Diss ETH No. 15229 Multiregulated Multigene Interventions to Engineer Specific Mammalian Cell Phenotypes A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology Zürich for the degree of Doctor of Natural Seiences Presented by Iris Kornelia Fux Dipl. Natw. ETH born 17.08.1967 citizen of St.Niklaus (VS) Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Martin Fussenegger Prof. Dr. Bernard Witholt
3 Zusammenfassung Anwendungen in der Biotechnologie, in der in vitro Generierung von künstlichen Geweben und in der Gentherapie benötigen im zunehmendem Masse die kontrollierte Expression von mehr als einem Gen. In dieser Arbeit haben wir verschiedene Technologien entwickelt, die die konstitutive und regulierte Expression von bis zu drei Genen in Säugerzellen ermöglichen. Tricistronische Expressionsvektoren, wie die ptrident Familie, erlauben die konstitutive oder regulierbare Expression von drei Genen gesteuert durch einen einzelnen Promotor und mit Hilfe von IRES Elementen (IRES; Interne Ribosomale Eintrittsstellen). Die Effizienz der IRES abhängigen Translation des zweiten und dritten Genes ist oft tiefer verglichen mit der "cap-abhänigen" Translation des ersten Genes. Um die Expressionkapazität der tricistronischen Vektoren zu steigern, haben wir die üblichen polioviralen IRES Elemente durch ein neues kurzes und starkes Gtx IRES Element ausgetauscht. Dadurch konnte die Expressioneffizienz des dritten Genes gesteigert werden. In einem nächsten Schritt haben wir die Klonierungsflexibiliät der tricistronischen Vektoren erhöht, indem wir selten schneidende Erkennungsstellen für homing Endonukleasen einfügt haben. Die regulierte Expression von Genen stellt in der modernen Säugerzellen Expressiontechnik ein wichtiges Instrument dar. Wir haben daher ein Streptograminbasierendes Regulationssytem (Pip System) für Säugerzellen entwickelt, welches, ausgelöst durch das Antibiotikum Pristinamycin, die Regulation von einem gewünschten Gen erlaubt. Das Pip System zeigt ein exzellentes Regulationsverhalten in einer Vielzahl von Zellen so auch in menschlichen Zellen. Durch die Verwendung des klinisch lizenzierten Pristinamycins (enthalten in Pyostacin ) hat das Pip System einen grossen Vorteil gegenüber den meisten Regulationsystem, da es problemlos für gentherapeutische Behandlungsmethoden eingesetzt werden kann. Gewisse Ansätze in der Gentherapie oder der biopharmazeutischen Produktion erfordern eine gleich hohe Expression sowie Regulation von zwei verschiedenen Genen. Wir konstruierten daher zwei bidirektionale Expressioneinheiten, die Pristinamycin-basierende bidirektionale Expressionskassette und die Erythromycin regulierbare bidirektionale Expressionseinheit. Eine solche bidirektional Expressionseinheit erlaubt die synchronisierte Expression und Regulation von zwei Genen durch eine zentrale Operatorsequenz mit zwei
4 divergierenden minimalen Promotoren. Beide bidirektionalen System zeigten hervorragende Regulationscharakteristika in verschiedenen Zellenlinien, eine humane Zelllinie eingeschlossen. Das Erythromycin gesteuerte bidrektionale Expressionssystem konnte zudem mit grossen Erfolg für Experimente von Mäusen eingesetzt werden. Besser ausgeklügelte Strategien in der Genetherapie und in der in vitro Etablierung von Gewebekulturen beinhalten die unabhänige Regulation von zwei Gen-sets um zum Beispiel eine komplete Proliferationkontrolle zu erzielen oder Differenzierungs/Dedifferenzierungs-Prozesse zu kontrollieren. Um dieses Ziel zu ereichen, entwickelten wir ein dual-reguliertes System, eine Kombination des häufig benutzten Tetracyclin-regulierbaren Systems und des Pip Systems. Wir konnten die Möglichkeit der unabhängigen Regulation von zwei Genen für die Kombinationen GenAa/GenBan, GenAa/GenB ab, GenAab/GenB an und GenAa/GenBab zeigen. Zu diesem Zweck konstruierten wir verschiedene Vektoren, die die regulierbaren Promotoren in verschieden Anordnungen zueinander enthalten. Das beste Reguliationsverhalten zeigte die Anordnung bei der die Promotoren konvergent (7~) zueinander standen. Dieses dual-regulierte Konzept konnten wir mit Erfolg einsetzten um eine komplette Proliferationskontrolle in CRO Zellen (Chinese hamster ovary cells) zu erzielen. p27 Kip1 zeigte sich dabei als idealer Partner um einerseits die verstärkte Proliferation (in antisense Orientierung) und anderseits den Wachstumsstopp (in sense Orientierung) in Zellen zu erreichen. Bei einer weiteren neuartigen Anwendung des dual-regulierten Systems konnten wir C2C12 Mäusemyoblasten, durch regulierte Expression von myod und msxl, in Adipozyten, Osteoblasten und Myotubes transdifferenzieren. msxl transdifferenzierte die Myoblasten zum grössten Teil in Osteoblasten, myod differenzierte sie in Myotubes und myod und msxl zusammen förderten die Adipozytenbildung. Diese Anwendung zeigt das hohe Potenial der Dual-regulation für zukünftige Gentherapieansätze und in vitro Generierung von künstlichen Geweben. Abschliessend konnten wir mit Erfolg das dual-regulierte System in C2C12 Myoblasten einsetzen, um die Role der zwei Differenzierungsfaktoren C/EBP-a und BMP-2 in der Adipozyten- und Osteoblasten Differenzierung zu untersuchen. Unsere Arbeit zeigte erstmals, dass C/EBP-a exprimierende Myoblasten nicht nur in Adipozyten sondern auch in Osteoblasten transdifferenzieren können. BMP-2 verstärkte dabei zusammen mit C/EBP-a die Adipozytenbildung aber reduzierte die Osteoblastenbildung. Diese Resultate zeigten zusätzlich, dass die Dual-regulation in der Grundlagenforschung hervorragend eingesetzt werden kann.
5 Abstract Applications in biotechnology, tissue engineering and gene therapy require controlled expression of more than one gene. In this study, we have developed technologies for constitutive or regulated expression of up to three genes in mammalian cells. Tricistronic expression vectors like the ptrident family enable constitutive and regulated expression of three genes from a single promoter using internal ribosome entry site (IRES). The IRES-dependent expression levels of the second and third gene in a tricistronic expression vector are often lower than cap-dependent expression level of the first cistron. To improve the expression capacity of tricistronic configurations, we replaced the commonly used picornaviral IRES element by a new ultra short and strong Gtx IRES, which increased the expression level of the third gene. In a next step we enhanced the cloning flexibility of the tricistronic expression vectors by introducing rare cutting recognition sites for homing endonucleases. Advanced applications in mammalian expression technology require the regulated expression of genes. Therefore, we designed a streptogramin-responsive mammalian regulation system (Pip system), which enables the regulation of a desired transgene by the antibiotic pristinamycin. The Pip system demonstrated excellent regulation performance in a variety of different cell lines, including human ones. The use of the clinically licensed drug pristinamycin (ingredient of pyostacin ) is a big advantage of the PIP system, allowing its use for gene therapy applications. Some applications in gene therapy and biopharmaceutical production require equal expression and regulation levels of two genes. Hence, we constructed the pristinamycin-based bidirectional expression cassette as well as an erythromycin-adjustable bidirectional expression unit, which enable synchronised expression and regulation of two genes by a central operator sequence linked to two divergently oriented minimal promoters. Both bidrectional expression systems showed excellent regulation characteristics in different, mammalian and human celllines. The erythromycin-adjustable bidirectional expression units were shown function in mice. Sophisticated strategies in gene therapy and tissue engineering are based on the independent regulation of two sets of genes to manage complete proliferation control or differentiation/dedifferentiation processes. We therefore designed a dual-regulated mammalian expression system, by combining the widely used tetracycline-controlled and the
6 Pip regulation systems. We demonstrated the possibility to independently regulate two genes in one cell to achieve GenAo/GenBon' GenAon/GenBoff' GenAof/GenBon and GenAor/GenBoff statuses. For that purpose we constructed a variety of vectors harbouring two adjustable promoters in different arrangements to each other. The convergent (~ ~) arrangement showed the best regulation performance. This new dual-regulation concept was successfully implemented for complete proliferation management in Chinese hamster ovary cells (CHO). p27 KiPl was thought to be an ideal control gene to engineer enhanced proliferation (in antisense orientation) and growth arrest (in sense orientation). Furthermore, we used the dualregulation system to transdifferentiate C2C12 myoblasts by regulated myod and msxl expression into adipocytes, osteoblasts and myotubes. msxl transdifferentiates myoblasts into osteoblasts, myod differentiates them into myotubes. myod and msxl together cooperate on the formation of adipocytes. This application exemplifies the potential of the dual-regulation for future gene therapy and tissue engineering approaches. Finally, we successfully applied the dual-regulation system to investigate the role of the two differentiation factors CIEBP-u and BMP-2 in differentiating C2C12 myoblast cells into adipocytes and osteoblasts. Our work demonstrated for the first time, that C/EBP-u differentiates myoblasts not only into adipocytes but also into osteoblasts, whereas BMP-2, together with CIEBP-u, enhances the formation of adipocytes while reducing osteoblasts formation. These results indicate, that the dual-regulated concept can be used for basic research.