und Menge nicht-polymerisierter freier Kompositmonomere, ihre Auslaugung und Verfügbarkeit wurde mehrfach beschrieben (Ferracane, 1994; Inoue und Hayashi, 1982; Geurtsen, 1998; Sideridou und Achilias, 2005; Zissis et al., 2008; Tabatabaee et al., 2009). Es ist jedoch noch nicht geklärt, inwiefern sich durch solche Prozesse die Materialeigenschaften der Komposite verändern. 12

19 2.2. Toxizität Seit einigen Jahren werden zahnärztliche Kunststoffe zunehmend kritisch bewertet (Geurtsen, 2000; Bouillaguet, 2004; Schedle et al., 2007; Schweikl et al., 2006; Anagnostou et al., 2009). Mittlerweile gibt es fundierte Hinweise, dass dentale Komposite ein größeres Risiko für Nebenwirkungen besitzen als Amalgam Symptome und Beschwerden Mögliche Nebenwirkungen und Schädigungen durch Inhaltstoffe in Kompositen sind bekannt. Die Nebenwirkungen reichen von auftretenden Hautirritationen (Lonnroth und Shahnavaz, 1998) bis hin zur Entstehung einer generalisierten motorischen und sensorischen Neuropathie (Sadoh et al., 1999). Auch wird von manchen Patienten über subjektive Symptome wie Unwohlsein oder Müdigkeit berichtet. Diese Symptome haben allerdings eine auffallende Ähnlichkeit mit denen, die dem Amalgam zugeschrieben werden. Deswegen spielen hier vielleicht andere Faktoren eine Rolle wie z.b. psychologische Aspekte oder Medikamentennebenwirkungen. Auch andere Chemikalien wie Lacke, Farben, Mottenkugeln oder Klebstoffe, die im täglichen Gebrauch vorkommen, werden als Ursache für ähnliche Symptome angegeben (Voack et al., 1998). Staehle et al. (1997) und Schmalz et al. (2005) haben Erkrankungen zusammengestellt, die nach EAV-Testung (Elektroakupunktur nach Voll) angeblich erfolgreich durch Entfernung der Kompositfüllungen behandelt wurden (Tabelle 2). Da es sich bei der EAV-Testung um keine wissenschaftlich anerkannte Methode handelt, soll die Zusammenstellung nur verdeutlichen, dass eine Reihe von unspezifischen Symptomen mit Kompositen in Verbindung gebracht wird: 13

20 Amenorrhö Migräne Bronchitis Müdigkeit Basaliom Nephritis Chronische Sinusitis Neurodermitis Depressionen Polyarthritis Gelenkerkrankungen Rheuma Herzrhythmusstörungen Schlaflosigkeit Hypertonie Tenesmen Iridozyklitis Tinnitus Konzentrationsstörungen Urethrozystitis Koxarthritis Vaginitis Leistungsschwäche Zystitis Kopfschmerzen Tabelle 2: Beschwerden und Erkrankungen, die nach EAV-Testung mit Kompositfüllungen in Zusammenhang gebracht werden können (Schmalz et al., 2005). Laut Gjerdet und Askevold (1998) hat die Häufigkeit, mit der Patienten systemische Nebenwirkungen auf Nicht-Amalgame angeben, in Norwegen in den letzten Jahren zugenommen. Die Zahl der Beschwerden, die mit Amalgam in Zusammenhang gebracht wurden, nahm im gleichen Zeitraum ab. Es wurden aber in Norwegen zu dieser Zeit ein Rückgang bei der Verwendung von Amalgamen und eine Zunahme bei der Kompositnutzung registriert Allergien Komposit-Kunststoffe enthalten eine Reihe von Substanzen, die allgemein als Allergene angesehen werden (Hensten-Pettersen, 1998). Dies trifft sowohl für die Basismonomere und Comonomere zu, als auch für andere Zusätze wie Aktivatoren und Inhibitoren. HEMA und TEGDMA gehören bei den Methacrylaten zu den Substanzen die am häufigsten Sensibilisierungen hervorrufen (Kanerva et al., 1997). Man unterscheidet im Zusammenhang mit Kompositmaterialien prinzipiell Reaktionen vom Sofort-Typ (Typ I) und vom verzögerten Typ (Typ IV). Die Konzentrationen, die zum Auslösen einer allergischen Reaktion bei einer bereits sensibilisierten Person führen, sind wesentlich geringer als bei toxischen Reaktionen. Sie liegen zum Teil in Bereichen wie sie in der Mundhöhle vorkommen. Über sehr 14

21 seltene Fälle von anaphylaktischen Reaktionen (Typ I-Allergie) wurde nach der Applikation von Fissurenversieglern berichtet (Hallström, 1993). Neben diesen Typ I- Reaktionen werden in der Literatur vor allem Reaktionen im Sinne einer Kontaktdermatitis (Typ-IV-Reaktion) beschrieben. Klinische Fälle, in denen eine Allergie gegen ein Kompositmaterial aufgetreten ist, sind in der Literatur kaum dokumentiert. Selbst umfangreiche Recherchen, die fast 500 Fachzeitschriften aus der gesamten internationalen Literatur der letzten zehn Jahre umfassten, ergaben nur in 21 Fällen Hinweise auf lokale oder systemische Reaktionen. Nach Angaben von dänischen Zahnärzten kann man davon ausgehen, dass in ca. 2% der Fälle allergiebedingte Nebenwirkungen auf Komposite auftraten (Munksgaard, 1992). Ebenfalls 2% einer Gruppe befragter schwedischer Zahnärzte gaben Handekzeme nach Kontakt mit Kompositen an (Örtengren et al., 1999). Die Allergierate bei zahnärztlichem Personal hat in den letzten Jahren kontinuierlich zugenommen (Kanerva et al., 1999). Bis heute ist das Risiko einer Allergie noch gering. Durch die laufende Weiterentwicklung dentaler Kunststoffe und dem damit verbundenen Kontakt zu zahlreichen potentiellen Allergenen ist jedoch mit der Möglichkeit einer zunehmenden Sensibilisierung der Bevölkerung zu rechnen. 15

22 Metabolisierung von Monomeren Zur Aufnahme, Verteilung, Verstoffwechselung und Ausscheidung von freigesetzten Substanzen aus Kompositen gibt es kaum Informationen. Reichl et al. (2001; 2002) veröffentlichten Daten aus Tierversuchen über die Metabolisierung von HEMA/TEGDMA. Sie fanden heraus, dass verschlucktes HEMA/TEGDMA fast vollständig vom Organismus resorbiert wird. Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich über die Lunge. Der Abbau von TEGDMA ist noch nicht vollständig geklärt. Er erfolgt entweder zu CO 2 oder über die Bildung intrazellulärer und biologisch hochaktiver Epoxide zu Pyruvat und dann zu CO Zytotoxizität von Monomeren Die zytotoxische Wirkung einiger Kompositwerkstoffe wurde in früheren Studien untersucht. Die Zytotoxizität von Basismonomeren wird als TC50 gemessen. TC50 ist die Konzentration bei der eine 50prozentige Stoffwechselreduktion bzw. Zelltod beobachtet wird. Sie ist bei den einzelnen Substanzen sehr unterschiedlich und zum Teil sind schon kleine Konzentrationen in der Lage eine biologische Reaktion hervorzurufen (Tabelle 3). Substanz TC 50 (µl/l) BisGMA 9 UDMA 17 TEGDMA 125 Bisphenol A 28 Campherchinon 235 Tabelle 3: Zytotoxizität der Basismonomere Bei der Prüfung der Zytotoxizität der Kunststoffe zeigt sich, dass sie im nicht polymerisierten Zustand oder kurz nach der Aushärtung zytotoxisch reagieren. Im 16

23 polymerisierten Zustand jedoch reagieren sie inert (Kaga et al., 1990; Schedle et al., 1994; Schmalz, 1981). Auch Caughman et al. (1991) konnten zeigen, dass die Zytotoxizität abhängig vom Polymerisationsgrad ist. Komposite haben bei kurzer Polymerisationszeit eine signifikant höhere Toxizität. Außerdem sind fließfähige Komposite zytotoxischer als ähnliche Werkstoffe mit dem üblichen Füllergehalt (Wataha et al., 2003). BisGMA konnte im experimentellen Versuchsaufbau teratogene und embryotoxische Effekte hervorrufen (Schwengberg et al., 2005). Auch Schmalz et al. (2004) haben gezeigt, dass die Basis-Monomere (BisGMA, UDMA) eine vergleichsweise hohe Zelltoxizität zeigen, während TEGDMA etwas geringer toxisch ist. Die Zytotoxizität von zahnärztlichen Kunststoffen wurde mittels Implantationstests an kleinen Labortieren untersucht (Mjör et al., 1977; Welker et al., 1977; Schmalz, 1981; Schmalz und Bühler, 1983; Wennberg et al., 1983). Subkutane, intramuskuläre oder intraossäre Implantate von Kompositwerkstoffen führten nach unterschiedlichen Expositionszeiten zu leichten bis mäßig toxischen Reaktionen im Gewebe. Mit zunehmender Liegezeit im Gewebe nahm die Toxizität polymerisierter Werkstoffe ab Mutagenität von Monomeren BisGMA und UDMA waren in Säugetierzellen und in Bakterienkulturen in vitro nicht mutagen (Schweikl et al., 1998). Es wurde jedoch gezeigt, dass BisGMA, TEGDMA und HEMA in hohen Konzentrationen eine mutagene und kanzerogene Wirkung aufweisen (Reichl, 2002). TEGDMA führte bei Säugetierzellen zu größeren Deletionen in DNA-Molekülen (Schweikl et al., 1998) und zur Bildung von Mikrokernen in Säugetierzellen (Schweikl et al., 2001). Außerdem stellten Kleinsasser et al. (2004; 2006) fest, dass TEGDMA und HEMA die Initiation eines DNA-Strang-Bruches verursachen können. Die klinische Bewertung von In-vitro- Mutagenitätsdaten ist schwierig, weil die Konzentrationsdaten sich weit über den Konzentrationen befinden, die am Patienten angewendet werden Einfluss von Monomeren auf die Pulpa Die Voraussetzung für eine Pulpaschädigung ist, dass die entsprechend toxischen 17

24 Substanzen in ausreichenden Mengen aus dem Füllungsmaterial eluiert werden und durch das Dentin in Richtung Pulpa diffundieren. Zur Wirkung von Kompositen in tiefen Kavitäten auf die Pulpa liegen nur vergleichsweise wenige Studien vor, die wiederum widersprüchliche Ergebnisse zeigen (Torstenson, 1995; Hebling et al., 1999; De Souza Costa et al., 2000). Tierstudien haben keinen Hinweis darauf gegeben, dass es in tiefen Kavitäten durch die materialbedingte Toxizität zu einem Pulpaschaden kommen kann (Torstenson, 1995). An menschlichen Zähnen hingegen konnten ausgeprägte Entzündungsreaktionen als Folge von Kompositfüllungen in tiefen Kavitäten histologisch beobachtet werden (Hebling, 1999; Costa et al., 2000). Auch andere Autoren haben nachgewiesen, dass sowohl TEGDMA als auch HEMA durch das Dentin diffundieren und dort einen zellulären Schaden anrichten können (Bouillaguet et al., 1996; Hume und Gerzina, 1996). Die Wirkung antibakteriell wirkender Monomere wird in letzter Zeit häufig diskutiert. Kürzlich wurde MDPB auf den Markt gebracht, ein Monomer das neben seiner Methacrylatfunktion auch eine antibakterielle Gruppe (Pyrimidiumbromid) enthält. Invitro Studien haben ergeben, dass MDPB wirksam gegenüber üblichen oralen Bakterien ist, jedoch nicht toxisch gegenüber Pulpazellen (Murray et al., 2000; Schmalz et al., 2004). Weitere klinische Studien sind aber erforderlich um die Wirkung von MDPB auf die unterschiedlichen Zellen der Pulpa zu bestimmen Östrogenität von Monomeren Ein Bestandteil des Basismonomers BisGMA ist das Bisphenol A. BPA wird von der chemischen Industrie für die Produktion von Polykarbonat und Epoxyharzen hergestellt. Aus der Umweltforschung ist bekannt, dass BPA an Östrogenrezeptoren von Zellen bindet (Steinmetz et al, 1997; Kang et al, 2006). Endokrine Effekte von BPA sind sowohl in vivo als auch in vitro nachweisbar (Welshons et al., 2006). So kann BPA eine biologische Reaktion hervorrufen, die der der Östrogenen ähnelt. Allerdings ist eine endokrine Wirkung von BPA in sehr geringer Konzentration nach wie vor umstritten. Die meisten Studien konnten kein Bisphenol A als Degradationsprodukt von BisGMA identifizieren (Nathanson et al., 1997; Hamid und Hume, 1997; Lewis et al., 1999; Schmalz et al., 1999; Wada et al., 2004). Im Gegensatz dazu fanden Pulgar et al. (2000) heraus, dass BPA in sehr hohen Dosen 18

25 (bis zu 1,8 µg/mg Komposit) freigesetzt wird. Andererseits wurde BPA häufig als Degradationsprodukt von BisDMA, das z.b. in Fissurenversieglern vorkommt, gefunden (Olea et al., 1996; Arenholt-Bindslev et al., 1999, Tarumi et al., 2000). Weitere Studien ergaben dann, dass BPA- und BisGMAhaltige Fissurenversiegler zwar eine östrogene Wirkung zeigten, jedoch war die Intensität dieser Reaktion viel geringer als die des Östradiols, das zur Kontrolle verwendet wurde (Fung et al., 2000; Hashimoto und Nakamura, 2000). Außerdem wurde nachgewiesen dass, bei korrekter Verarbeitung und bei sehr hohem Reinheitsgrad der Ausgangsprodukte, kein Bisphenol A aus BisGMA-haltigen Kompositen freigesetzt wird (Schmalz et al., 1999). Bisphenol A wurde allerdings auch in Speichel und Blut von gesunden Probanden nach Legen einer Kompositfüllung nachgewiesen (Arenholt-Bindslev et al., 1999; Fung et al., 2000; Sasaki et al., 2005; Joskow et al., 2006). In-vivo Untersuchungen wurden an Mäusen durchgeführt. Den Mäusen wurde eine Dosis von 25 µg/kg Körpergewicht BisGMA injiziert. Es wurde keine Reaktion beobachtet. Erst bei 100 µg/kg Körpergewicht kam es zu einer geringen Bindegewebszunahme (Mariotti et al., 1998). Ashby et al. (1999) zeigten in einer Studie, bei der schwangeren Mäusen während fünf Tagen geringe Konzentrationen BPA verfüttert wurden, dass männliche Nachkommen Missbildungen der Prostata und eine Verengung des Harnleiters aufwiesen. Daten zu Langzeitanwendungen existieren bis dato noch nicht. Untersuchungen an Patienten haben ergeben, dass, nach Applikation eines BisDMA-haltigen Fissurenversieglers, eine geringe Östrogenkonzentration im Speichel nachweisbar ist. Bereits nach einer Stunde ist dieser Nachweis jedoch nicht mehr möglich (Arenholt-Bindslev et al., 1999). 19

26 2.3. Stand der Forschung Obwohl die letzten Jahre viele Studien (Ferracane, 1994; Hume und Gerzina, 1996; Geurtsen, 2000; Bouillaguet, 2004; Schedle et al., 2007) über die Freisetzung von Monomeren aus Kompositen durchgeführt wurden, sind die Elutionsmittel und ihr Einfluss auf die Freisetzung bisher nicht systematisch untersucht worden. Viele Studien haben bewiesen, dass verschiedene Komponenten aus Kompositfüllungen herausgelöst und an das orale Umfeld abgegeben werden können (Geurtsen, 1998). Die Menge und die Zusammensetzung der eluierten Substanzen sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis des toxischen Potentials von Kompositen. Die Freisetzung dieser Substanzen kann Einfluss sowohl auf die Biokompatibilität, als auch auf die mechanischen Eigenschaften nehmen. Um Monomere aus zahnärztlichen Kompositen zu eluieren, haben verschiedene Autoren unterschiedliche Lösungsmittel verwendet (Geurtsen, 1998; Ferracane und Condon, 1990; Lee et al., 1995; Wu und McKinney, 1982; Antonucci und Toth, 1985) so z. B. destilliertes Wasser, Speichel, Ethanol, Methanol oder Acetonitril. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das Elutionsmittel eine wichtige Rolle bei der Monomerfreisetzung spielt. In organischen Lösungsmitteln (wie Ethanol, Chloroform oder Methanol) werden über denselben Zeitraum weitaus mehr Komponenten aus dem Komposit herausgelöst als in anorganischen (Rathbun et al., 1991). Studien ergaben, dass fast alle Komponenten aus unpolymerisiertem Komposit auch in den polymerisierten Proben, die sich 3 Tage in Methanol befanden, herausgelöst werden können. In wässrigem Milieu waren nur wenige Substanzen nachzuweisen (Spahl et al., 1998). Moharamzadeh et al. (2007) fanden heraus, dass TEGDMA aus zahnärztlichen Kompositen in wässrigen Lösungsmitteln (destilliertes Wasser, Kochsalzlösung, künstlicher Speichel) herausgelöst werden kann. BisGMA und UDMA waren nicht nachweisbar. Insbesondere Ethanol, was von der amerikanischen FDA als food simulating fluid und als aging accelerator deklariert wurde, wurde oft in Studien verwendet. Obwohl 75-prozentiges Ethanol ein sehr aggressives Mittel ist, scheint es den Einfluss von Lebensmittel zu simulieren und die Alterungsprozesse zu beschleunigen (McKinney und Wu., 1985). Systematische Untersuchungen über die Freisetzung von Monomeren aus 20

27 Kompositen in Abhängigkeit von Elutionsmittel fehlen bisher. Dies ist jedoch notwendig, um klinisch relevante Ergebnisse zu erhalten und die unterschiedlichen Studien vergleichen zu können Analytische Methoden zur Monomerquantifizierung In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden angewandt, um die Monomerfreisetzung zu messen (Lamb et al., 1982; Bartoloni et al., 2000). Die qualitative und quantitative Standardmethode für die Analyse von Restmonomeren ist die Gaschromatographie (GC) oder die Hochleistungschromatographie (high performance liquid chromatography HPLC) HPLC Die HPLC ist ein Verfahren der Säulen-Flüssigkeits-Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit mittels einer flüssigen Phase (Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase (Trennsäule) transportiert wird. Bei der HPLC finden hauptsächlich die Verfahren der Adsorptions- und Verteilungschromatographie Anwendung. Bei der Adsorptionschromatographie werden die Probenmoleküle durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen reversibel an die stationäre Phase gebunden. Die Verweildauer der Substanzen an der stationären Phase ist aufgrund der unterschiedlich starken Wechselwirkung mit der Oberfläche der stationären Phase unterschiedlich lang. So werden die Substanzen von einander getrennt. Bei der Verteilungschromatographie nutzt man die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden Substanzen in den beiden Phasen aus. In der Normalphasen- Verteilungs-Chromatographie ist die stationäre Phase polarer als die mobile, in der Reversed-Phase-Chromatographie ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase. Die stationäre Phase kann an ein Trägermaterial chemisch gebunden werden oder das Trägermaterial wird einfach mit der stationären Phase belegt. Die 21

28 Reversed-Phase-Chromatographie wird vorwiegend bei unpolaren oder wenig polaren Substanzen angewendet. Abbildung 1: Aufbau einer HPLC-Anlage Ein HPLC-Gerät besteht aus 4 Hauptteilen: Pumpe, Einspritzsystem, Trennsäule und Detektor mit Auswertsystem. Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3-10 µm; sie erreicht damit hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule (2-6 mm Duchmesser). Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein (bis ca. 300 bar). Bei der Probenaufgabe wird die Probe zunächst drucklos in eine Probenschleife injiziert, die sich in einem 4-Wege-Ventil befindet. Durch Umschalten wird der Elutionsmittelstrom dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe in die Säule gelangt. Die analytische Trennsäule, meist aus Edelstahl, sollte thermostatisierbar sein. Zur Detektion werden UV/VIS-, Fluoreszens-Spektrometer, RI-amperometrische und Leitfähigkeits-Detektoren mit Durchflußzellen verwendet. Die Darstellung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt in Form eines Chromatogrammes, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit für die Menge (Konzentration) der eluierten Substanzen von der Zeit dar. Die einzelnen Stoffe haben unterschiedliche Retentionszeiten. Die Gesamtretentionszeit tr setzt sich aus der Nettoretentionszeit ts (Aufenthalt in der stationären Phase) und der Durchflusszeit der mobilen Phase (ohne Retention) tm zusammen. 22

29 Massenspektrometrie Bei der Massenspektrometrie wird die Substanz im Vakuum verdampft und ionisiert. Danach werden die Ionen durch ein elektrisches Feld beschleunigt und durch ein magnetisches Feld dispergiert damit sie sich auftrennen lassen. Das Molekül wird zerstört. Im Massenspektrometer werden dann die Moleküle nach ihrer Molekülmasse und ihrer Ladung aufgetrennt. Dabei zerfallen die Moleküle je nach Geräteeinstellung in kleinere Bruchstücke, so genannte Fragmente, die dann ihrerseits detektiert werden. Grundprinzip der Massenspektrometrie ist aus Substanzen Ionen zu erzeugen. Diese Ionen werden nach ihrer Masse getrennt und quantitativ nach ihrer Masse erfasst. Die Ionisation erfolgt thermisch, durch elektrische Felder oder durch Beschuss mit Elektronen, Ionen oder Photonen. Die Ionentrennung erfolgt durch statische oder dynamische elektrische und magnetische Felder. Als Massenspektrum werden die bei der Ionisierung einer Substanz erzeugten Ionen entweder gleichzeitig oder zeitlich nacheinander registriert. Die Intensität wird aus der Fläche oder einfach der Höhe der Signale, der sogenannten Peaks, ermittelt und üblicherweise auf den intensivsten Peak im Spektrum, den Basispeak, normiert Ziel der Studie Das Ziel der vorliegenden in-vitro Studie ist den Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf die Restmonomerfreisetzung aus zwei konventionellen Kompositen zu untersuchen. Als Bestimmungsmethode wurde HPLC/MS/MS verwendet. 23

30 3. Material und Methode 3.1. Material Für die vorliegende Untersuchung wurden zwei verschiedene Komposite und vier verschiedene Lösungsmittel verwendet Komposite Ceram X TM (Dentsply DeTrey GmbH Deutschland) Ceram X TM ist ein universelles nanokeramisches Komposit und gehört zur Gruppe der Ormocere. Es ist lichthärtend, röntgenopak und besteht aus Nanopartikeln organisch modifizierter Keramik der Grösse 2-3 nm und Nanofüllern (~10 nm), kombiniert mit konventionellen ca. 1 µm großen Glasfüllern. Die Nanopartikel aus organisch modifizierter Keramik weisen ein Grundgerüst aus Polysiloxan auf, vergleichbar mit dem in Glas oder Keramik. Insgesamt beträgt der Fülleranteil 76 Gew.-% bzw. 57 Vol.-%. An das Grundgerüst sind Methacrylgruppen angefügt, welche ermöglichen, dass das Komposit mit der Harzmatrix polymerisiert. Ceram X TM ist in zwei eigenständigen Farbsystemen erhältlich: Ceram X TM mono und Ceram X TM duo. Bei der vorliegenden Studie wurde die Farbe E3 Schmelz verwendet. Das Ceram X TM System wurde in vordosierten Compules Tips angewandt. Abbildung 2: Ceram X TM 24

31 Ceram X TM setzt sich nach Herstellerangaben aus folgenden Komponenten zusammen: Methacrylat-modifiziertes Polysiloxan Dimethacrylat-Harz Fluoreszenzpigment Stabilisator Campherchinon Ethyl-4-(Dimethylamino)Benzoat Barium-Aluminium-Borosilikat-Glas Methacrylat-funktionalisierter Siliziumdioxid-Nanofüllstoff Eisenoxid-Titanoxid- und Aluminiumsulfosilikatpigmente je nach Farbe Filtek TM Supreme XT (3M ESPE Dental Products, Seefeld, Deutschland) Filtek TM Supreme XT Universal Restaurationsmaterial von 3M ESPE ist ein lichtaktivierendes Füllungskomposit zur Verwendung für anteriore und posteriore Restaurationen. Alle Farbtöne mit Ausnahme der transparenten Farben sind röntgenopak. Die Füller für die röntgenopaken Farben sind eine Kombination aus aggregierten Zirkonium-/Silikafüller-Clustern mit einer durchschnittlichen Partikelgrösse der Cluster von 0,6-1,4 Mikron bei einer primären Partikelgröße von 5-20 nm und nichtagglomerierten/nichtaggregierten Silikafüller mit 20 nm. Die Füller für die nicht röntgenopaken, transparenten Farben sind eine Kombination aus aggregierten Silikafüller-Clustern mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 0,6-1,4 Mikron bei einer primären Partikelgröße von 75 nm und nichtagglomerierten/nichtaggregierten Silikafüller mit 75 nm. Der anorganische Füllgehalt beträgt etwa 72,5 Gew.-% (57,7 Vol.-%) bei der transparenten Farbe und 78,5 Gew.-% (59,5 Vol.-%) bei allen anderen Farben. Filtek TM Supreme XT Universal enthält BisGMA, UDMA-, TEGDMA-, und BisEMA-Harze. Das Kompositmaterial ist in einer breiten Farbpalette erhältlich. Es ist in herkömmlichen Spritzen und Kapseln zur Einmaldosierung verpackt. Für die Studie lag Filtek TM Supreme XT in der Farbe A3E Schmelz vor. 25

32 Abbildung 3: Filtek TM Supreme XT Elutionsmittel In der vorliegenden Studie wurden vier verschiedene Lösungsmittel verwendet: Ethanol Es wurde Ethanol absolut der Firma VWR (BDH PROLABO) verwendet. Für die Herstellung der Proben wurde das 100-prozentige Ethanol zu einem 75-prozentigem Ethanol in einem Verhältnis von 1:3 mit destilliertem Wasser verdünnt. Abbildung 4: Strukturformel für Ethanol 26

33 Ethanol besitzt folgende chemische Eigenschaften (Tabelle 4): MAK 1000 ml/m 3 MG 46,07 g/mol Dichte 0,7936 g/cm 3 Schmelztemperatur -114 C Siedetemperatur 78,32 C Wasserlöslichkeit Explosionsgrenzen In jedem Verhältnis mischbar 23,4-15 Vol.-% (Luft) Tabelle 4: chemische Eigenschaften von Ethanol Aceton Für den Versuch wurde 100-prozentiges Aceton der Firma Merck KGaA Deutschland verwendet. Abbildung 5: Strukturformel für Aceton Die chemischen Eigenschaften von Aceton sind in der folgenden Tabelle beschrieben (Tabelle 5): 27

34 MAK 500 ml/m 3 MG 58,08 g/mol Dichte 0,7908 g/cm 3 Schmelztemperatur -95 C Siedetemperatur 56 C Wasserlöslichkeit Explosionsgrenzen In jedem Verhältnis mischbar 2,5-13 Vol.-% (Luft) Tabelle 5:chemische Eigenschaften von Aceton Aceton ist, als einfachstes Keton, eine farblose Flüssigkeit, und findet Verwendung als aprotisches Lösungsmittel und als Edukt für Synthesen der organischen Chemie. Es besitzt als charakteristisches Strukturmerkmal eine Carbonylgruppe die mit zwei Methylgruppen verbunden ist Natriumchlorid Zur Lagerung der Proben wurde eine isotonische Kochsalzlösung der Firma Braun verwendet. Die isotonische Kochsalzlösung enthält 0,9 % Natriumchlorid Speichel Für die Versuche wurde gepoolter stimulierter humaner Speichel von 52 Probanden gesammelt. Die Probanden durften weder erkrankt noch schwanger sein. Zum Zeitpunkt der Speichelabgabe hatten sie seit mindestens zwei Stunden keine Nahrung zu sich genommen und sich innerhalb dieser Zeit auch nicht die Zähne geputzt. Der Speichelfluss wurde mit Kaugummis (Wrigley s Extra Professional, Wrigley, Unterhaching) stimuliert. Erst nachdem die Probanden den Kaugummi mindestens zwei Minuten gekaut hatten, erfolgte das Sammeln des Speichels in verschließbaren 50 ml Kunststoffbehältern (Greiner, Kremsmünster, Österreich). Der Speichel wurde direkt nach der Abgabe bei -21ºCelsius tiefgefroren. Nachdem drei 28

35 Liter Speichel gesammelt worden waren, wurde der gesamte Speichel aufgetaut, miteinander vermischt und anschließend zentrifugiert. Bis zur weiteren Verwendung wurde der gepoolte Speichel wieder in verschließbaren 50 ml Kunststoffbehältern bei -21º Celsius gelagert Zusätzliche Materialien Monomere für die Herstellung der Standards Zur Herstellung der Kalibrierlösungen wurden die Substanzen Bisphenol A, BisGMA, TEGDMA und UDMA bei den jeweiligen Herstellern bestellt. Die Firma Dentsply DeTrey stellte die Substanzen BisGMA, TEGDMA, UDMA1 und Bisphenol A zur Verfügung während UDMA2 von DeltaMed GmbH, Friedberg bereitgestellt wurde. In der folgenden Tabelle sind die Informationen der als Standards verwendeten Substanzen aufgelistet: Abbildung 6: Monomere 29

36 Monomer M.W. Strukturformel BisGMA C 29 H 36 O 8 512,59 Bisphenol A C 15 H 16 O 2 228,29 UDMA1 C 26 H 42 O 8 N TEGDMA C 14 H 22 O 6 286,32 UDMA2 C 11 H 15 NO 4 225,24 Tabelle 6: Chemische Informationen der als Standards verwendeten Substanzen Polymerisationslampe Zum Härten der Kompositproben wurde die Halogenlampe Elipar Highlight der Firma 3M ESPE (D-Seefeld) verwendet. Sie besitzt eine Lichtintensität von mw/cm 2, die mit einem Lichtmessgerät, dem Cure Rite, der Firma Dentsply (USA) gemessen wurde. Die Belichtungszeit richtete sich nach den Herstellerangaben. 30

37 3.2. Methode Herstellung der Proben Aus jedem Kompositmaterial wurden 40 identische Prüfkörper hergestellt, 10 für jedes Lösungsmittel (Dicke: 2 mm, Durchmesser: 4,5 mm und Gesamtmasse von 65,5 mg). Die Herstellung der Kompositproben erfolgte mittels einer speziellen Form mit zylinderförmigen Mulden der Firma Dentsply DeTrey (D-Konstanz). Die Form wurde vor der Polymerisation auf der Oberseite mit einer durchsichtigen Matrize (Kerr Hawe, Schweiz) abgedeckt. Als Unterlage wurde die glatte Seite einer Glasplatte verwendet. Abbildung 7: Form für die Herstellung der Prüfkörper Die Lichthärtung der Prüfkörper erfolgte bei einseitiger Bestrahlung mittels einer Halogenlampe (Elipar Highlight, 3M ESPE, D-Seefeld). Die gewählten Zeiten richteten sich nach den Herstellerangaben, d.h. Ceram X TM 10 Sekunden und Filtek TM Supreme XT 20 Sekunden. Nach dem Aushärten wurde jede Kompositprobe in 1 ml von dem entsprechenden Lösungsmittel gelegt (Ethanol, Aceton, Kochsalzlösung oder Speichel) und bei Raumtemperatur und normalem Luftdruck in Eppendorffgefäßen gelagert. Auf diese Weise entstanden 8 Gruppen mit jeweils 10 Kompositprüfkörpern. 31

38 Gruppe Komposit Lösungsmittel 1 Filtek Supreme Ethanol 2 Ceram X duo Ethanol 3 Filtek Supreme NaCl 4 Ceram X duo NaCl 5 Filtek Supreme Speichel 6 Ceram X duo Speichel 7 Filtek Supreme Aceton 8 Ceram X duo Aceton Tabelle 7: Aufteilung der Probengruppen Herstellung der Kalibrierlösungen Es wurden 100 µg des jeweiligen Monomers in einen 100 ml Ballonkolben abgewogen. Die Kolben wurden für jedes Monomer mit einem der Lösungsmittel aufgefüllt. Als Elutionsmittel dienten Ethanol, Aceton und isotone Kochsalzlösung. So entstanden 15 Standardlösungen mit einer Konzentration von 1000 µg/ml. Von jedem Monomer wurden Standardlösungen in den Konzentrationen 100, 50, 25, 10, 5, 1, 0,5 und 0,1 µl/ml erstellt, um die später erworbenen Monomerkonzentrationen aus den Kompositen quantifizieren zu können Extraktionsbedingungen Die Extraktionsmedien wurden nach 24 Stunden, 7 Tagen und 28 Tagen nach der Polymerisation erneuert. Von den extrahierten Lösungsmitteln wurden Proben hergestellt, indem 1 ml des jeweiligen Lösungsmittels in lichtgeschützte, braune Gewindeflaschen (WICOM Germany GmbH) pipettiert wurde. Die Gewindeflaschen wurden mit einer Schraubkappe mit eingelegten Silikon/Teflon-Septum (WICOM 32

39 Germany GmbH) verschlossen. Abbildung 8: Analytikgefäße Die Extrakte wurden bis zur Analyse bei -20ºC aufbewahrt. Unmittelbar vor der analytischen Auftrennung wurden die zu untersuchenden Lösungen langsam bei Zimmertemperatur aufgetaut. Die Abbildung 9 verdeutlicht die Herstellung der Kompositproben: Abbildung 9: Versuchsaufbau 33