Genom-Editierung eine Goldgrube für die Pflanzenzüchtung?

Transkript

1 Genom-Editierung eine Goldgrube für die Pflanzenzüchtung? Franziska Turck Department of Plant Developmental Biology Max-Planck-Institute for Plant Breeding Research

2 Struktur des Vortrags Die Helden des CRISPR/Cas Vom bakteriellen Immunsystem zum gentechnologischen Werkzeug Beispiele von CRISPR/Cas Genom-Editierung in Pflanzen Zukünftige Entwicklungen Ein wenig Politik: gesetzliche Rahmenbedingungen 2

3 Jahre von Entdeckung zu Erkenntnis Salzproduktionstätte, bei Alicante Heimat von Francisco Mojica Haloferax mediteranei Francisco Mojica, Alicante 3

4 Jahre von Entdeckung zu Erkenntnis Clustered Regularly InterSpaced Palindromic Repeats 2 bahnbrechende Arbeiten von Francisco Mojica Mojica und Rodriguez-Valeria, Mol Biol 1993 Mojica et al., J Mol Evo

5 Brackwasser, Militär und Joghurt Lander, Cell 164, (2016) 5

6 : vom bakteriellen Immunsystem zum Geneditierungstool enforschung.de/de /startseite/ Giedrius Gasiunas et al. PNAS 2012;109: by National Academy of Sciences

7 Warum der Hype? 7

8 Biotool CRISPR/Cas in Version 1.0 Schnitt + Schlechte Reparatur, E = Mutation 8

9 Beistand für Pflanzen im Rüstungswettlauf Ernteausfall durch bakterielle Infektion Xanthomonas und Pseudomonas Stämme 9

10 Veränderung der TALE Bindingsstellen durch CRISPR in Zitrus Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) Citrus sinensis (süsse Orange) TALE-repeats = DNA Erkennung PthA Protein Transkriptions Aktivierungsdomäne EBE PthA CsLOB1 EBE: Effektor Bindungselement für PthA4 Citrus LOB1 = Anfälligkeitsgen 10

11 Wie funktioniert der Rüstungswettlauf zwischen Xanthomonas und Pflanzen? Hutin et al., Frontiers Plant Scie (2015) es/ /fpls /full 11

12 Veränderung der TALE Bindingsstellen durch CRISPR in Zitrus 4 verschiedene CRISPR/CAS Mutanten Anfälligkeitstest nach Tropfeninfektion mit Xanthomonas Peng et al., Plant Biotech Journal (2017) /pbi.12733/full 12

13 Mehltaubefall und mlo Mehltau Resistenz Von Mehltau befallener Weizen Bis zu 25% Ertragsausfall durch Mehltau bei Weizen und Gerste Von Mehltau befallener Wein Kann Totalausfall der Ernte bedeuten Eine Lösung 13

14 Die bessere Lösung: natürliche Resistenz gegen Mehltau wie bei der Gerste Mehltauresistenz der Gerste durch mlo Allele aus Äthiopien Arbeiten am MPIPZ (Department Paul Schulze Lefert) Mehltau benötigt MLO, um in die Pflanzenzellen zu gelangen MLO basierte Resistenz gegen Mehltau ist universell Mlo mlo Consonni et al. Nat Gen, nal/v38/n6/full/ng1806.html Büschges et al. Cell,

15 Europa backt Weizenbrot In Deutschland (2015) Weizen Gerste Weizen IGC International grains council 15

16 Viel Spass mit Weizen Emmer und Hartweizen Dinkel und Weichweizen Einkorn Wilder Spelzweizen Gänsefußgras Bild von der Webseite der Wissenschaftsscheune, mehr Info unter 16

17 Chinesische Forscher machen es vor nature biotechnology VOLUME 32 NUMBER 9 SEPTEMBER State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China. 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China. 17

18 Weizen entstand durch zwei unabhängige Hybridisierungen = 3 homeologe Gene für MLO TaMLO A TaMLO B TaMLO D Alle drei Gene konnten editiert werden Wang et al. Nature Biotech ( 2014) 18

19 Mehltauresistenz durch mlo im Weizen auf der Ochsentour Prof. Ralph Panstruga, RWTH Aachen In China hat man schon vor zwei Jahren resistente Weizensorten generiert. Aber dort gab es einen transgenen Ansatz. Und der ist hier in Europa nicht gewünscht. Acevedo-Garcia et al. Plant Biotechnol.J, Chemische Mutagenese Sommerweizenpopulation (Zusammenarbeit mit Pflanzenforschungsinstut in Rothamsted) Genomische DNA von 2020 M2 Pflanzen Suche nach induzierten Mutationen in 3 MLO Genen Kombination der Allele durch mehrfache Kreuzung und Rückkreuzung 19

20 Gluten-freier Weizen, ist das möglich? Proteinstruktur alpha Gliadin Insgesamt bis zu 100 Gene (incl Pseudogene) kodieren alpha-gliadin Gli-2 loci mit ca. 30 Genen je auf 6A, 6B und 6D 20

21 Zumindest fast Gluten-frei Analyse mutierter Gene in editierten Pflanzen Analyse Proteine im Weizenkorn Sanchez-Leon et al. Plant Biotech Journal (2017) 21

22 Viele natürliche Resistenzgene sind Gain-of-function Allele Landrasse Elitesorte Lösung 1 Einkreuzen Lösung 2 CRISPR/CAS Kaum Ertrag aber Resistenzgen Viel Ertrag aber kein Resistenzgen 5-8 Generationen, Einkreuzen und Rückkreuzen Jede Generation muss bonitiert werden Präzises Einfügen des Resistenzgen aus der Landrasse der orthologen Position im Genom der Elitesorte Cisgen statt Transgen Bilder von der Webseite der Wissenschaftsscheune 22

23 Wie bekommt man das Cisgen ins Genom? 23

24 Präzisionseditierung CRISPR/CAS in Version

25 Herbizidresistenz durch Mutation des ALS Gens RoundUp Monsanto LibertyLink Bayer 25

26 Herbizidresistenz durch Mutation des ALS Gens Sulfonyl Herbizide und Resistenzen 1.) Ursprüngliches Patent DuPont vor 30 Jahren 2.) inzwischen ca. 31 Derivate verschiedener Firmen, alle Inhibitoren des ALS Gens 3.) Meistverwendete Herbizidklasse weltweit 4.) Weltweit mehr als 100 Sulfonyl Resistente Un kräuter px 26

27 ALS Herbizidresistenz als Helfer im Labor ALS Locus in Reis sgrna1 GGGTATAGGTGCAATGGGAGG sgrna2 CCTATGATCCCAAGTGGGGGCGC Editierungskonstrukt sgrna1 CAS9 sgrna2 EcoRV V Editierter ALS Locus in Reis Herbizid resistenter Reis Sun et al. Molecular Plant

28 Auch die editierten Pflanzen waren einmal transgene Pflanzen muss das sein? 28

29 Wann ist eine transgene Pflanze (k)eine transgene Pflanze? T1 Selektion T2 T3 Selektion Cas9 +/- Edit +/+ oder +/- Cas9 +/- Cas9 -/- Edit +/? Edit +/? Regeneration T0 Cas9 +/- Cas9 +/+ Edit +/? Edit +/? Kein Transgen Edit +/+ 29

30 Problem CRISPR/Cas und Gene Drive Solange das CRISPR Konstrukt in der Pflanze verbleibt, werden Mutationen am Wildtyp Ziellokus induziert 30

31 Genomeditierung ohne stabile Integration des Cas9/sgRNA Vektors Cas9-sgRNA Komplex DNA sgrna und mrna Cas9 - keine Integration von fremder DNA möglich - Pflanze war nie transgen - Cas9 wahrscheinlich durch Gentechnik produziert - sgrna kann chemisch synthetisiert werden 4 Wochen 6 Wochen 1 Woche - keine Integration von fremder DNA möglich - RNAs können chemisch synthetisiert werden Verändert aus Jin et al Nature Plants

32 und wieder geben Chinesische Labore das Tempo vor Zielgen Weizensorte DNA oder RNA Selektion(+/ ) Anzahl der primären Transformationen Mutierte Pflanzen (%) Davon viele an beiden Allelen mutiert (%) Pflanzen ohne Transgen(%) TaGASR7 Bobwhite DNA/ 1, Kenong199 DNA/ TaGW2 Kenong199 DNA/ Kenong199 DNA/ Kenong199 RNA/ 1, Zhang et al. Nat Comm (2016) 32

33 und auch gleich mit praktischem Nutzen Genomeditierte Pflanzen sind kompakter bei gleichem Ertrag => Verhindert Umknicken auf dem Feld Zhang et al. Nat Comm (2016) Caixia Gao, State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Beijing 33

34 Ein Beispiel aus Mais Geneditierung nur durch Protein Target site Cas9 and grna delivery method Plants analysed Plants with mutated alleles Plants with biallelic mutations ALS Genedit MS45 DNA (4.0%) 29 (3.1%) MS45 offsite DNA (2.0%) 4 (0.4%) MS45 RNP 1, (3.7%) 9 (0.5%) MS45 offsite RNP 1,880 0 (0.0%) 0 (0.0%) LIG RNP (9.7%) 7 (0.9%) MS26 RNP (2.4%) 2 (0.3%) Svitashev et al. Nat. Comm, (2016) WT 34 ms45 Mutante

35 CRISPR/CAS Version 3.0 ALS Genedit Cas9-sgRNA Komplex WT-ALS R-ALS Behandlung mit Sulfonyl Herbizid DNA Oligonukleotid als Rekombinationsvorlage 35

36 Prozess versus Produkt basierte Regulierung 1990: Regulatorische Direktive unterscheidet zwischen konventionellen Methoden (inkl. chemisch induzierter Mutagenese) und Methoden, die rekombinante DNA verwenden (GMO). 2013: European Academies Science Advisory Council (EASAC) Bericht, in dem dafür plädiert wurde, zu einer produktbasierten Kategorisierung zu wechseln 2015: ESAC Empfehlung, Geneditierte Pflanzen ohne Fremd- DNA nicht zu regulieren 2015: Offener Brief der (NGOs), Geneditierte Pflanzen als GMO zu regulieren und die Regulierung zu verschärfen. 36

37 Die legale Situation: Auszüge aus Nature Editorial Februar 2017 China nicht vergessen! ECJ Entscheidung nicht vor 2018 erwartet Deutschland hat sich jetzt dahinter gehängt mit der eigenen Entscheidung Editierte Pflanzen ohne Fremd DNA werden erstmal nicht als GMO 37 reguliert

38 Wenn die Tanker an der Wand parken Editierte Pflanzen ohne Fremd DNA werden erstmal nicht als GMO reguliert 38

39 Japanische Forscher schlagen folgende legale Rahmenbedingungen vor Araki and Ishii, Trends in Plant Science(2015) 39

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