Anti-ssDNA ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Einzelstrang DNA (ssdna)
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- Elly Keller
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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-ssDNA ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Einzelstrang DNA (ssdna) Gebrauchsanweisung
2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 4 Lieferumfang des Tests... 5 Technische Daten... 5 Erforderliche Laborgeräte... 5 Vorbereitung der Reagenzien... 6 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 6 Technische Hinweise... 6 Assaydurchführung... 7 Auswertung der Ergebnisse... 8 Normalwerte... 8 Spezifität... 8 Sensitivität... 8 Kalibrierung... 8 Linearität... 8 Reproduzierbarkeit... 9 Literatur... 9 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Kurzanleitung
3 EINLEITUNG Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine chronische Multisystemerkrankung unbekannter Ätiologie, die durch einen vaskulitischen Organbefall charakterisiert ist. Im Vordergrund des Krankheitsbildes stehen Nierenbeteiligung (50%), Hautausschläge (70%), Arthralgie (90%), Beteiligung des ZNS (30%), Polyserositis und Zytopenien. Klinisch präsentiert sich dieser Prototyp einer systemischen Autoimmunerkrankung ausgesprochen heterogen, häufige Schübe und Remissionen sind typisch für dieses Krankheitsbild. In vielen Fällen beginnt der SLE mit ausgesprochen uncharakteristischen Allgemeinsymptomen, wie z.b. Fieber, Müdigkeit, Leistungsabfall, Schwellungen der Lymphknoten und Konzentrationsschwäche. Von allen Organbeteiligungen (ZNS, Haut, Herz, Lunge, Gastrointestinaltrakt) des systemischen Lupus erythematodes hat der Befall der Nieren den gravierendsten Einfluß auf die Prognose. Signifikant eingeschränkt ist die Lebenserwartung derjenigen Patienten, die bereits bei der Erstdiagnose mit einer eingeschränkten Nierenfunktion konfrontiert werden. In Anbetracht der Schwierigkeiten einer Diagnose "systemischer Lupus erythematodes" wurde im Jahre 1982 vom American College of Rheumatology (ACR) ein Schema mit insgesamt 11 Diagnosekriterien für den SLE herausgegeben. 1. Schmetterlingserythem - auf beiden Wangen 2. Diskoider Lupus - erythematöse, erhabene Flecken 3. Photosensitivität - nach Sonnenexposition rasch auftretender Hautausschlag 4. Schleimhautulzerationen - schmerzlose orale oder nasopharyngeale Ulzerationen 5. Arthritis - nicht-erosive Arthritis an mehr als zwei peripheren Gelenken 6. Serositis - dokumentierte Pleuritis oder Perikarditis 7. Glomerulonephritis - anhaltende Proteinurie > 0,5g/Tag oder Zylindrurie 8. neurologische Symptome - Krampfanfälle oder Psychosen 9. Hämatologische Befunde - immunhämolytische Anämie oder Leukopenie oder Lymphopenie oder Thrombozytopenie 10. Immunologische Befunde - positiver LE-Zell-Test oder dsdna-antikörper-nachweis oder Sm-Antikörper-Nachweis oder falsch positive Luesreaktion 11. Antinukleäre Antikörper - abnorm hoher ANA-Titer bei fehlender Einnahme von Medikamenten, die zu einem medikamenteninduzierten SLE führen können. Mindestens vier dieser Kriterien müssen gleichzeitig oder im Verlauf eines beliebigen Zeitraums vorhanden sein, um mit einer etwa 95%igen Wahrscheinlichkeit die Diagnose eines SLE stellen zu können. Unter den labordiagnostischen Parametern bildet der Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) auf der HEp-2 Zelle als serologische Eingangsdiagnostik einen der Grundpfeiler in der Diagnose des SLE. Ein weiterer Schritt bei der Diagnosesicherung ist die Untersuchung auf krankheitsspezifische Markerantikörper. Wie auch der Nachweis von ANA stellt der Nachweis von Autoantikörpern gegen die doppelsträngige Form der DNA (dsdna) ein weiteres ACR-Kriterium für die Lupus-Diagnostik dar. Diese Autoantikörper haben eine diagnostische Spezifität für den SLE von ca. 96% sowie eine diagnostische Sensitivität von ca. 91%. Antikörper gegen dsdna werden überwiegend in den aktiven Stadien eines SLE beobachtet. Im Gegensatz zu allen anderen antinukleären Antikörpern korreliert bei den dsdna Antikörpern die Höhe der Serumkonzentration sehr gut mit der Krankheitsaktivität. Anhand der Antikörperkonzentration läßt sich sowohl die Therapie kontrollieren als auch erneute Krankheitsschübe voraussehen. Autoantikörper gegen DNA lassen sich in zwei Gruppen einteilen: 1. Antikörper, die nur an Doppelstrang-DNA (dsdna) binden und 2. Antikörper, die auch an Einzelstrang-DNA (ssdna) zu binden vermögen. Antikörper gegen dsdna sind meistens gegen die Phosphateinheiten gerichtet. Daher können sie auch an Einzelstrang-DNA binden. Bei der quantitativen Bestimmung von Autoantikörpern gegen Doppelstrang-DNA muß daher sichergestellt werden, daß keine Einzelstrang-DNA Antikörper mit 3
4 erfaßt werden. Autoantikörper gegen einzelsträngige DNA dagegen sind überwiegend gegen die Basengruppen der DNA gerichtet, die bei nativer dsdna in der helikalen Struktur verborgen ist. Im Serum von SLE-Patienten werden ssdna-antikörper während akuter Schübe der Erkrankung mit einer Häufigkeit von bis zu 87 % und während inaktiver Phasen bei bis zu 43 % der Patienten beobachtet. SLE-ähnliche Krankheitsbilder können auch durch Medikamente induziert werden. Zur Differentialdiagnostik ist dabei die Bestimmung von ssdna Antikörpern sehr hilfreich. Bei mehr als 50% aller Patienten mit einem medikamenten-induziertem LE werden ssdna-ak gefunden. Daneben wurden erhöhte anti-ssdna Spiegel auch bei Mononukleosen, Hepatitis und verschiedenen Formen der Leukämie berichtet. Indikationen 1. Systemischen Lupus erythematodes 2. Medikamenten induzierter Lupus erythematodes 3. Therapiekontrolle METHODIK Das vorliegende Testbesteck ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Einzelstrang DNA (ssdna). Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit humaner, rekombinant hergestellter ssdna beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmun-gen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in den Standards, Kontrollen und in den Patientenproben werden an das immobilisierte Antigen in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 4
5 LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die beschichtet sind... 1 mit humaner, rekombinant hergestellter ssdna Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)... 1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat... 1 Fläschchen, 20 ml Konjugat... 1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig... je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:... je 1 Fläschchen, 1,5 ml 0-12, U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: U/ml Meßwellenlänge 450 nm Empfindlichkeit: 1 U/ml Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 5
6 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der ssdna Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 6
7 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 7
8 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Anti-ssDNA ELISA der folgende Wert ermittelt: Cut-off: 20 U/ml SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit humaner, rekombinant hergestellter Einzelstrang-DNA (ssdna) nach einem neu entwickelten, ladungsneutralen Verfahren beschichtet. Bei der Beschichtung bleibt die antigene Struktur unter Vermeidung von Doppelstrangsequenzen erhalten. Der Anti-ssDNA Kit erfaßt daher nur spezifisch Autoantikörper, die gegen ssdna gerichtet sind. SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze für Anti-ssDNA beträgt 1,0 U/ml. KALIBRIERUNG Die quantitativen Meßsysteme sind in relativen Einheiten kalibriert. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 8
9 REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianz des Anti-ssDNA Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen anti-ssdna Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianz wurden drei Proben mit unterschiedlichen anti-ssdna Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Intra-Assay Inter-Assay Proben Nr. Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) Proben Nr. Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) , , , , , ,8 LITERATUR 1. Bootsma, H., Spronk, P., Derksen, R. et.al. Prevention of relapse in systemic lupus erythematosus. Lancet, Vol. 345, ; Feltkamp, T.E.W., Kirkwood, T.B.L., Maini, R.N. und Aarden, L.A. The first international standard for antibodies to double stranded DNA. Ann. Rheum. Dis., Vol. 47, ; Isenberg, D.A., Ehrenstein, M., Longhurst, C. und Kalsi, J.K. The origin, sequence, structure, and consequences of developing anti-dna antibodies. Arthitis Rheum., Vol. 37, ; Kalden, J.R., Winkler, T.H. und F. Krapf Pathogenesis of SLE: immunopathology in man. Rheumatol. Int., Vol. 11, ; Pisetsky, D.S. Anti-DNA antibodies in systemic lupus erythematosus Rheum. Dis. Clin. North. Am., Vol. 37, ; Smeenk, R.J.T., Berden, J.H.M. und Swaak, A.J.G. dsdna antibodies in: Peter, J.B., Shoenfeld, Y. (Hrsg.), Autoantibodies, pp , Elesvier, Amsterdam, Stollar, B.D. Molecular analysis of anti-dna antibodies. FASEB J., Vol. 8, ; Tan, E.M., Cohen, A.S., Fries, J.F. et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum., Vol. 25, ; Wigand, R., Gottschalk, R., Kaltwasser, J.P. und Hoelzer, D. Nachweis von anti-dsdna-antikörpern: Vergleich der diagnostischen Effizienz eines ELISA mit rekombinantem humanen Antigen mit einem handelsüblichen ELISA und einem Crithidia luciliae-immunfluoreszenztest. J. Lab. Med., Vol. 50, ;
10 10. Wigand, R., Gottschalk, R., Kaltwasser, J.P. und Hoelzer, D. Zum dsdna-antikörpernachweis in der Diagnostik des Systemischen Lupus erythematodes. Vergleichende Untersuchungen zur diagnostischen Effizienz dreier ELISA- Verfahren mit unterschiedlichen Antigenen und einem Crithidia luciliae- Immunfluoreszenztest. Z. Rheumatol. Vol. 56, 53-62; 1997 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 10
11 KURZANLEITUNG 11
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