Diss. ETH Nr. 10368 Identification and characterization of the L2/HNK-1 carbohydrate binding site on laminin responsible for the L2/HNK-1 carbohydrate mediated neural cell adhesion ABHANDLUNG Zur Erlangung des Titels DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von: Heike Hall Dipl. Biologin, Westfälische Wilhelms Universität Münster, Qermany geboren am: 28.12.1963 in Oberhausen/ Rheinland, Germany Angenommen auf Antrag von: Prof. Dr. Melitta Schachner, Referent Dr. Lloyd Vaughan, Koreferent 1993
1 1. Kurzfassung Das Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das auf der Zelloberfläche exponierte L2/HNK-1 Kohlenhydrat als Ligand für die Zelladhäsion an Laminin, ein funktionell wichtiges Molekül der extrazellulären Matrix, dient. Kleine Kleinhirnneuronen vom 6. Tag nach der Geburt und embryonale Astrozyten wurden auf verschiedenen Substraten, die in der Festphase immobilisiert wurden, in Kurzzeitadhäsionsexperimenten eingesetzt um die L2/HNK-1 Kohlenhydrat vermittelte Zelladhäsion zu untersuchen. Es konnte zunächst gezeigt werden, daß diese Zellen nicht an das L2/HNK-1 Kohlenhydrat adhärieren, wenn es in der Festphase immobilisiert vorliegt. Das deutet darauf hin, besitzen. daß diese Zellen keinen Rezeptor für dieses Kohlenhydrat Hingegen konnte gezeigt werden, daß das auf der Zelloberfläche exponierte L2/HNK-1 Kohlenhydrat ein Ligand für die spezifische Adhäsion neuraler Zellen an Laminin ist. Die Zelladhäsion an Laminin konnte durch die Anwesenheit des L2/HNK-1 Glykolipids, der Fab Fragmente des monoklonalen Antikörpers gegen das L2/HNK-1 Kohlenhydrat und partiell ebenfalls durch Heparin inhibiert werden. Es war aber nicht möglich, die Zelladhäsion an Laminin durch Sulfatide oder neutrale Ganglioside zu inhibieren. Erste Hinweise, daß die Bindungsstellen für das L2/HNK-1 Kohlenhydrat und Heparin auf Laminin unterschiedlich sein könnten, wurden aus Inhibitionsexperimenten gewonnen, in denen eine Kombination von Inhibitoren verwendet wurde. Heparin wurde in der Sättigung und Fab Fragmente des monoklonalen Antikörpers gegen das L2/HNK-1 Kohlenhydrat in verschiedenen nicht sättigenden Konzentrationen eingesetzt. Verglichen mit der Inhibition, welche in der Gegenwart der einzelnen Komponenten erzielt wurde, zeigte die kombinierte Applikation des Heparins mit den Fab Fragmenten des monoklonalen Antikörpers gegen das L2/HNK-1 Kohlenhydrat einen eindeutig additiven Effekt der Inhibition der Zelladhäsion an Laminin. Diese Ergebnisse veranlaßten uns, eine Bindungsstelle für das L2/HNK-1 Kohlenhydrat auf Laminin zu postulieren, die sich von den Bindungsstellen für Heparin und Sulfatid unterscheiden sollte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden L2/HNK-1 Kohlenhydrat tragende Neoglykoproteine konstruiert, wobei das L2/HNK-1 Kohlenhydrat, welches enzymatisch aus dem Glycolipid freigesetzt wurde, kovalent an Rinderserumalbumin gekoppelt wurde. Diese L2/HNK-1 Neoglykoproteine wurden mit Laminin inkubiert und die sich bildenden Komplexe wurden im Transmissions Elektronenmikroskop nach Rotationsbedampfung analysiert.
2 Diese Untersuchungen ergaben eine einzige Bindungsstelle für das L2/HNK-1 Kohlenhydrat auf der terminalen globulären Domäne der Laminin A-Kette. Um die Lokalisation dieser Bindungsstelle zu bestätigen und zu charakterisieren, wurden direkte Bindungsstudien zwischen dem L2/HNK-1 Glykolipid und nativen, sowie denaturierten Lamininfragmenten durchgeführt. Das L2/HNK-1 Glykolipid bindet unabhängig von der Anwesenheit von Ca2+ an native und denaturierte Lamininfragmente, die die zweite G-Domäne der terminalen globulären Domäne der Laminin A-Kette enthalten. Das sind die Fragmente E8, G1-5 and G1-3. Somit unterscheidet sich die L2/HNK-1 Kohlenhydrat Bindungstelle auf Laminin eindeutig von den Bindungstellen für Heparin und für Sulfatid, welche auf dem E3 Lamininfragment lokalisiert sind. Weiterhin wurde eine Peptidsequenz (Aminosäurereste: 2431-2451) aus der zweiten G-Domäne der terminalen globulären Domäne der Laminin A-Kette definiert, die die Bindung zwischen dem L2/HNK-1 Glykolipid und Laminin unter Sättigungsbedingungen bis zu 65% inhibiert. Hieraus läßt sich postulieren, daß insbesondere diese Peptidsequenz der zweiten G-Domäne der terminalen globulären Domäne der A-Kette an der Bindung des L2/HNK-1 Kohlenhydrates an Laminin beteiligt ist. Zeiladhäsionsexperimente, die auf diesen Lamininfragmenten durchgeführt wurden zeigten, daß auch die kleinen Kleinhirnneuronen dieselbe Stelle für die L2/HNK-1 Kohlenhydrat vermittelte Zelladhäsion verwenden.
3 2. Summgry The project of this thesis was to investigate whether the L2/HNK-1 carbohydrate expressed on different neural cell types is a ligand for cell adhesion to laminin, a functional important molecule of the extracellular matrix. Early postnatal small cerebellar neurons and embryonic astrocytes were used in Short term adhesion assays to characterize the L2/HNK-1 carbohydrate mediated cell adhesion. It could be shown that these cells do not adhere to the L2/HNK-1 carbohydrate in a substrate-bound form, indicating that these cells do not have a receptor for this carbohydrate. However, it turned out that the cell surface expressed L2/HNK-1 carbohydrate is a ligand for specific neural cell adhesion to laminin. The cell adhesion to laminin could be inhibited in the presence of the L2/HNK-1 glycolipid, Fab fragments of the monoclonal antibody against the L2/HNK-1 carbohydrate and to some extent also by heparin. However, it could not be inhibited neither in the presence of sulfatides nor in the presence of neutral gangliosides. First indications, that the binding Sites for the L2/HNK-1 carbohydrate and heparin might be different were obtained from inhibition experiments where heparin was used in saturating conditions and Fab fragments of the monoclonal antibody against the L2/HNK-1 carbohydrate in different non saturating concentrations. A clearly additive effect of inhibition on cell adhesion to laminin compared to the inhibition caused by the Single components was observed. From these results we concluded that it should be possible to define a binding site for the L2/HNK-1 carbohydrate on laminin which should be different from binding Sites for heparin and sulfatides. To confirm this hypothesis, L2/HNK-1 carbohydrate containing neoglycoproteins were constructed by covalently coupling the L2/HNK-1 carbohydrate, which was enzymatically liberated from the L2/HNK-1 glycolipid, to bovine serum albumin. These L2/HNK-1 neoglycoproteins were incubated with laminin and the complexes formed between laminin and the L2/HNK-1 neoglycoproteins were analyzed in transmission electron microscopy after rotary shadowing. These studies revealed one Single binding site for the L2/HNK-1 carbohydrate on the terminal globular domain of the laminin A-chain. To confirm and further characterize the localization of the binding site native and denatured laminin fragments were used in direct binding studies with the L2/HNK-1 glycolipid. The L2/HNK-1 glycolipid binds Ca 2+ independently to native and denatured laminin fragments comprising the second of the five G-domains of the terminal globular
4 domain formed by the laminin A-chain. These fragments are E8, G1-5 and G1-3. This localizes the L2/HNK-1 carbohydrate binding site unequivocally different from heparin and sulfatide binding Sites on laminin which are localized on the E3 fragment. Furthermore, a peptide sequence (residues 2431-2451) from the second G- domain of the terminal globular domain of the laminin A-chain could be defined, which inhibits the binding of the L2/HNK-1 glycolipid to laminin in saturating concentrations up to 65 %. Therefore, we suggest that this peptide sequence localized in the second G-domain of the terminal globular domain of the laminin A-chain is involved in L2/HNK-1 carbohydrate binding to laminin. Cell adhesion experiments on laminin and laminin fragments revealed that also early small cerebellar neurons use this L2/HNK-1 carbohydrate binding site for L2/HNK-1 carbohydrate mediated cell adhesion.