M2-Antikörper: Wissenschaftliche und klinische Daten / Indikation...4

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1 INHALT Einführung in das Varelisa M2-Antikörper-Testprinzip...2 M2-Antikörper: Wissenschaftliche und klinische Daten / Indikation...4 Inhalt der Testpackung...6 Anzahl und Umfang der Testansätze...7 Testdurchführung...8 Vorbereitung der Reagenzien...8 Probenvorbereitung...8 Hinweise zur Assaydurchführung...8 Assaydurchführung...9 Testauswertung M2-Antikörper Normalbereich M2-Antikörper Assay-Charakteristika M2-Antikörper Kalibrierung Intra- / Interassay-Varianz Untere Nachweisgrenze Spezifität Linearitätsuntersuchung Qualitative Testauswertung Literatur Vorsichtsmaßnahmen

2 Einführung in das Varelisa M2-Antikörper-Testprinzip Varelisa M2-Antikörper ist ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex im Serum oder Plasma. Dieses Testbesteck realisiert das Prinzip des Heterogenen Solid Phase Enzymimmunoassays im Mikrotiterplattensystem, bei dem die Kavitäten mit dem Antigen beschichtet sind. Der Varelisa M2-Ak-Assay ist so konzipiert, daß nach der Bindung der M2-Antikörper im Serum ein zweiter Antikörper als Enzymkonjugat zur Ausbildung eines indirekt enzymmarkierten Antigen- Antikörper-Komplexes führt. Das Assay-Design dieses Varelisa M2-Ak-Testbesteckes erlaubt neben der herkömmlichen quantitativen Auswertung auch eine qualitative Auswertung des Assays. Der Varelisa M2-Antikörper-Assay besitzt die 510 k-zulassung der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA)

3 Der Varelisa M2-Antikörper-Assay ist als indirekt nichtkompetitiver ELISA aufgebaut. Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexe aus Mitochondrien, immobilisiert an den Wandungen der einzelnen Kavitäten, binden spezifisch M2-Antikörper in den Standards, Kontrollen und Patientenproben. Die an den Wandungen der Varelisa-Kavitäten gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe verbinden sich mit einem enzymmarkierten Anti-Human-IgG-Antikörper (Enzymkonjugat) zu einem indirekt enzymmarkierten Antigen- Antikörper-Komplex. Die enzymmarkierten Antigen-Antikörper- Komplexe setzen ein zugegebenes Substrat zu einer gefärbten Lösung um. Die Farbentwicklung des Chromogens ist abhängig von der im Komplex gebundenen Enzymkonjugatmenge und damit zu der gesuchten M2- Antikörper-Konzentration proportional. Die optische Dichte der einzelnen Kavitäten wird mit einem Plattenphotometer bei 450 nm gemessen

4 M2-Antikörper Wissenschaftliche und klinische Daten / Indikation Die primär-biliäre Zirrhose ist eine chronisch entzündliche Lebererkrankung, deren Frühstadium histologisch gekennzeichnet ist durch entzündliche Infiltrate in den Periportalfeldern, besonders im Bereich der septalen und interlobulären Gallengänge. Dieses Stadium geht über in eine langsam voranschreitende Zerstörung der kleinen und mittleren Gallengänge sowie deren Proliferation mit Fortschreiten zur Leberfibrose und im Endstadium kompletter Zirrhose. Die Erkrankung, die lange Zeit asymptomatisch verlaufen kann, manifestiert sich meistens zwischen dem 40. und 60. Lebensjahr, wobei Frauen sechs- bis zehnmal häufiger als Männer betroffen sind. Im Anfangsstadium einer PBC können unspezifische, stark variierende Allgemeinsymptome wie Müdigkeit, Juckreiz, rechtseitige Oberbauchbeschwerden, Sicca-Symptomatik, Darm- und Gallenkoliken auftreten (zur Diagnose der PBC vergleiche: Berg und Klein, 1990). Cholestase anzeigende Enzyme, g-gt, alkalische Phosphatase sowie 5 Nucleotidase werden bei biochemischen Laboruntersuchungen erhöht vorgefunden. PBC wird nach heutigem Wissensstand nicht vererbt, wenngleich mitunter eine familiäre Prädisposition beobachtet werden kann. Mit ca. 40 bis 80 Krankheitsfällen pro 1 Million Einwohner stellt PBC eine relativ seltene Erkrankung dar (etwa 2500 bis 5500 Fälle in der Bundesrepublik Deutschland). Unter den Indikationen für eine orthotope Lebertransplantation nimmt PBC in Europa die Führung ein (Bismuth et al., 1987). Wenngleich die Ätiologie der PBC weiterhin ungeklärt ist, wird die Annahme eines Autoimmungeschehens von einer Reihe positiver Evidenzen unterstützt. Zum einen kann PBC in Assoziation mit anderen Autoimmunerkrankungen auftreten (James et al., 1981), zum anderen ist PBC typischerweise gekennzeichnet durch das Auftreten von Autoantikörpern, die spezifisch gegen mitochondriale Targets gerichtet sind. Solche antimitochondrialen Antikörper (AMA) wurden zuerst mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenzmethode (IIF) an Cryostatschnitten, vor allem der distalen Epithelzellen der Nierentubuli, Parietalzellen des Magens und Schilddrüsenepithelzellen detektiert (Walker et al., 1965). Kurz darauf wurde auch das Komplementbindungsvermögen solcher PBC-Seren dokumentiert (Berg et al., 1967). Es zeigte sich jedoch bald, daß die diagnostische Spezifität der IIF-Methode dadurch eingeschränkt wird, daß sich auch eine Reihe anderer Krankheitsbilder AMA-positiv präsentieren, z. B. Syphilis, Myocarditis, undefinierte Kollagenosen und Drogen-induzierte Krankheitsgeschehen (Berg und Klein, 1987). Einen entscheidenden Fortschritt brachte die rasche Entwicklung neuer diagnostischer Verfahren, insbesondere auf dem Gebiet der Enzymimmunoassays und des Western Blots. Als geeignete Antigen- Präparation erwies sich z. B. eine aus Rinderherz-Mitochondrien gewonnene Fraktion, die zusammen mit dem F1-Anteil der ATP-Synthase von der inneren Mitochondrien-Membran nach Chloroform-Extraktion anfiel und als ATPase-assoziiertes Antigen M2 bezeichnet wurde (Berg et al., 1982; Lindenborn- Fotinos et al., 1982, 1985). Mittlerweile weiß man, daß keine der fünf Untereinheiten des F1-Anteils der ATP-Synthase zur M2-Antigenität beiträgt. Allerdings wurden noch weitere, mit PBC einhergehende AMA-Subtypen beschrieben, nämlich die mit unterschiedlichen Komponenten der äußeren Mitochondrien-Membran assoziierten M4- und M8-Antigene sowie das partiell organspezifische M9, welches ausschließlich im Zusammenhang mit PBC und dort besonders bei Frühstadien auftritt (Weber et al., 1986; Klein und Berg, 1988). Die weitere Analyse des M2-Antigens mittels der Western-Blot- Methode identifizierte vier mit der inneren Mitochondrien-Membran assoziierte Polypeptide, die vor kurzem auch auf cdna-ebene charakterisiert und als metabolisch eng miteinander verwandte Enzyme des mitochondrialen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDHC) identifiziert wurden (zur Übersicht siehe Berg und Klein, 1989; Mackay und Gershwin, 1989)

5 DIAGNOSE Primär-biliäre Zirrhose Infektionskrankheiten und Kollagenosen Syphilis Myocarditis Unbestimmte Kollagenosen Medikamenten-induzierte Krankheitsbilder Venocuran-induziertes Pseudolupus-Syndrom Iproniazid-induzierte Hepatitis Tab.1 Zuordnung der mitochondrialen Antikörper zu bestimmten Krankheitsbildern (nach Berg und Klein, 1989) AMA - TYP Anti-M2 Anti-M4 Anti-M8 Anti-M9 Anti-M1 Anti-M7 Anti-M5 Anti-M3 Anti-M6 Mitochondriale Antikörper Die Erstbeschreibung antimitochondrialer Antikörper bezieht sich auf IIF-Untersuchungen an Gefrierschnitten, wenn diese mit PBC-Seren inkubiert wurden (Walker et al., 1965). Mittlerweile unterscheidet man neun unterschiedliche AMA- Subklassen (M1 bis M9). Die Definitionskriterien implizieren eine enge Korrelation dieser M-Antikörper mit submitochondrialen Fraktionen, wie sie aus hochgereinigten Mitochondrien-Präparationen verschiedener Säugerspezies durch konventionelle Proteinreinigungsschritte gewonnen werden können (Berg und Klein, 1989). Abgesehen von der Tatsache, daß sämtliche M-Antigene Bestandteile der inneren oder äußeren Mitochondrien-Membran sein oder zumindest mit ihnen assoziiert sein sollen, ist außer für das M1- Antigen (Cardiolipin enthaltende Domänen der inneren Mitochondrien-Membran) und neuerdings für das M2-Antigen (PDHC, siehe unten) nur wenig über deren molekulare Natur bekannt. Die Beziehung der bisher beschriebenen AMA- Subklassen zu den korrespondierenden Krankheitsbildern geht aus Tab. 1 hervor. PBC-spezifische AMA-Typen Unter Zuhilfenahme verschiedener mitochondrialer Antigen- Präparationen (Material: Rinderherz, Rattenleber, Schweineniere) konnten in den Seren von PBC-Patienten im Komplement-Bindungstest, ELISA- und Western-Blot-Verfahren insgesamt vier unterschiedliche AMA-Subklassen nachgewiesen werden. Sie sind außerordentlich spezifisch für diese Krankheit. So findet man in 96 % aller PBC-Patienten M2- Antikörper (Berg und Klein, 1987; Berg et al., 1986). Werden PBC-Seren mit Fraktionen der äußeren Mitochondrien-Membran inkubiert, so lassen sich zwei weitere AMA-Typen ableiten, Anti-M4 und Anti-M8, die jedoch jeweils nur in Assoziation mit Anti-M2 auftreten. Sie sind beide durch die Komplement-Bindungsreaktion, nicht jedoch durch Western Blot nachweisbar (Weber et al., 1986). Besonderes Interesse fand in jüngster Zeit das M9/Anti-M9-System, das als spezieller Marker für die Frühdiagnose einer PBC gewertet wird (Klein und Berg 1988). Es zeigte sich nämlich, daß Antikörper gegen M9 bereits zu einem Zeitpunkt nachgewiesen werden können, zu dem noch keine Anti-M2-Aktivität vorliegen muß. Im Western Blot konnten als M9-spezifische Polypeptide zwei Banden mit 98 und 59 kda charakterisiert werden, die in Assoziation mit der äußeren Mitochondrien-Membran vorliegen. Molekularbiologische Untersuchungen zum M2-Antigen M2-Antikörper erkennen eine Gruppe von vier Proteinen (ca. 74, 52, 45 und 39 kda), die mit der inneren Mitochondrien- Membran assoziiert vorliegen und im gesamten Organismenreich vorgefunden werden, nämlich in Säuger- und Hefe- Mitochondrien sowie in Bakterien und Chloroplasten (Baum und Palmer, 1985). Mit Hilfe der rekombinanten Gen-Technologie war es in den letzten Jahren möglich, eine spezifische Identifikation der Antigene, basierend auf den korrespondierenden cdna-klonen, vorzunehmen (Gershwin et al., 1987; Coppel et al., 1988; Fussey et al., 1988; Surh et al., 1989). Dabei gelang die Charakterisierung von drei der vier M2-Antigene als E2-Enzyme folgender mitochondrialer Multi-Enzym-Komplexe: Pyruvat-Dehydrogenase (PDH-E2), verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase (branched3 chain 2-oxo acid dehydrogenase; BCODH-E2) und 2- Oxoglutarat-Dehydrogenase (OGDH-E2). Diese E2-Enzyme katalysieren den Transfer des jeweils decarboxylierten Restes vom E1-Enzym (Decarboxylase) auf Coenzym A. Biochemisch sind sie charakterisiert als Dihydrolipoyltransacetylasen mit Liponsäure als prosthetischer Gruppe. Die vierte M2- Komponente stellt das Protein X dar, das allein mit PDH assoziert vorliegt (zur Übersicht: Mackay und Gershwin, 1989). Aufgrund von Sequenzhomologien verschiedener rekombinanter M2-Proteine wurde ein immundominantes Autoepitop identifiziert (AS-Reste 83 bis 92; Van de Water et al., 1988b). Dieses Dekapeptid, das auch den die Liponsäure tragenden Lysinrest enthält, konnte die Bindung von PBC-Seren an das korrespondierende rekombinante M2- Antigen inhibieren. Weiterhin wurde auch die PDH-Enzymaktivität durch diese Autoimmunseren gehemmt (Van de Water et al., 1988a). Die Identifizierung von drei 2-Oxosäure- Dehydrogenase-Enzymen als Target-Antigene der PBC und deren Liponsäure-Lysin-Region als Autoepitope läßt hoffen, daß auch die molekulare Natur der bislang noch nicht näher charakterisierten M-Antigene (M4, M8, M9) schon in naher Zukunft aufgeklärt werden kann. Indikation: Primär-biliäre Zirrhose (PBC) Vorkommen von Antikörpern gegen den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex: bis zu 96 % bei Patienten mit PBC (nach Berg und Klein, 1990; Berg et al., 1986) - 5 -

6 Inhalt der Testpackung Standards: Positivkontrolle: Negativkontrolle: Waschpuffer: Probenpuffer: Konjugat: Enzymsubstrat: Stoplösung: Mikrotiterstrips: Packungsbeilage Kontrollzertifikat 6 Fläschchen M2-Antikörper Standardlösung in PBS (BSA, 0.1 % (w/v) Natriumazid und Humanserum in Natriumphosphat-puffer) in folgenden Konzentrationen: U/ml, je 1 ml, gebrauchsfertig 1 Fläschchen (roter Deckel) mit BSA, 0.1 % (w/v) Natriumazid und Human-serum in PBS, 1 ml, gebrauchsfertig 1 Fläschchen (roter Deckel) mit BSA, 0.1 % (w/v) Natriumazid und Human-serum in PBS, 1 ml, gebrauchsfertig 1 Fläschchen, 20x PBS Konzentrat (mit 0.1 % (w/v) Natriumazid), 50 ml 1 Fläschchen, 5x PBS Konzentrat (mit BSA und 0.1 % (w/v) Natriumazid), gelb eingefärbt, 20 ml 1 Fläschchen Anti-human-IgG-Peroxidase, 15 ml (rot eingefärbt), gebrauchsfertig 1 Fläschchen TMB (3,3,5,5 Tetramethylbenzidin), 15 ml, gebrauchsfertig 1 Fläschchen 0.5 M H 2 SO 4, 10 ml, gebrauchsfertig 12 (bzw. 6) Strips für jeweils 8 Bestimmungen mit abbrechbaren Kavitäten; verpackt in einem wiederverschließbaren Folienbeutel; beschichtet mit M2-Antigen 1 Halterahmen Zusätzlich benötigte Materialien: â Mikrotiterplatten-Photometer â destilliertes Wasser â Meßzylinder (20, 100, 1000 ml), ggf. Bechergläser â Präzisionspipetten (10, 50, 100, 1000 ml), ggf. Multipetten Bitte beachten Sie: â â Testkit bis zum Gebrauch im Kühlschrank lagern und vor Testbeginn auf Zimmertemperatur bringen. Der Testkit sollte vor dem jeweils aufgedruckten Verfallsdatum verbraucht werden

7 Anzahl und Umfang der Testansätze Der Varelisa M2-Antikörper-Assay ist für jeweils 96 oder 48 Bestimmungen konzipiert. Code-Nr. Anz. Bestimmungen (12 8 Kavitäten) (6 8 Kavitäten) Die Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 bzw. 6 einzelnen Strips zusammen, die ihrerseits wiederum aus 8 durch Sollbruchstellen voneinander separierbaren Kavitäten bestehen (Abb. 1). So können je nach Probenaufkommen unterschiedliche Testansätze zusammengestellt werden. Dieses System ermöglicht somit den variablen Einsatz der Varelisa Testbestecke bei quantitativen Nachweisen mit Einzel- oder Doppelbestimmungen der Proben oder qualitativen Analysen. + Zur computerunterstützten Testauswertung ist eine Software erhältlich. Abb. 1: Schematische Darstellung der Zusammenstellung eines individuellen Testansatzes Abb. 2 zeigt ein Beispiel eines quantitativen Testansatzes mit 5 Patientenseren. Standards (schwarz), Kontrollen (weiß, mit +/ gekennzeichnet) und Patientenproben (weiß, numeriert) werden dabei jeweils in Doppelbestimmungen durchgeführt

8 Testdurchführung Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur (18 25 C) durchgeführt. Vorbereitung der Reagenzien Mengenangaben für 1 Mikrotiterplatte (48 / 96 Bestimmungen) bzw. 1 Streifen (8 Bestimmungen) Waschpuffer: pro Platte: ê Waschpufferkonzentrat auf 1000 ml Endvolumen mit destilliertem Wasser auffüllen pro Streifen: ê 2 ml Waschpufferkonzentrat mit 38 ml destilliertem Wasser versetzen (bei 2 8 C 14 Tage haltbar) Probenpuffer: pro Platte: ê Probenpufferkonzentrat auf 100 ml Endvolumen mit destilliertem Wasser auffüllen pro Streifen: ê 1.5 ml Probenpufferkonzentrat mit 6 ml destilliertem Wasser versetzen (bei 2 8 C 14 Tage haltbar) Probenvorbereitung Die Serum- bzw. Plasmaproben werden mit Probenpuffer 1 : 101 verdünnt. o o Beispiel: Serum: 10 ml Probenpuffer: 1000 ml Probenmaterial, das länger als 24 Stunden nicht zum Einsatz kommt, sollte bei 20 C gelagert werden. In Probenpuffer verdünnte Serum- bzw. Plasmaproben können bei 2 8 C zwischen 48 und 72 Stunden gelagert werden. Hinweise zur Assaydurchführung o Den wiederverschließbaren Folienbeutel entlang der rechten Schweißnaht aufschneiden und die benötigte Anzahl Streifen bzw. Kavitäten im Halterahmen montieren (S. 7, Abb. 1). Die nicht benötigten Streifen / Kavitäten im Beutel bei 2 8 C aufbewahren. Zum Wiederverschließen des Beutels die Folie zweimal falten und anschließend auf den Klebestreifen drücken. o Zum manuellen Waschvorgang: 300 ml Waschpuffer in jede Kavität pipettieren, eine Minute einwirken lassen; in den zuletzt gefüllten Kavitäten den Waschpuffer mindestens 20 Sekunden einwirken lassen, anschließend leersaugen oder ausschütten. Waschpufferreste gründlich entfernen, indem der Rahmen mit den Streifen (Öffnung nach unten) mehrmals kräftig auf eine saugfähige Unterlage aufgeschlagen wird. o Zum Zeittakt: Die angegebenen Reaktionszeiten müssen eingehalten werden, um eine präzise Assaydurchführung sicherzustellen. Dabei sind die Pipettierschritte bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen

9 Assaydurchführung Vor dem ersten Reaktionsschritt die Kavitäten 1 mit Waschpuffer waschen (siehe Hinweise zur Assaydurchführung) ml Standards, Kontrollen und verdünnte Proben î 30 min inkubieren î î nach Ablauf der Reaktionszeit die Reagenzien aus den Kavitäten entfernen 3 x waschen ml Konjugat î 30 min inkubieren î î nach Ablauf der Reaktionszeit die Reagenzien aus den Kavitäten entfernen 3 x waschen ml Enzymsubstrat î 10 min an lichtgeschützter Stelle inkubieren 4 50 ml Stoplösung î î die Stoplösung in gleicher Reihenfolge wie das Enzymsubstrat pipettieren nach dem Abstoppen die Mikrotiterplatte leicht schütteln und die ODs innerhalb von 30 Minuten mit einem Mikrotiterplatten Photometer bei 450 nm bestimmen! - 9 -

10 Testauswertung M2-Antikörper Die Standardkurve resultiert aus der Interpolation der Meßpunkte, die sich aus den OD/ODmax-Werten (in %) und dem Logarithmus der M2-Antikörper- Standardkonzentrationen (in U/ml) ergibt (Spline Approximation). Die Konzentrationen der Patientenproben können so anhand der gemessenen ODs berechnet werden. Für die computerunterstützte Auswertung steht eine Software zur Verfügung. OD / ODmax % Die Abbildung zeigt ein Beispiel einer typischen Standardkurve für die Auswertung des M2- Antikörper-Assays. Die zugrundeliegenden Meßdaten sind unten dargestellt. Bei jeder Testdurchführung muß eine neue Standardkurve erstellt werden. M2-Ak [U/ml] Standard U/ml OD OD OD/ODmax % VK % / / / / / /

11 Normalbereich M2-Antikörper Häufigkeitsverteilung M2-Antikörper Blutspenderkollektiv n: 1211 : 1.3 U/ml +2s: 4.5 U/ml Median: 1.2 U/ml 95% Percentile: 3.1 U/ml Häufigkeit M2-Ak [U/ml] Bitte beachten Sie, daß die M2-Antikörper-Werte in einem Blutspenderkollektiv einer log-normalen Verteilung unterliegen. Entsprechend ist auch die Abszisse logarithmisch unterteilt. Für die Bewertung der Patientenseren schlagen wir den folgenden Normbereich vor, wie er auch bei der Evaluierung eines Kontrollkollektivs (n=1211; siehe Grafik oben) bestätigt wurde. Normal < 5 U/ml

12 Assay-Charakteristika M2-Ak Kalibrierung Die Kalibrierung des M2-Antikörper-Assays erfolgte gegen eine humane IgG-Fraktion, die spezifisch gegen eine hochgereinigte M2-Präparation (Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex aus Mitochondrien) gerichtet ist, in relativen Einheiten. Intra- und Inter- Assay-Varianz Zur Kontrolle der Assaypräzision wurde mit 3 Seren in verschiedenen Bereichen der Standardkurve die Intra- und Interassay-Varianz ermittelt (Konzentrationsangaben in U/ml). INTRA n=28 Assay - Varianz Mittelwert ( ) Standardabweichung (s) VK % Probe Probe Probe INTER n=112 Assay - Varianz Mittelwert ( ) Standardabweichung (s) VK % Probe Probe Probe

13 Untere Nachweisgrenze Die kleinste eindeutig nachweisbare Antikörperkonzentration liegt im Varelisa M2-Ak-Assay bei 0.1 U/ml. Spezifität Linearität Der Varelisa M2-Antikörper-Assay weist gegen das Antigen gerichtete IgG-Antikörper nach. Eine Interferenz des Tests mit Cardiolipin-Antikörpern und Rheumafaktoren wurde nicht festgestellt. Von Patientenproben mit erhöhtem M2-Antikörpertiter wurden zur Linearitätsbestimmung des Assays Verdünnungsexperimente durchgeführt. Die Verdünnung erfolgte im Probenpuffer. Die folgende Grafik stellt das zugrundeliegende Prinzip dar. M2-Ak [U/ml] Serumvolumen [ml] Serumverdünnung 1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 8 Meßergebnis [U/ml]

14 Qualitative Testauswertung Durch die Verwendung der Positivkontrolle als Kalibrator besteht die Möglichkeit, dieses Testbesteck auch als qualitativen Assay anzusetzen und auszuwerten. Bei einem qualitativen Assay werden die optischen Dichten (OD) der Patientenproben mit den optischen Dichten eines Cut-off (Grenzwert) verglichen. Alle Proben, deren optische Dichte kleiner ist als der Cut-off, werden als negativ, alle Proben mit optischen Dichten größer oder gleich dem Cut-off, werden als positiv bewertet. Qualitativer Testansatz Die nebenstehende Abbildung zeigt ein mögliches Pipettierschema für 27 Patientenseren; Positivkontrolle = Kalibrator (+), Negativkontrolle ( ), Patientenproben (1 27). A B C D E Zur computerunterstützten Testauswertung ist eine Software erhältlich. F G H Qualitative Testauswertung Der individuelle Cut-off des Varelisa Assays basiert auf Untersuchungen mit umfangreichen Kontrollkollektiven. Die statistischen Auswertungen dieser Daten erlaubt, den Grenzwert sehr genau festzulegen. Aus praktischen Gründen wird im Varelisa Assay die optische Dichte des Cut-off mit Hilfe einer Positivkontrolle ( = Kalibrator) bestimmt. Aus diesem Grund wird für jede Positivkontrolle ein Faktor angegeben, mit dessen Hilfe man die optische Dichte des Cut-off berechnen kann. Den Faktor für diese Berechnung entnehmen Sie bitte dem jedem Testkit beiliegenden Kontrollzertifikat. OD cut-off = OD Kalibrator Faktor Beispiel: OD Kalibrator = Faktor = 0.5 OD Cut-off = = Die optische Dichte des Cut-off beträgt in diesem Beispiel Um eine graduelle Abschätzung des Ergebnisses vornehmen zu können, ist die Berechnung einer Ratio sinnvoll: Ratio = OD Probe / OD Cut-off Wir empfehlen Ihnen, folgende Bewertung der Ratios vorzunehmen: Ratio < 1.0 negativer Befund Ratio grenzwertiger Befund Ratio > 1.4 positiver Befund

15 Literatur 1. Baum, H., Palmer, C. (1985) The PBC-specific antigen Mol. Aspects Med. 8, Berg, P.A., Doniach, D., Roitt, I.M. (1967) Mitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis J. Exp. Med. 126, Berg, P.A., Klein, R., Lindenborn-Fotinos, J., Klöppel, W. (1982) ATPase-associated antigen (M2): Marker antigen for serological diagnosis of primary biliary cirrhosis Lancet, Berg, P.A., Klein, R., Lindenborn-Fotinos, J. (1986) Antimitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis J. Hepatol. 2, Berg, P.A., Klein, R. (1987) Immunology of primary biliary cirrhosis Baillière s Clin. Gastroenterol. 1, Berg, P.A., Klein, R. (1989) Heterogeneity of antimitochondrial antibodies Semin. in Liver Dis. 9, Berg, P.A., Klein, R. (1990) Diagnose der primär-biliären Zirrhose In-Vitro Diagnostica Nachrichten 1, Bismuth, H., Castaing, D., Ericzon, B.G., et al. (1987) Hepatic transplantation in Europe - First Report of the European Liver Transplant Registry Lancet, Coppel, R.L., McNeilage, L.J., Surh, C.D., et al. (1988) Primary structure of the human M2 mitochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis: dihydrolipoamide acetyltransferase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, Fussey, S.P.M., Guest, J.R., James, O.F.W., et al. (1988) Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, Gershwin, M.E., Mackay, I.R., Sturgess, A., Coppel, R.L. (1987) Identification and specificity of a cdna encoding the 70 kd mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis J. Immunol. 138, James, O., Macklon, A.F., Watson, A.J. (1981) Primary biliary cirrhosis - A revised clinical spectrum Lancet, Klein, R., Berg, P.A. (1988) Characterization of a new mitochondrial antigen-antibody system (M9/anti-M9) in patients with anti-m2 positive and anti-m2 negative primary biliary cirrhosis Clin. Exp. Immunol. 74, Lindenborn-Fotinos, J., Sayers, T.J., Berg, P.A. (1982) Mitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis. VI. Association of the complement fixing antigen with a component of the mitochondrial F1-ATPase complex Clin. Exp. Immunol. 50,

16 15. Lindenborn-Fotinos, J., Baum, H., Berg, P.A. (1985) Mitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis. Species and nonspecies specific determinants of M2 antigen Hepatology 5, Mackay, I.R., Gershwin, M.E. (1989) Molecular basis of mitochondrial autoreactivity in primary biliary cirrhosis Immunol. Today 10, Surh, C.D., Danner, D.J., Ahmed, A., et al. (1989) Reactivity of primary biliary cirrhosis sera with human fetal liver cdna clone of branched-chain a-keto acid dehydrogenase dihydrolipoamide acyltransferase, the 52 kd mitochondrial autoantigen Hepatology 9, Van de Water, J., Fregeau, D., Davis, P., et al. (1988a) Autoantibodies of primary biliary cirrhosis recognize dihydrolipoamide acetyltransferase and inhibit enzyme function J. Immunol. 141, Van de Water, J., Gershwin, M.E., Leung, P., et al. (1988b) The autoepitope of the 74-kD mitochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis corresponds to the functional site of dihydrolipoamide acetyltransferase J. Exp. Med. 167, Walker, J.G., Doniach, D., Roitt, I.M., Sherlock, S. (1965) Serological tests in diagnosis of primary biliary cirrhosis Lancet, Weber, P., Brenner, J., Stechemesser, E., et al. (1986) Characterization and clinical relevance of a new complement-fixing antibody - anti-m8 - in patients with primary biliary cirrhosis Hepatology 6, Vorsichtsmaßnahmen Nur zur invitro-diagnostik. Nicht für innere oder externe Anwendung bei Mensch und Tier. Reagenzien nicht nach dem Verfallsdatum benutzen. Dieser Testansatz enthält Reagenzien, die aus humanen Blutbestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsmaterialien wurden mit Immunoassaymethoden auf das Hepatitis B Oberflächenantigen und Antikörper gegen HIV1, HIV2 und Hepatitis C Virus mit negativem Ergebnis untersucht. Dennoch sollten die Vorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit Blutderivaten beachtet werden. Bitte beachten Sie die HHS-Publikation Nr. (CDC) oder entsprechende lokale/nationale Vorschriften. Die Bestandteile dieses Testkits und Reste dürfen nicht in Kontakt mit Wiederkäuern oder Schweinen kommen. ACHTUNG! Einige Kitbestandteile enthalten Natriumazid (NaN 3 ) als Konservierungsmittel. Natriumazid kann mit Blei- und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Spülen Sie die Leitungen beim Verwerfen mit viel Wasser, um einer Azidbildung vorzubeugen. Beachten Sie bitte die vom US Center for Disease Control oder die örtlich/national empfohlenen Dekontaminationsverfahren. Die Stoplösung enthält 0.5 M Schwefelsäure