Anti-Parietalzellen ORG 531
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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-Parietalzellen ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen die H+/K+- ATPase der Parietalzellen Gebrauchsanweisung
2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 4 Lieferumfang des Tests... 4 Technische Daten... 5 Erforderliche Laborgeräte... 5 Vorbereitung der Reagenzien... 5 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 6 Technische Hinweise... 6 Assaydurchführung... 7 Auswertung der Ergebnisse... 8 Normalwerte... 8 Sensitivität... 8 Spezifität... 8 Kalibrierung... 8 Linearität... 8 Reproduzierbarkeit... 9 Literatur... 9 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen...10 Kurzanleitung
3 EINLEITUNG Zirkulierende Autoantikörper gegen die Parietalzellen des Magens in Patienten mit perniziöser Anämie wurden zuerst von Irvine et al mittels Komplement Fixationstestund anschließend anhand eines Immun-fluoresszenztest von Taylor et al 1962 beschrieben. Das entsprechende Autoantigen wurde den sekretorischen Canaliculi der Magenparietalzellen und den gastrischen Mikrosomen zugeordnet. Weitere biochemische und molekulare Untersuchungen identifizierten das Antigen als a- und b-untereinheit der Magen H+/K+-ATPase. Die H+/K+-ATPase der Parietalzellen (E.C ) ist ein Waserstoff-Ionen transportierendes Enzym und für die An-säuerung des Magenlumens verantwortlich. Dieses Enzym gehört zu einer Familie elektroneutraler P-Typen ATPasen, zu der ebenfalls die Na2+/K+ und die Ca2+ ATPase gehören. Das Parietalzellantigen besteht aus zwei Unter-einheiten, einer katalytischen transmembran a-untereinheit aus 1033 Aminosäuren und einer reich glykosylierten b-untereinheit aus 249 Aminosäuren. Die H+/K+-ATPase zeigt bezüglich ihrer Aminosäuresequenz einen hohen Kon-servierungsgrad innerhalb vieler Spezies Die perniziöse Anämie ist die wichtigsten Ursache einer Vitamin B12 Mangelerscheinung in der westlichen Welt. Langzeitstudien lassen vermuten, daß die perniziöse Anämie das Endstadium einer chronisch atrophischen Gastritis vom Typ A darstellt. Diese Erkrankung ist durch pathologische Läsionen des Fundus und Corpus des Magens, einer Atrophie der Magenschleimhaut, dem selektiven Verlust von Parietal- und in der Magenmukosa sowie einer lymphozytären Infiltration in die Submukosa charakterisiert. Die perniziöse Anämie ist in erster Linie eine Erkrankung weißer Nordeuropäer mittleren Alters, wobei Frauen wesentlich häufiger als Männer betroffen sind. Patienten, die an perniziöser Anämie leiden, zeigen eine blasse Gesichtsfarbe, sind depressiv und nur wenig leistungsfähig. Die perniziöse Anämie tritt meist vergesellschaftet mit anderen Erkrankungen auf, zumeist organspezifischen Autoimmunerkrankungen der endokrinen Drüsen, bei denen Autoantikörper gegen weitere gewebsspezifischen Antigene nachweisbar sind. Autoantikörper gegen die H+/K+-ATPase können mit Hilfe der Immunfluoreszenztechnik in % aller Patienten mit perniziöser Anämie gefunden werden, sind aber auch bei Gesunden (2-5 %) nachzuweisen. ELISA Testsysteme zeichnen sich durch eine Sensitivität von 80 % und durch eine Spezifität von über 90 % aus. Insgesamt können bei älteren Menschen häufiger Parietalzellen Autoantikörper nachgewiesen werden als bei jüngeren Menschen. Eine Studie, in der die Zusammenhänge zwischen dem Auftreten von Parietalzellantikörpern und der Morphologie der Magenschleimhaut untersucht wurde, ließ erkennen, daß alle Anti- Parietalzellen positiven Individuen in einer zufällig ausgesuchten Population tatsächlich an einer frühen Typ A Gastritis litten. Höhere Prävalenzraten von % können in Patienten mit autoimmunen Endokrinopathien, wie z.b. Thyreotoxikose, Thyereoiditis Hashimoto und insulinpflichtiger Diabetes mellitus nachgewiesen werden. Eine histologische Untersuchung von Magenbiopsien ergab, daß die Mehrheit aller Anti-Parietalzellen positiver Patienten ebenfalls an einer Typ A Gastritis litten. 3
4 METHODIK Das vorliegende Testbesteck ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen die H+/K+-ATPase der Parietalzellen. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit gereinigter, porciner H+/K+-ATPase beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei kleineren Serienlängen können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in Standards, Kontrollen und Patientenproben werden an die immobilisierten Antigene in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die mit...1 gereinigter H+/K+-ATPase aus Parietalzellen beschichtet sind Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)...1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat...1 Fläschchen, 20 ml Konjugat...1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig...1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig...1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig...je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml 0 6,3 12, U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat 4
5 TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: U/ml Empfindlichkeit: 1 U/ml Meßwellenlänge 450 nm Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. 5
6 Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der anti-parietalzellen Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 6
7 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 7
8 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem anti-parietalzellen ELISA die folgenden Werte ermittelt: Normal < 10 U/ml Erhöht 10 U/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze für anti-parietalzellen beträgt 0,5 U/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit hochgereinigter H+/K+-ATPase aus Schweine- Parietalzellen beschichtet. Der anti-parietalzellen Assay erfaßt spezifisch die gegen das Parietalzellantigen gerichteten Autoantikörper der IgG-Klasse. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem Anti-Parietalzellen ist in relativen Einheiten kalibriert. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 8
9 REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianzen des Anti-Parietalzellen Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianzen wurden drei Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Proben Nr. Intra-Assay Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) Proben Nr. Inter-Assay Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) 1 12,5 3,5 1 12,0 4,2 2 22,5 2,8 2 20,5 3,7 3 77,0 3,2 3 85,9 2,6 LITERATUR 1. Irvine, W. J., Davies, S. H., Delamore, I. W., Williams, A. W.. Immunological relationship between pernicious anemia and thyroid disease. Br. Med. J. 1962, pp Taylor, K. B., Roitt, I. M., Doniach, D., Couchman, K. G., Shapland, C.. Autoimmune phenomena in pernicious anemia: gastric antibodies. Br. Med. J. 1962, pp Rabon, E. C. and Reuben M. A.. The mechanism and structure of the gastric H/K-ATPase. Annu. Rev. Physiol. 1990, No. 52, pp Pedersen, P. L. and Carfoli, E.. Ion motive ATPases. I. Ubiquity properties and significance to cell function. Trends Biochem Sci 1987, No. 12, pp Van Driel, I. R., Callaghan, J. M.. Proton and potassium transport by H/K ATPases. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol Irvine, W. J., Cullen, D. R., Mawhinney, H.. Natural history of autoimmune achlorhydric atrophic gastritis. A 1-15 year follow up study. Lancet 1974, No. 2, pp Whittingham, S., Mackay, I. R.. Pernicious anemia and gastric atrophy. In: Rose, N. R., Mackay, I. R. eds. The Autoimmune Diseases. New York, Academic Press 1985, pp Uibo, R., Krohn, K., Villako, K., Tammur, T., Tamm, A.. The relationship of parietal cell, gastrin cell and thyroid autoantibodies to the state of the gastric mucosa in a population sample. Scand. J. Gastroenterol. 1984, No. 19, pp Varis, K., Ihamako, T., Harkonen, M., Samloff, I. M., Siurala, M.. Gastric morphology, function and immunology in first degree relatives of probands with pernicious anemia and controls. Scand. J. Gastroenterol. 1979, No. 14, pp
10 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 10
11 KURZANLEITUNG 11
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