Personalisierte Medizin basierend auf mehr als nur Gentests: Transkriptomik. Proteomik. Metabolomik. Dr. Christina Ludwig

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1 Personalisierte Medizin basierend auf mehr als nur Gentests: Transkriptomik Proteomik Metabolomik Dr. Christina Ludwig ETH Zürich, Institut für Systembiologie, Arbeitsgruppe Professor Ruedi Aebersold

2 Übersicht Einführung: DNA RNA Proteine Metabolite Wo werden Proteine bereits heute in der personalisierten Medizin eingesetzt? Beispiel: Leukämie-Typisierung Beispiel: Her2-positiver Brustkrebs Proteomik und personalisierte Medizin in der Zukunft?! Proteinnetzwerke Massenspektrometrie Beispiel: Everolimus Take-home Messages 1

3 Übersicht Einführung: DNA RNA Proteine Metabolite Wo werden Proteine bereits heute in der personalisierten Medizin eingesetzt? Beispiel: Leukämie-Typisierung Beispiel: Her2-positiver Brustkrebs Proteomik und personalisierte Medizin in der Zukunft?! Proteinnetzwerke Massenspektrometrie Beispiel: Everolimus Take-home Messages 1

4 Genotyp ist nicht gleich Phänotyp Umwelteinflüsse Lebensgewohnheiten Mikrobiom Blackbox DNA, Gene Genotyp (Gesamtheit der Erbeigenschaften) Phänotyp (sichtbare Eigenschaften, z.b. Augenfarbe, Haarfarbe, Krankheitsbilder, etc.) Kennen wir den Genotyp einer Person dann kennen wir dessen Phänotyp 2

5 Genotyp ist nicht gleich Phänotyp Transkription Translation DNA (Gene) RNA (Transkripte) Proteine (Eiweisse) Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp 3

6 Omiks : Bestimmung der Gesamtheit verschiedener Molekülklassen Transkription Translation DNA (Gene) RNA (Transkripte) Proteine (Eiweisse) Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp Genom Transkriptom Proteom Metabolom Genomik Transkriptomik Proteomik Metabolomik 3

7 Der komplexe Weg von DNA zum Phänotyp Transkription Translation DNA (Gene) RNA (Transkripte) Proteine (Eiweisse) Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp Sprache: 4 Nukleinbasen ATCG Sprache: 4 Nukleinbasen AUCG 20 Aminosäuren ca chemische Verbindungen 3

8 Der komplexe Weg von DNA zum Phänotyp DNA (Gene) RNA (Transkripte) Proteine (Eiweisse) Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp Die DNA ist der Bauplan des Lebens, er bestimmt was theoretisch alles in einer Zelle passieren kann. Die RNA ist eine Kopie des Bauplans, und zwar von solchen Genen die gerade akut in der Zelle benötigt werden. Die Proteine sind die Bausteine des Lebens sie bestimmen was tatsächlich in einer Zelle passiert. Die Metabolite sind wie die Fingerabdrücke von allen ablaufenden zellulären Prozessen, und zeigen das Geschehen innerhalb der Zelle. 4

9 Genomik existiert bereits heute im grossen Stil Dezember 2012: Die Englische Regierung plant die komplette Sequenzierung von Menschen. 2012: Das Pekinger Genominstitut berichtet von der Sequenzierung 1 Millionen menschlicher Genome. Unsere Gene lassen sich technisch leichter messen als unsere Proteine. Warum?!? 5

10 Proteomik Ein komplexes Forschungsfeld Transkription Translation DNA (Gene) ca humane Gene RNA (Transkripte) ca Transkripte Proteine (Eiweisse) > Proteinformen Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp alternatives Spleissen Posttranslationale Modifikationen Das Genom ist konstant und in allen Zellen gleich Das Proteom ist dynamisch und verändert sich in fast jeder Zelle ständig 6

11 Proteomik Ein komplexes Forschungsfeld Transkription Translation DNA (Gene) ca humane Gene RNA (Transkripte) ca Transkripte Proteine (Eiweisse) > Proteinformen Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp alternatives Spleissen Posttranslationale Modifikationen Das Genom ist konstant und in allen Zellen gleich Das Proteom ist dynamisch und verändert sich in fast jeder Zelle ständig 6

12 Proteomik Ein komplexes Forschungsfeld Transkription Translation DNA (Gene) ca humane Gene RNA (Transkripte) ca Transkripte Proteine (Eiweisse) > Proteinformen Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp alternatives Spleissen Posttranslationale Modifikationen Komplexität 6

13 Proteomik Ein komplexes Forschungsfeld Transkription Translation DNA (Gene) ca humane Gene RNA (Transkripte) ca Transkripte Proteine (Eiweisse) > Proteinformen Metabolite (Stoffwechselprodukte) Phänotyp alternatives Spleissen Posttranslationale Modifikationen Für die personalisierte Medizin der Zukunft reicht es nicht den Bauplan (Gene) unseres Lebens zu kennen, stattdessen müssen wir das fertige Gebäude mit all seinen Bausteinen kennen und verstehen WIE, WO und WANN diese Bausteine zusammengesetzt werden. 6

14 Übersicht Einführung: DNA RNA Proteine Metabolite Wo werden Proteine bereits heute in der personalisierten Medizin eingesetzt? Beispiel: Leukämie-Typisierung Beispiel: Her2-positiver Brustkrebs Proteomik und personalisierte Medizin in Zukunft?! Proteinnetzwerke Massenspektrometrie Beispiel: Everolimus Take-home Messages 1

15 Proteine machen den Unterschied: Leukämie-Typisierung Vor 100 Jahren Vor 80 Jahren Krankheit des Blutes Überlebensrate nach 5 Jahre ~ 0% Vor 60 Jahren Heute Leukämie (Blutkrebs) oder maligne Lymphome (Lymphdrüsenkrebs) Chronische, akute oder Pre- Leukämie Indolente Lymphome Aggressive Lymphome 38 Leukämie Typen: 51 Lymphom Typen: Acute myeloid leukemia ( 12 types) Mature B-cell lymphomas ( 14 types) Acute lymphoblastic leukemia (2 types) Mature T-cell lymphomas (15 types) Acute promyelocytic leukemia (2 types) Plasma cell neoplasm (3 types) Acute monocytic leukemia (2 types) Immature (precursor) lymphomas (2 types) Acute erythroid leukemia (2 types) Hodgkin s lymphoma (5 types) Acute megakaryoblastic leukemia Immunodeficiency associated lymphomas ( 5 types) Acute myelomonocytic leukemia (2 types) Other hematolymphoid neoplasms ( 7 types) Chronic myeloid leukemia Chronic myeloproliferative disorders (5 types) Myelodysplastic syndromes (6 types) Mixed myeloproliferative/myelodysplastic syndromes (3 types) 70% Zytomorphologie, Zytochemie, Zytogenetik, Molekulargenetik, Immunphänotypisierung 7

16 Leukämiezellen-Typisierung durch Oberflächenproteine Typ A Typ B Typ C verschiedene Leukämiezellen Typen wenig Protein wenig Protein wenig Protein kein Protein kein Protein wenig Protein viel Protein kein Protein kein Protein Farbstoff Antikörper Oberflächen-Protein Mikroskop Typ A Typ B Typ C 8

17 Ein Protein macht den Unterschied: Her2 positiver Brustkrebs Her2 = human epidermal growth factor Receptor 2 Her2 ist ein Rezeptor, der die Zellen zum Wachstum stimuliert indem er Paare bildet (dimerisiert) Ca. 20% aller Brustkrebspatientinnen sind Her2-positiv Der Tumor zeigt eine erhöhte Konzentration des Proteins Her2 an der Krebszellen Oberfläche 9

18 Ein Protein macht den Unterschied: Her2 positiver Brustkrebs Her2 = human epidermal growth factor Receptor 2 Her2 ist ein Rezeptor, der die Zellen zum Wachstum stimuliert indem er Paare bildet (dimerisiert) Ca. 20% aller Brustkrebspatientinnen sind Her2-positiv Der Tumor zeigt eine erhöhte Konzentration des Proteins Her2 an der Krebszellen Oberfläche Das Medikament Herceptin (Trastuzumab) ist ein Antikörper gegen den Her2 Rezeptor der ihn bindet und so die Dimerisierung verhindert Krebswachstum wird gestoppt Herceptin wirkt nur bei Her2-positiven Patientinnen, darum wird bereits seit 2000 in einem diagnostischen Vortest auf Her2 getestet. 9

19 Übersicht Einführung: DNA RNA Proteine Metabolite Wo werden Proteine bereits heute in der personalisierten Medizin eingesetzt? Beispiel: Leukämie-Typisierung Beispiel: Her2-positiver Brustkrebs Proteomik und personalisierte Medizin in Zukunft?! Proteinnetzwerke Massenspektrometrie Beispiel: Everolimus Take-home Messages 1

20 Proteine sind keine Einzelkämpfer 10

21 Proteine sind in Netzwerken organisiert = soziale Netzwerk Protein haben Freunde mit denen sie in engem Kontakt stehen (sie leiten Informationen weiter, Weiterverarbeiten das Reaktionsprodukt eines Freundes, etc.) Veränderungen eines Proteins können im Netzwerk gepuffert werden Nicht ein einziges oder wenige Proteine reichen aus um einen Phänotyp (z.b. eine Krankheit) zu beschreiben Stattdessen muss man das ganze Netzwerk in seiner aktuellen Zusammensetzung kennen, um den akuten Phänotyp zu bestimmen 10

22 Mittels globaler Analyse das System besser verstehen Es ist ein Fön! Es ist ein Speer! Es ist eine Wand! Es ist ein Seil! Es ist eine Schlange! Es ist ein Baum! 11

23 Apoptose Netzwerk Akt Netzwerk Selbstmordprogramm Regulation Zellwachstum, Zellteilung, Zellstoffwechsel p53 Netzwerk Inhibition Metalloproteasen Kontrolle Zellzyklus Wachstum von Blutgefässen, Wundheilung Zellteilung Migration EGF Netzwerk Regulation Zellwachstum, Zellteilung VEGF Netzwerk Wachstum von Blutgefässen 12

24 Selektive Medikamente für verschiedene Proteinnetzwerke Selektive Medikamente zur Chemotherapie Gefitinib, Erlotinib, Cetuximab : EGFR Lapatinib : HER2 Trastuzumab : HER2, EGFR Bevacizumab : VEGF Sunitinib : PDGFR, KIT, VEGFR Sorafenib : Raf, PDGFR, KIT, VEGFR Imatinib : Bcr-Abl, PDGFR, KIT Rituximab, Ibritumomab : CD20 Bortezomib : Proteasome Wachstums- faktor- Rezeptoren EGFR HER2 VEGFR Bcr-Abl Raf Zielproteine VEGF Wachstumsfaktor PDGFR Signalweg Zellteilung Zellwachstum KIT CD20 Proteasome 13

25 Eine Vision der personalisierten Medizin in der Zukunft Auswahl an selektiven Medikamenten Medikament 1 Personalisierte Medizin Patient A Diagnose der Proteinnetzwerke Medikament 2 Patient B Medikament 3 Medikament 4 Patient C Medikament 5 14

26 Wie können Proteine detektiert und analysiert werden? Westernblotting Affinitätspurifikation Antikörper (ELISA) Chromatographie Gelelektrophorese NMR-Spektroskopie Elektronenmikroskopie Immunphänotypisierung Immunhistochemie Massenspektometrie Fluoreszente Markierung Edman Abbau Genetische Mutationen Biochemische Assays Mikroskopie Immunpurifikation Röntgenkristallographie 15

27 Wie können Proteine detektiert und analysiert werden? Westernblotting Affinitätspurifikation Antikörper (ELISA) Chromatographie Gelelektrophorese NMR-Spektroskopie Elektronenmikroskopie Immunphänotypisierung Immunhistochemie Leukämie-Typisierung Her2-Brustkrebs Massenspektometrie Fluoreszente Markierung Edman Abbau Genetische Mutationen Biochemische Assays Mikroskopie Immunpurifikation Röntgenkristallographie 15

28 Wie können Proteine detektiert und analysiert werden? Westernblotting Affinitätspurifikation Antikörper (ELISA) Chromatographie Gelelektrophorese NMR-Spektroskopie Elektronenmikroskopie Immunphänotypisierung Leukämie-Typisierung Immunhistochemie Her2-Brustkrebs Massenspektometrie Fluoreszente Markierung Sehr viele Proteine gleichzeitig messen Proteine in ihrem Aktivitätszustand messen (Konzentration, Modifikationen, Interaktionspartner, ) Edman Abbau Biochemische Assays Mikroskopie Immunpurifikation Röntgenkristallographie 15

29 Wie funktioniert ein Massenspektrometer (sehr vereinfacht)? Massenspektrometer = Waage Proteine werden mit Hilfe eines Enzyms in kleine Teilstücke geschnitten (Peptide). Das Massenspektrometer wiegt diese Peptide und fragmentiert sie in ihre Aminosäure-Bestandteile. P E P T I D Auf diese Weise kann die Aminosäureabfolge der Peptide bestimmt werden. Mittels der identifizierten Peptide kann Auskunft darüber gegeben werden, welche Proteine in der Probe vorhanden sind. Anhand der gemessenen Signalstärke kann gleichzeitig die Proteinmenge in der Probe bestimmt werden. 16

30 Das Massenspektrometer Time of flight (TOF) Massenspektrometer ionisierte Protein-Moleküle schwere Ionen leichte Ionen Vakuumkammer Zeitmessung Detector Intensität Masse/Ladung Enorme technische Fortschritte in der Empfindlichkeit, dem Durchsatz und der Messgenauigkeit von Massenspektrometern. Heute können mehrere tausend Proteine gleichzeitig in einer einzigen Proteinprobe (z.b. Blut oder Urin) gemessen und quantifiziert werden. 17

31 Eine Vision in Ansätzen bereits Wirklichkeit Auswahl an selektiven Medikamenten Medikament 1 Personalisierte Medizin Patient A Diagnose der Proteinnetzwerke Medikament 2 Patient B Medikament 3 Medikament 4 Patient C Medikament 5 18

32 Everolimus klinische Phase-II-Studie PI3K/AKT/mTOR Signalnetzwerk 19

33 Everolimus klinische Phase-II-Studie Bestimmung der Konzentration von 37 Proteinen des Akt-Netzwerk Massenspektrometrie Gruppe von Patienten mit Prostata-Krebs (37) 12 Wochen Behandlung mit Everolimus (Afinitor) Templeton, A. J. et al. Phase 2 Trial of Single-agent Everolimus in Chemotherapy-naive Patients with Castration-resistant Prostate Cancer (SAKK 08/08). Eur Urol (2013). doi: /j.eururo

34 Everolimus klinische Phase-II-Studie Bestimmung der Konzentration von 37 Proteinen des Akt-Netzwerk Massenspektrometrie Gruppe von Patienten mit Prostata-Krebs (37) 12 Wochen Behandlung mit Everolimus (Afinitor) Proteinkonzentration, ng/ml NEIN JA spricht auf die Therapie an Überleben mit deutlich reduziertem Tumorwachstum (13) Templeton, A. J. et al. Phase 2 Trial of Single-agent Everolimus in Chemotherapy-naive Patients with Castration-resistant Prostate Cancer (SAKK 08/08). Eur Urol (2013). doi: /j.eururo

35 Everolimus klinische Phase-II-Studie Bestimmung der Konzentration von 37 Proteinen des Akt-Netzwerk Massenspektrometrie Gruppe von Patienten mit Prostata-Krebs (37) 12 Wochen Behandlung mit Everolimus (Afinitor) Proteinkonzentration, ng/ml NEIN JA spricht auf die Therapie an Eine Kombination von Proteinmarkern kann dabei helfen die Patientengruppe zu definieren, die am besten auf eine Therapie anspricht. Templeton, A. J. et al. Phase 2 Trial of Single-agent Everolimus in Chemotherapy-naive Patients with Castration-resistant Prostate Cancer (SAKK 08/08). Eur Urol (2013). doi: /j.eururo

36 Take-home Messages DNA, Gene Viele Krankheiten können nicht alleine aufgrund unserer Gene erklärt oder verstanden werden. Der Weg vom Genotyp zum Phänotyp ist kompliziert und bislang nur teilweise verstanden: DNA RNA Protein Metabolit Blackbox Proteine sind die Bausteine des Lebens und an der Regulation fast aller zellulären Prozesse beteiligt. Durch eine Analyse der Proteine kann der Zustand (Phänotyp) einer Zelle direkt gemessen werden. Proteine arbeiten immer in Teams und Netzwerken. Oft reicht es nicht ein einziges Protein zu messen, sondern man muss das ganze Netzwerk kennen. Medikament 1 Medikament 2 Medikament 3 Medikament 4 Medikament 5 Für die personalisierte Medizin in der Zukunft wird es entscheidend sein, dass wir den Status unserer Proteinnetzwerke kennen und dementsprechend spezifische Medikamente einsetzten können. Weder Proteomik noch Genomik alleine sind die Lösung! Idealer Weise sollten wir die Informationen aus verschiedenen Wissenschaften kombinieren Genomik Transkriptomik Proteomik Metabolomik etc. 21

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38 Beispiel Metabolomiks: Bluttest soll Alzheimer-Risiko voraussagen April 2014

39 Personalized molecular-targeted chemotherapy based on Quantitative Proteomics 55-year-old / Man / brain tumor 18.0 VEGF expressing (Immunohistochemistry) VEGFR1 expressing Bevacizumab (Avastin ) 35-year-old / Man / brain tumor 20.0 PDGFRα overexpressing c-kit overexpressing Sunitinib (Sutent ) Average expression in cases of glioblastoma patients Quantitative value (fmol/μg protein) ULQ ULQ ULQ ULQ ULQ Quantitative value (fmol/μg protein) ULQ ULQ ULQ ULQ ULQ ULQ MRI showed remarkable effect of bevacizumab. MRI showed effect of sunitinib.