Praktikum Wasserhygiene

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1 Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie Praktikum Wasserhygiene 1. Kurstag Dr. Sandro Wolf, Dr. Marina Totrova, Dr. Kerstin Röske Prof. Isolde Röske TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 1 von XYZ

2 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Da es unter den Mikroorganismen pathogene Vertreter gibt, sind alle unbekannten Keime als potentiell pathogen zu betrachten, und es ist mit entsprechender Vorsicht mit ihnen zu arbeiten. Die im Kurs verwendeten Mikroorganismen gehören der Risikogruppe I oder II nach der Biostoffverordnung vom an. Entsprechende Hinweise werden im Kurs gegeben. Nähere Informationen unter: Viele Untersuchungen werden mit Reinkulturen durchgeführt. Auch mit diesen ist sorgfältig umzugehen, um Fremdinfektionen der Kultur zu vermeiden. Das Tragen eines kochbaren Arbeitskittels ist Pflicht. Dieser verbleibt wären der gesamten Kurszeit im Praktikumsraum. Nach Beendigung des Praktikums kann der Kittel autoklaviert werden lassen. Im Praktikumsraum sind Essen, Trinken und Rauchen sowie die Lagerung diesbezüglicher Dinge verboten. Vor Verlassen des Raumes sind die Hände gründlich zu waschen und zu desinfizieren. Mikroorganismen dürfen nicht auf Kleidung, Arbeitsplätze, Geräte usw. gelangen. Verschüttetes Material ist mit Zellstoff abzudecken, der mit Desinfektionsmittel getränkt wurde. Kontaminierte Flächen sind mit Desinfektionsmittel zu reinigen.

3 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Biologische Arbeitsstoffe werden entsprechend dem von ihnen ausgehenden Infektionsrisiko in vier Risikogruppen eingeteilt: Risikogruppe 1: Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich ist, daß sie beim Menschen eine Krankheit verursachen. Bacillus subtilis, Clostridium pasteurianum, Escherichia coli K12, Micrococcus luteus, Mycobacterium phlei Risikogruppe 2: Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung des Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich;eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise möglich. Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa Risikogruppe 3: Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen können; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung möglich. Bacillus anthracis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Shigella dysenteria Risikogruppe 4: Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung ist unter Umständen groß; normalerweise ist eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung nicht möglich.

4 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Am Ende eines jeden Kurstages sollte der eigene Arbeitsbereich mit Flächendesinfektionsmittel gereinigt werden. Mikroorganismen sind in verschlossenen Gefäßen zu halten. Impfösen sind nach jeder Benutzung auszuglühen. Vor der Entsorgung müssen Mikroorganismen durch Autoklavieren inaktiviert werden (Entsorgungsbeutel). Beim Pipettieren mit Glaspipetten sind die zugehörigen Pipettierhilfen zu verwenden. Gebrauchte Pipetten sind in dafür vorbereitete Gefäße (nicht auf den Arbeitsplätzen, Vorsicht verd. Peressigsäure!) abzulegen. Beim Mikroskopieren mit dem 100er-Objektiv ist Immersionsöl zu verwenden (Achtung, dieses Öl muß als gesundheitsschädigend angesehen werden!). Vor dem Wechsel vom 100er zum 40er Objektiv ist das Öl mit einem Zellstofftuch vom Objektträger zu entfernen. Zum Reinigen des Objektivs ist ein weiches, fusselfreies Kleenex-Tuch zu verwenden, Objektive sind nicht mit Alkohol abzuwischen! Verletzungen und andere (auch Bagatell-) Zwischenfälle sind sofort dem Praktikumsleiter zu melden.

5 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Brenner nur bei Bedarf anstellen; Automatikpipetten; angegebenen Pipettierbereich beachten; nicht überdrehen Beimpfte Gefäße sind mit Datum, Inhalt und Zugehörigkeit (Gruppennummer) zu beschriften. Im Brandfall: Feuerlöscher, Brandmelder im Gang Türen schließen; nicht verschließen Fluchtwegeplan folgen; Sammelplatz für Neubau Biologie: Parkplatz

6 Wofür wird mikrobielle Diagnostik benötigt? Medizin: Identifizierung von Krankheitserregern optimale Therapie Lebensmittelanalytik: Identifizierung von Lebensmittelverderbern / Krankheitserregern Wasseranalytik: Nachweis fäkaler Verunreinigung von Trink- und Badewasser TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 6 von XYZ

7 Zielstellung Kennenlernen von Kriterien (Kenngrößen) zur Bestimmung der mikrobiologischen Wasserqualität Anwenden von Verfahren zur Überwachung der Wasserqualität auf unterschiedliche Wässer Auswertung und Interpretation der Ergebnisse Untersuchte Wasserproben: Bezeichnung TW EL BrW KA-ZL KA-AL BW Probe Trinkwasser Elbe Nähe Blaues Wunder Brunnenwasser Zulauf Kläranlage Kaditz Ablauf Kläranlage Kaditz Badeteich TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 7 von XYZ

8 Rechtliche Grundlagen Trinkwasser Novellierte Trinkwasserverordnung (TrinkwV) 2001; in Kraft getreten: regelt physikalische und chemische Anforderungen an das Trinkwasser regelt mikrobiologische Anforderungen an das Trinkwasser legt Aufbereitungsstoffe und Desinfektionsverfahren fest regelt die Überwachung der Wasserqualität TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 8 von XYZ

9 Mikrobiologische Parameter - Koloniezahl bei 22 C und 36 C - coliforme Bakterien und E. coli - Enterokokken - Clostridium perfringens - Pseudomonas aeruginosa - im Verdachtsfall Aeromonaden und Legionellen TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 9 von XYZ

10 Mikrobiologische Anforderungen an Trinkwasser nach TrinkwV (2001) Das Gesundheitsamt kann die Untersuchung weiterer Mikroorganismen z.b. Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa und Legionellen im Trinkwasser anordnen. TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 10 von XYZ

11 TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 11 von XYZ

12 Rechtliche Grundlagen Badegewässerrichtlinie Novellierte EU Richtlinie seit 2006, seit 2008 Umsetzung auf Länderebene regelt mikrobiologische Anforderungen an Badegewässer TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 12 von XYZ

13 Mikrobiologische Anforderungen an Badegewässer Parameter Enterokokken (KbE / 100 ml) E. coli (KbE / 100 ml) Enterokokken (KbE / 100 ml) E. coli (KbE / 100 ml) Ausgezeichnete Qualität Gute Qualität Ausreichende Qualität 200 (*) 400(*) 330 (**) 500 (*) 1000 (*) 900 (**) 100 (*) 200(*) 185 (**) 250 (*) 500 (*) 500 (**) Binnengewässer Küstengewässer * Auf Grundlage der 95% Perzentile ** Auf Grundlage der 90% Perzentile TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 13 von XYZ

14 Koloniezahlbestimmung Gußplattenverfahren Quantitative Erfassung von Bakterien 2 Ansätze pro Probe mit je 1 ml Mischen mit flüssigem (handwarmen) Nähragar Inkubation für 48 h bei 22 C / 36 C TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 14 von XYZ

15 Coliforme Keime und E. coli Familie der Enterobacteriaceae GRAM- Stäbchen Peritrich begeißelt Nicht Sporen bildend Cytochrom-c Oxidase negativ Vergären Laktose unter Gasbildung Vertreter: Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter E.coli = Fäkalkeim Kommt in hohen Konzentrationen in Warmblüter Fäkalien vor Vermehren sich nicht in der Umwelt TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 15 von XYZ

16 Nachweis Coliforme Keime und E. coli Nachweis über Selektivnährboden TTC-Agar mit Tergitol 7 Membranfiltrationsverfahren (100 ml Wasser; Filterporen 0,45 µm) Tergitol 7 hemmt GRAM+ Begleitflora Nachweis der Säurebildung durch Lactoseabbau (Bromthymolblau schlägt von grün nach gelb um) TTC-Reduktion zu Formazan durch Coliforme (außer E. coli!) TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 16 von XYZ

17 TTC-Tergitol 7 Agar TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 17 von XYZ

18 Bestimmung des Coli-Titers Titer = größte Verdünnungsstufe bzw. kleinste Wassermenge, bei der Wachstum /Fluoreszenz festgestellt werden kann. Flüssigkeitsanreicherung Medium: MUG-Laurylsulfatbouillon enthält Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid dieses wird bei Anwesenheit der ß-D-Glucuronidase hydrolysiert es entsteht ein blau fluoreszierendes Produkt Auswertung: Trübung durch Wachstum; Verdacht: E. coli /Coliforme vorhanden Fluoreszenz; Verdacht: E. coli vorhanden Anlegen von Subkulturen auf ENDO oder Tergitol-7-Agar verdächtige Einzelkolonien über die Bunte Reihe weiter identifizieren TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 18 von XYZ

19 Bestimmung des Coli-Titers Durch Zusatz von MUG zu DEV-Lactose kann zusätzlich auf Anwesenheit von E. coli (MUG- Abbau Fluoreszenz) geprüft werden. (Achtung: Einige E. coli-spezies zeigen keine Fluoreszenz) MPN-Verdünnungsreihe für coliforme Keime unter UV- Licht (360 nm) TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 19 von XYZ

20 Nachweis Coliforme Keime und E. coli Colilert -18/QuantiTray Prinzip: Defined Substrate Technology ONGP Gelbfärbung durch Coliforme (β-galactosidase) MUG Fluoreszenz durch E. coli (β-glucuronidase) Verfahren: 100 ml Probe + Colilert -18-Medium in QuantiTray 20 h Inkubation bei 36 C Auszählen gelber / fluoreszierender Felder Auswertung mittels MPN-Tabellen bzw. Software TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 20 von XYZ

21 Reagenz zur Probe hinzufügen Tray verschweißen und inkubieren Probenreagenz zum Tray geben Positive Probenvertiefungen zählen und MPN anhand der Tabelle/Calculator ermitteln TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 21 von XYZ

22 oder MPN-Tabelle TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 22 von XYZ

23 Fäkalstreptokokken Gram+, Katalase-, Resistent gegen hohe Salz-, Azid-, Gallekonzentrationen, Lancefield-Gruppe D wichtige Vertreter: Enterococcus avium, E. duvans, E. faecalis, E. faecium, außerdem Streptoccocus bovis, S. equinus Enterokokken kommen im Darm von Mensch und Tier vor Indikator für fäkale Verunreinigung vermehren sich im Wasser kaum, weisen eine deutlich höhere Umweltresistenz auf als die coliformen Keime (z.b. doppelt so resistent gegenüber Chlor wie E. coli), Enterokokken (vor allem E. faecalis) werden bei Harnwegs- und Wundinfektionen sowie Endokarditis isoliert. Nachweis mittels Flüssigkeitsanreicherungsverfahren Anreicherung in Azid-Glucose-Bouillon (Azid hemmt Gram negative Begleitflora) Aesculin-Galle-Agar Enterolert (basiert auf fluorogenem Methylumbelliferyl-beta-D-Glucosid) TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 23 von XYZ

24 Clostridium perfringens anaerob, stäbchenförmig und sporenbildend Sulfitreduzierer Vorkommen: ubiquitär, v.a. in Böden und tierischen und menschlichen Fäkalien Nachweis für fäkale Verunreinigung Erreger des Gasbrandes Kann zu schweren Durchfällen führen Enterotoxin (alpha-toxin) verändert Durchlässigkeit des Darmepithels Chlorresistente Sporen daher Einführung als bakteriologischer Parameter kann Vorkommen von Protozoen anzeigen (Cryptosporidium, Giardia) Nachweis über Membranfiltration und TSC-Agar Grenzwert TrinkwV 2001: 0 in 100 ml TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 24 von XYZ

25 Nachweis Clostridium perfringens 75 C, 10 min Abtöten vegetativer Zellen TSC-Agar enthält Tryptose, Sulfit, Eisen (III), Cycloserin und MUP (u.a.) Inkubation anaerob (Anaerobiertopf) Das Wachstum braun-schwarzer / fluoreszeierender Kolonien deutet auf Clostridien hin Bestätigungstests: aerobes / anaerobes Wachstum, CAMP-Test TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 25 von XYZ

26 Pseudomonas aeruginosa gramnegativ, stäbchenförmig, meist beweglich (lophotrich begeißelt) keine Sporenbildung, Cytochrom-c Oxidase + Pyocyanin, Pyorubrin, Fluorescein Vorkommen: ubiquitär, feuchtigkeitsliebend, geringe Nährstoffansprüche Darm von Mensch und Tier häufig im Abwasser, sowie kontaminierte Oberflächen und Trinkwasser Klinik: Magen- und Darmerkrankungen bei Kleinkindern oder generalisierten Infektionen bei geschwächten Personen Infektionen des Ohres (Schwimmerohr) oder der Haut bei unzureichender Badewasseraufbereitung TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 26 von XYZ

27 Nachweis von Pseudomonas aeruginosa Nachweis vorgeschrieben bei: Tafel- und Mineralwasser (0/250 ml) Im Verdachtsfall im Trinkwasser (0/100 ml) (Besorgnisgrundsatz!) Aufbereitung und Desinfektion von Schwimm- und Badebeckenwasser (0/100 ml) Diagnostik: Malachitgrün-Pepton-Bouillon Cetrimidagar - Cetrimid (N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid) dient der weitgehenden Hemmung der Begleitflora Bestätigung durch Farbstoffbildung (Chloroformausschüttellung), Oxidase-Test, ggf. API-20NE TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 27 von XYZ

28 Aeromonas gramnegativ, fakultativ anaerob, Kurzstäbchen geringe Nähstoffansprüche, keine Sporenbildung, Cytochrom-c Oxidase +, Katalase + Vorkommen: ubiquitär im Wasser, vor allem Oberflächen- und Abwasser, in teilweise hoher Konzentration (tlw. bis zu 30%) Klinik: Einige Arten sind human- und tierpathogen (Enterotoxin, Hämolysin, Endotoxin Gastroenteritis, Sepsis) Bedeutung in der Wasserhygiene: Anwesenheit in TW deutet auf eine nicht ausreichende Desinfektionswirkung hin Vorhandensein von durch Bakterien assimilierbarer Wasserinhaltsstoffe Hinweis auf Wiederverkeimungspotential TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 28 von XYZ

29 Nachweis von Aeromonaden 1) Anreicherung in Ampicillin-Dextrin-Bouillon Ziel: Flüssiganreicherung zur Überprüfung eines Aeromonasverdachtes enthält Ampicillin-β-Lactam-Antibiotika zur Hemmung der gramneg. Begleitflora; Verwertung von Dextrin Säurebildung Indikatorumschlag (Bromthymolblau) + Trübung durch Wachstum 2) Überimpfen auf Ampicillin-Dextrin-Agar Ziel: Bestätigung des Aeromonas-Verdachtes enthällt Penicillin β-lactam-antibiotika zur Hemmung der gramnegativen Begleitflora Dextrin wird von Aeromonaden unter Säurebildung verwertet TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 29 von XYZ

30 Nachweis von Aeromonaden 3) Weitere Bestätigungsrektionen von den beiden höchsten Verdünnungen mit positivem Ergebnis Überimpfen einer positiven Einzelkolonie auf NA (Platten teilen) Oxidase Grameigenschaften/Reinkultur Nachweis der Nichtverwertung von Laktose (Bouillon oder Platte) Fakultativ: Bunte Reihe (siehe Coliforme) API-20 NE TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 30 von XYZ

31 Enterale Viren und Virus-Indikatoren Zahlreiche fäkale Viren im Abwasser z.b. Adeno-, Rota-, Noroviren (Gastoenteritis, hohe Säuglingssterblichkeit v.a. in Entwicklungsländern) Direktnachweis i.d.r. nicht sinnvoll Indikatoren Darmflora assoziierte Bakteriophagen: Somatische Coliphagen TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 31 von XYZ

32 Nachweis Somatischer Coliphagen Verwendetes Verfahren: Wirt: Schichtagarverfahren E. coli Prinzip: Wasserprobe, Wirtskultur werden mit einem verflüssigten Weichagar vermischt und auf eine vorbereitete Agarplatte aufgebracht Wirtskultur bildet rasenartigen Bewuchs auf der Agarplatte durch das Vorhandensein von som. Coliphagen werden die Wirtszellen lysiert Plaquebildung TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 32 von XYZ

33 Nachweis Somatischer Coliphagen Auszählen der Plaques (Löcher) im E. coli - Rasen Berechnung der Plaque bildenden Einheiten (pfu) je ml Achtung! Plaques nicht mit Luftblasen im Agar verwechseln! TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 33 von XYZ

34 Biologischer Sauerstoffbedarf (BSB) O 2 TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 34 von XYZ

35 < 4 mg / l O 2 TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 35 von XYZ

36 Biologischer Sauerstoffbedarf (BSB) Manometrische Bestimmung Das zu untersuchende Wasser wird in eine Flasche eingebracht, wobei ein Großteil der Flasche mit Luft gefüllt bleibt. Die Flasche wird luftdicht verschlossen und der Druck in dem Gefäß mit einem Manometer bestimmt. Das entstehende CO 2 wird chemisch gebunden. (CO KOH H 2 O + K 2 CO 3 ). Der Sauerstoffverbrauch bewirkt eine Druckabnahme, woraus der Biologische Sauerstoffbedarf [mgl -1 ] errechnet werden kann. TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 36 von XYZ

37 Biologischer Sauerstoffbedarf (BSB) Messbedinungen Dauer 5 Tage in dieser Zeit wurde die Hauptmenge der organischen Stoffe abgebaut und Nitrifikation hat noch nicht eingesetzt. Temperatur 20 C da die mikrob. Aktivität stark von der Temperatur abhängt, ist eine einheitliche Messtemperatur notwendig. Dunkelheit- falls Algen im Wasser sind, würden diese unter Lichteinfluss Sauerstoff produzieren und die Messergebnisse verfälschen. ggf. ATH zudosieren (Endkonzentration in der Probe 5 mg/l ; ATH-Lösung: 1g/l benötigte ATH-Menge selber berechnen) TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 37 von XYZ

38 Biologischer Sauerstoffbedarf (BSB) BSB 5 ist abhängig von: Art und Konzentration der abzubauenden Stoffe Art, Zahl und Anpassung der Mikroorganismen Nährstoffangebot ph-wert Turbulenz Anwesenheit toxischer Stoffe (Hemmwirkung) TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 38 von XYZ

39 Wiederverkeimungspotential (Aufkeimung der autochtonen Bakterien, AAB) Ursachen einer Wiederverkeimung lange Verweilzeit im Rohrleitungssystem Restkeimgehalt Verfügbarkeit von Nährstoffen Biofilmbildung an Rohrleitungen Wirkungen Hygienische Anforderungen an TW können ohne zusätzliche Maßnahme nicht für den Verbraucher realisiert werden. Desinfektion Ziel Entfernen und/oder Abtöten von Mikroorganismen, insbesondere von Krankheitserregern durch physikalische oder chemische Verfahren. Bereitstellung eines hygienisch einwandfreien Trinkwassers bis hin zu Hauswasseranschlüssen und Armaturen Die Desinfektionsverfahren werden vom Bundesumweltamt festgelegt. TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 39 von XYZ

40 TU Dresden, Präsentationsname XYZ Folie 40 von XYZ