Aus dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit substituierter Enzyme (Proteasen und Amylasen) am Modelltier pankreasgangligiertes Minischwein INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Caroline Becker aus Witzenhausen Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. E. große Beilage Tag der mündlichen Prüfung: 15. November 2005
Meinem Vater und Großvater
Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 16 2 SCHRIFTTUM 18 2.1 Überblick zur Verdauung vom Kohlenhydraten und Proteinen 18 2.1.1 Kohlenhydrat- bzw. Stärkeverdauung 18 2.1.2 Proteinverdauung 20 2.1.3 Mikrobieller Abbau von Nährstoffen (Praecaecale Verdaulichkeit versus Gesamtverdaulichkeit) 21 2.2 Die Magen-Darm-Motorik sowie Fütterungseinflüsse auf die Chymuspassage 22 2.2.1 Physiologie der Magen-Darm-Motorik 22 2.2.1.1 Magen 22 2.2.1.2 Dünndarm 24 2.2.1.3 Dickdarm 25 2.2.2. Einflüsse der Ration auf die Chymuspassage (Passagezeit) 25 2.2.2.1 Struktur des Futters 26 2.2.2.2 TS-Gehalt im Futtermittel 27 2.2.2.3 Chemische Zusammensetzung des Futters 27 2.2.2.4 Futtermenge 28 2.2.2.5 Exokrine Pankreasinsuffizienz 28 2.3 Verdaulichkeit 29 2.3.1 Definition der Verdaulichkeit 29 2.3.2 Stufen der Verdaulichkeit 29 2.3.3 Die Verdaulichkeit beeinflussende Faktoren 32 2.3.3.1 Tierart 32 2.3.3.2 Rationszusammensetzung 33 2.3.3.3 Futtermenge 33 2.3.3.4 Zubereitung der Futtermittel 33 2.4 Methoden zur Bestimmung der Verdaulichkeit 34 2.4.1 Der Tierversuch 34 2.4.1.1 Kotkollektion 35 2.4.1.2 Chymuskollektion (Bestimmung der partiellen Verdaulichkeit) 36 2.4.1.3 Differenz- und Substitutionsversuche 38 2.4.2 In-vitro-Versuche 38 2.5 In-vivo-Screening-Tests zur Prüfung der Effizienz oraler Enzymergänzungen 40 2.5.1 Fettgehaltbestimmung im Kot (lipolytische Aktivität) 40 2.5.2 Tests zur Quantifizierung der Enzymeffektivität anhand von Blutparametern 41 2.5.2.1 Indirekte Messung der amylolytischen und proteolytischen Aktivität anhand des Glucose- und Aminosäuregehaltes im Blut 41
2.5.2.2 NBT-PABA-Test (N-Benzoyl-L-Tyrosil-Paraaminobenzoesäure-Test) zur Messung der proteolytischen Aktivität 41 2.5.2.3 Indirekte Messung der lipolytischen Effektivität anhand der Vit.-E-Absorption 42 2.5.3 Tests zur Quantifizierung der Enzymeffektivität anhand von Parametern im Exhalat 43 2.5.3.1 Exhalationstest unter Verwendung von 13 C 43 2.5.3.2 Wasserstoffexhalationstest 43 3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 45 3.1 Material und Methoden 45 3.1.1 Versuchsziel 45 3.1.2 Versuchstiere 45 3.1.3 Aufstallung und Haltung 47 3.1.4 Statistische Methoden 47 3.1.5 Übersicht über die durchgeführten Versuche, Versuchsplan 47 3.1.6 Validierung des Screening-Tests anhand zweier Proteasen 48 3.1.7 Rein methodisch ausgerichtete Versuchsanstellungen 51 3.1.7.1 Ist es möglich, eine Protease oder Amylase in ihrer Wirksamkeit zu beurteilen, die nur ein einziges Mal, d.h. mit einer Testmahlzeit gegeben wird, wenn postprandial über 12 Stunden der ileal anflutende Chymus aufgefangen wird? 51 3.1.7.2 Kann aufgrund des Farbwechsels im Chymus tatsächlich auf die Anflutung des unverdauten Anteils der Testmahlzeit geschlossen werden? 55 3.1.7.3 Besteht die Gefahr einer Verschleppung des Markers in nachfolgende Versuche? 59 3.1.7.4 Welche Enzymdosierungen eignen sich in Kombination mit den Testmahlzeiten, um dosisabhängige Effekte erkennen zu können? 62 3.1.7.5 In welchem Zeitraum kommt es zur maximalen Anflutung von Marker und Testmahlzeit? (Welcher Kollektionszeitraum nach Farbwechsel ist geeignet?) 68 3.1.7.6 Kann auch bei nur einmaliger Markeraufnahme die übliche Formel zur Berechnung der Verdaulichkeit bzw. Verschwindensrate (über das Verhältnis zwischen Nährstoff und Marker) genutzt werden? 78 3.1.8 Screening der vier Proteasen und Amylasen 83 3.1.8.1 Screening-Test für Proteasen (SP) 83 3.1.8.2 Screening-Test für Amylasen (SA) 83 3.1.9 Versuchs- und Haltungsfutter 84 3.1.10 Fütterungsmanagement 86 3.1.11 Enzymprodukte und substitution 86 3.1.12 Untersuchungsparameter und methoden 89 3.1.12.1 Rohnährstoffe 89 3.1.12.2 Stärke 91 3.1.12.3 Zucker 92 3.1.12.4 Chromoxid (Cr 2 O 3 ) 92 3.2 Ergebnisse 93 3.2.1 Screening-Test für Proteasen 94 3.2.1.1 Chymusqualität 95
3.2.1.2 Rohproteinanflutung 97 3.2.1.3 Relative Cr 2 O 3 -Anflutung 101 3.2.1.4 Trockensubstanz-Verschwindensrate (TS-VR) 103 3.2.1.5 Rohprotein-Verschwindensrate (Rp-VR) 106 3.2.2 Vergleich der Ergebnisse des Screening-Tests mit denen üblicher Verdaulichkeitsbeurteilungen (Versuche zur Validierung des Screening-Tests für Proteasen) 109 3.2.2.1 Chymusqualität 110 3.2.2.2 Rohproteinanflutung 110 3.2.2.3 Cr 2 O 3 -Wiederfindung 111 3.2.2.4 Praecaecale scheinbare TS-Verdaulichkeit (%), mittels Marker bestimmt 112 3.2.2.5 Praecaecale scheinbare Rp-Verdaulichkeit (%), mittels Marker bestimmt 113 3.2.3 Screening-Test für Amylasen 115 3.2.3.1 Chymusqualität 115 3.2.3.2 Stärkeanflutung 116 3.2.3.3 Relative Cr 2 O 3 -Anflutung 121 3.2.3.4 Trockensubstanz-Verschwindensrate (TS-VR) 122 3.2.3.5 Stärke-Verschwindensrate (Stärke-VR) 125 4 DISKUSSION 130 4.1 Kritik der Methoden 130 4.1.1 Analyse der Testmahlzeit 130 4.1.2 Lagerung der Chymusproben direkt nach der Gewinnung 132 4.1.3 Anzahl der Versuchstage pro Enzymprodukt und Dosierung 133 4.2 Erörterung der eigenen Ergebnisse 136 4.2.1 Die Entwicklung des Screening-Tests 136 4.2.1.1 Verzicht auf eine Anfütterungsphase 136 4.2.1.2 Zeitlicher Abstand zwischen zwei Versuchstagen 138 4.2.1.3 Ist die Überprüfung der Effektivität proteolytischer und amylolytischer Enzyme mittels einer Testmahlzeit möglich? 139 4.2.1.4 Beginn und Dauer der Chymuskollektion 140 4.2.1.5 Berechnung der Verschwindensrate 145 4.2.2 Rangierung der Enzyme 148 4.2.2.1 Differenzierung proteolytisch wirksamer Enzymprodukte anhand des in-vivo- Screening-Tests 148 4.2.2.2 Einfluss zweier Proteasen auf ausgewählte Parameter, sowie Vergleich der Werte einer herkömmlichen Verdaulichkeitsstudie und des Screening-Tests (Validierung des Screenings) 151 4.2.2.3 Differenzierung amylolytisch wirksamer Enzymprodukte anhand des in-vivo- Screening-Tests 152 4.2.2.4 Vergleich der Rangierung aufgrund von in-vivo-ergebnissen mit denen aus invitro-untersuchungen 155 4.3 Ausblick 157 4.4 Schlussfolgerung 158
5 ZUSAMMENFASSUNG 159 6 SUMMARY 162 7 LITERATURVERZEICHNIS 165 8 TABELLENANHANG 186
Abkürzungsverzeichnis Durchschnitt opt. optimal Eingetragenes Warenzeichen os organische Substanz A Amylase P21a Proteindiät mit 21 % Abb. Abbildung Rohprotein (Charge a) Abk. Abkürzung P21b Proteindiät mit 21 % acc. accessorius Rohprotein (Charge b) bzw. beziehungsweise p Irrtumswahrscheinlichkeit ca. circa P Protease d Tag ph Potentia hydrogenii D Dosierung PL Pankreasgangligiert et al. et alii ppr. postprandial Fa. Firma PVC Polyvinylchlorid FIP Fédération Internationale Ra Rohasche Pharmaceutique resp. respektive GIT Gastrointestinal-Trakt Rfa Rohfaser HF Haltungsfutter Rfe Rohfett Hrsg. Herausgeber Rp Rohprotein IDMC Interdigestive myeloelektrische S52 Stärkediät mit 52 % Stärke Komplexe S69 Stärkediät mit 69 % Stärke I.E. Internationale Einheiten S77 Stärkediät mit 77 % Stärke i.e.s. Im eigentlichen Sinne SA Screeningtest für Amylasen jew. jeweils SP Screeningtest für Proteasen KH Kohlenhydrate SD Standardabweichung KM Körpermasse sv scheinbare Verdaulichkeit KT Kontrolltier Tab. Tabelle M1 Multienzymprodukt 1 TS Trockensubstanz M2 Multienzymprodukt 2 us Ursprüngliche Substanz MMC Migrierender Motorkomplex V Versuch MW Arithmetischer Mittelwert Val. Validierungsversuch n Anzahl VDLUFA Verband deutscher landwirt- NBT- N-Benzoyl-L-Tyrosil- schaftlicher Untersuchungs- PABA Paraaminobenzoesäure und Forschungsanstalten n.f. nach Farbwechsel VF Versuchsfutter NfE Stickstoff-freie Extraktstoffe VR Verschwindensrate NPN Nicht-Protein-Stickstoff Vit. Vitamin Nr. Nummer Wdf. Wiederfindung
Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Schema der Kohlenhydratfraktionen im Futter (modifiziert nach HOFFMANN) 19 Abb. 2: Verweildauer des Futterbreies in den einzelnen Abschnitten des Magen- Darm-Traktes (modifiziert nach KAMPHUES 2000, pers. Mitteilung) 26 Abb. 3: Ursprung des AS-Flusses am terminalen Ileum (GfE 2005) 31 Abb. 4: Schematische Darstellung der drei Stufen der Rp-Verdaulichkeit (GfE 2005) 31 Abb. 5: Versuchsschema einer etablierten Verdaulichkeitsstudie (10-tägige Anfütterungsphase und 3-tägige Versuchsphase) 49 Abb. 6: Versuchsschema der modifizierten Verdaulichkeitsstudie (keine Anfütterungsphase, jeweils 48 h Abstand zwischen der Gabe der Testmahlzeiten) 53 Abb. 7: Relativer Anteil von braunem und grünem Chymus am gesamten in 12 Stunden angefluteten Chymus (n = 3, MW über 3 Tage, 3 verschiedene Dosierungen M1) 54 Abb. 8: Versuchsschema der Chymuskollektion unter Beachtung des Farbwechsels 56 Abb. 9: Cr 2 O 3 -Wiederfindung im Chymus nach einmaliger Fütterung einer markerhaltigen Versuchsdiät über 54 Stunden (n = 3) 61 Abb. 10: Praecaecale Rp-VR nach Aufnahme einer Testmahlzeit (21 % Protein in der TS) in Abhängigkeit von den Dosierungen des Multienzympräparates M1 bei PL-Tieren (n=3) 63 Abb. 11: Praecaecale Rp-VR nach Aufnahme einer Testmahlzeit (21 % Protein in der TS) in Abhängigkeit von den Dosierungen des Multienzympräparates M1 bei PL-Tieren (n=3) 64 Abb. 12: Mittlere praecaecale Stärke-Verschwindensrate bei PL-Tieren in Abhängigkeit von der Enzymdosierungen bei Verwendung einer 52%igen Stärkediät (S52), 8 Stunden n.f. (n=3) 66 Abb. 13: Mittlere praecaecale Stärke-Verschwindensrate bei PL-Tieren in Abhängigkeit von den Enzymdosierungen bei Verwendung einer 77%igen Stärkediät (S77), 8 Stunden n.f. (n=3) 67 Abb. 14: Mittlere praecaecale Stärke-Verschwindensrate bei PL-Tieren in Abhängigkeit von den Enzymdosierungen bei Verwendung einer 69%igen Stärkediät (S69), 8 Stunden n.f. (n=3) 67 Abb. 15: Absolute TS-Anflutung (g) innerhalb zweistündiger Kollektionsintervalle im Kollektionszeitraum 0-14 h n.f. am Beispiel D1,5 (n = 3) 70 Abb. 16: Cr 2 O 3 -Anflutung (%) innerhalb der einzelnen Kollektionsintervalle, im Zeitraum 0-14 Stunden n.f. am Beispiel D6 (n = 3) 71 Abb. 17: Relative Verteilung der Partikelgrößen (Ergebnisse einer trockenen Siebanalyse der Diäten HF, P21a und S69) 76 Abb. 18: Relativer Cr 2 O 3, TS- und Rp-Fluss im grünen Ileumchymus (Gesamtmenge an Cr 2 O 3, TS und Rp über 14 Stunden = 100) 79 Abb. 19: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D1 98 Abb. 20: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D2,5 99 Abb. 21: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D6 99
Abb. 22: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D1 104 Abb. 23: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D2,5 104 Abb. 24: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D6 105 Abb. 25: Rp-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D1 107 Abb. 26: Rp-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D2,5 107 Abb. 27: Rp-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D6 108 Abb. 28: Ileocaecale TS-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne bzw. mit Enzymzulage (n = 3, MW ± SD, über 3 x 12h ppr.) 110 Abb. 29: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne bzw. mit Enzymzulage (n = 3, MW ± SD, über 3 x 12h ppr.) 111 Abb. 30: TS-Verdaulichkeit (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne bzw. mit Enzymzulage 113 Abb. 31: Rp-Verdaulichkeit (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne bzw. mit Enzymzulage 114 Abb. 32: Ileocaecale Stärke-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D7,5 118 Abb. 33: Ileocaecale Stärke-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D18,8 119 Abb. 34: Ileocaecale Stärke-Anflutung (g) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D90 119 Abb. 35: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D7,5 123 Abb. 36: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D18,8 124 Abb. 37: TS-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D90 124 Abb. 38: Stärke-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D7,5 126 Abb. 39: Stärke-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D18,8 127 Abb. 40: Stärke-VR (%) bei Kontroll- sowie PL-Tieren ohne und unter dem Einfluss von Enzymprodukten in D90 128 Abb. 41: Schema eines 3 x 3 Lateinischen Quadrates 135 Abb. 42: Cr 2 O 3 -Gehalt im Ileumchymus (g / kg TS, braun = erste 4-6 Stunden ppr. bis zum Farbwechsel, danach 2-stündige Kollektionsintervalle n.f., 3 Dosierungen M1, MW ± SD, n = 3) 145 Abb. 43: Relativer Cr 2 O 3, TS- und Rp-Fluss im grünen Ileumchymus (Gesamtmenge an Cr 2 O 3, TS und Rp über 14 Stunden = 100), exemplarische Darstellung von Tier 65 146 Abb. 44: Mögliche Dosis-Wirkungs-Spektren der getesteten Proteasen in den verwendeten Dosierungen 149
Tabellenverzeichnis Tab. 1: Übersicht zu den verwendeten Tieren und deren Einsatz in den unterschiedlichen Versuchen 46 Tab. 2: Übersicht über die in den Validierungsversuchen verwendeten Proteasen inklusive der Dosierungen und den entsprechenden Versuchstieren 49 Tab. 3: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 52 Tab. 4: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 55 Tab. 5: Relativer Anteil des im braunen Chymus gefundenen Cr 2 O 3 an der gesamten mit der Testmahlzeit gefütterten Cr 2 O 3 -Menge (Werte von 3 Versuchstagen, chromhaltiges VF im Abstand von mindestens 48 h gefüttert) 57 Tab. 6: Absolute Cr 2 O 3 -Anflutung (g) bzw. relativer Anteil (%) der gefütterten Chrommenge in den ersten 2 Stunden n.f. (n=3) 57 Tab. 7: Relativer Anteil (%) der gefütterten Chrommenge im grünen Chymus innerhalb 8, 14 bzw. 20 h n.f. (chromhaltiges VF im Abstand von mindestens 48 h gefüttert) 58 Tab. 8: Gegenüberstellung der Nährstoffgehalte des Haltungsfutters und der Testmahlzeit (g / kg TS) 58 Tab. 9: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym sowie Kollektionszeitraum 60 Tab.10: Cr 2 O 3 -Wiederfindung innerhalb 54 Stunden ppr. nach einmaliger Fütterung einer markerhaltigen Diät (P21a) 61 Tab.11: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 62 Tab. 12: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeiten, zugelegte Enzyme in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kennzeichnung der Dosierungen des Multienzymproduktes M1 65 Tab. 13: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 68 Tab. 14: Absolute TS-Anflutung (g) im Ileumchymus innerhalb zweistündiger Kollektionsintervalle im Kollektionszeitraum 0-14 Stunden n.f. (n = 3) 69 Tab. 15: Cr 2 O 3 -Anflutung (%) am terminalen Ileum innerhalb unterschiedlicher Kollektionszeiträume n.f. (n = 3) 70 Tab. 16: Cr 2 O 3 -Anflutung (%) innerhalb der einzelnen Kollektionsintervalle, im Zeitraum 0-14 Stunden n.f. (n = 3) 71 Tab. 17: Praecaecale Rp-Verschwindensraten innerhalb unterschiedlicher Kollektionszeiträume n.f. (n = 3) 73 Tab. 18: Praecaecale TS-VR innerhalb der einzelnen Kollektionsintervalle im Zeitraum 0-14 Stunden n.f. (n = 3) 74 Tab. 19: Praecaecale Rp-VR innerhalb der einzelnen Kollektionsintervalle im Zeitraum 0-14 Stunden n.f. (n = 3) 74 Tab. 20: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 75
Tab. 21: Absolute TS-Anflutung im Ileumchymus innerhalb 2-stündiger Kollektionsintervalle im Kollektionszeitraum 0-8 Stunden n.f. (n = 3) 76 Tab. 22: Cr 2 O 3 -Anflutung innerhalb der einzelnen Kollektionsintervalle, im Zeitraum 0-8 Stunden n.f. (n = 3) 77 Tab. 23: Cr 2 O 3 -Anflutung innerhalb unterschiedlicher Kollektionszeiträume n.f. (n = 3) 77 Tab. 24: Übersicht über Versuchstiere, Testmahlzeit, zugelegtes Enzym in unterschiedlichen Dosierungen sowie Kollektionszeitraum 78 Tab. 25: Übersicht über die methodisch ausgerichteten Versuchsansätze 82 Tab. 26: Übersicht der Screening-Tests 83 Tab. 27: Analysenwerten der Nährstoffgehalte (g / kg TS) der verschiedenen Diäten ohne Zulage von Enzymen 85 Tab. 28: Inhaltsstoffe der Versuchsdiät P21a bzw. S52 (g / kg us) 85 Tab. 29: Aktivitäten der verwendeten Multienzympräparate (I.E. FIP / g) 88 Tab. 30: Eingesetzte Enzymdosierungen (I.E. FIP) sowie deren Abkürzungen 88 Tab. 31: Übersicht über die verwendeten Protein-Versuchsdiäten und Enzymprodukte mit den jeweiligen Dosierungen (I.E. FIP) 88 Tab. 32: Übersicht über die verwendeten Stärke-Versuchsdiäten und Enzymprodukte mit den jeweiligen Dosierungen in I.E. FIP 89 Tab. 33: Analysierte Parameter der Chymusproben in unterschiedlichen Versuchsansätzen 89 Tab. 34: Ileocaecale TS-Anflutung (g) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 95 Tab. 35: Ileocaecale TS-Anflutung (g) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 96 Tab. 36: Rangierung der Enzyme anhand der Reduktion der ileocaecalen TS-Anflutung (g) am terminalen Ileum 96 Tab. 37: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 97 Tab. 38: Ileocaecale Rp-Anflutung (g) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 97 Tab. 39: Relative Rp-Anflutung (%) nach Zulage verschiedener Enzymprodukte in Abhängigkeit von der Dosierung (D1 = 100) 98 Tab. 40: Übersicht über die Rp-Anflutung nach Enzymsubstitution in Relation zu den PL-Tieren ohne Enzymzulage (PL-0-Tiere = 100) 100 Tab. 41: Übersicht über die Rp-Anflutung nach Enzymsubstitution in Relation zu den Kontrolltieren (KT = 100) 100 Tab. 42: Relative Cr 2 O 3 -Anflutung (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 101 Tab. 43: Relative Cr 2 O 3 -Anflutung (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 101 Tab. 44: Kalkulation der Rp-VR anhand der Rp-Anflutung und der mittels Cr 2 O 3 kalkulierten Menge an Rp aus der Testmahlzeit P21a (48,4 g Rp / 250g us, exemplarisch anhand der Dosierung D6, Kollektionszeitraum: 8 h n.f.) 102
Tab. 45: TS-VR (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) Tab. 46: TS-VR (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 103 Tab. 47: Rangierung der Enzyme anhand der TS-VR (%) am terminalen Ileum 105 Tab. 48: Rp-VR (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 106 Tab. 49: relative Rp-VR (%) nach Zulage verschiedener Enzymprodukte in Abhängigkeit der Dosierungen (D1 = 100) 106 Tab. 50: Rp-VR (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 8 h nach Farbwechsel) 106 Tab. 51: Rp-Verschwindensraten nach Enzymsubstitution in Relation zu den PL-Tieren ohne Enzymzulage (PL-0-Tiere = 100) 108 Tab. 52: Rp-Verschwindensraten nach Enzymsubstitution in Relation zu den Kontrolltieren (KT = 100) 109 Tab. 53: Rangierung der verschiedenen Enzymergänzungen (D6) hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf folgende Parameter: TS-Anflutung, TS-VR, Rp-Anflutung und Rp-VR 109 Tab. 54: Cr 2 O 3 -Wiederfindung (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (n = 3, MW ± SD, über 3 x 12h ppr.) 111 Tab. 55: Cr 2 O 3 -Wiederfindung (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (n = 3, MW ± SD, über 3 x 12h ppr.) 112 Tab. 56: Cr 2 O 3 -Wiederfindung (%) im Ileumchymus bei PL-Tieren ohne bzw. mit Enzymzulage (unabhängig vom verwendeten Futter) 112 Tab. 57: Vergleich der Ergebnisse der beiden eingesetzten Verfahren absolut bzw. in Relation zu Protease P2 114 Tab. 58: Ileocaecale TS-Anflutung (g) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 116 Tab. 59: Ileocaecale TS-Anflutung (g) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und dosierungen 116 Tab. 60: Rangierung der Enzyme anhand der Reduktion der ileocaecalen TS-Anflutung (g) im Ileumchymus 116 Tab. 61: Ileocaecale Stärke-Anflutung (g) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 117 Tab. 62: Ileocaecale Stärke-Anflutung (g) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 117 Tab. 63: Relative Stärke-Anflutung (%) nach Zulage verschiedener Enzymprodukte in Abhängigkeit der Dosierung (D7,5 = 100) 118 Tab. 64: Übersicht über die Stärke-Anflutung nach Enzymsubstitution in Relation zu den PL-Tieren ohne Enzymzulage (PL-0-Tiere = 100) 120 Tab. 65: Übersicht über die Stärke-Anflutung nach Enzymsubstitution in Relation zu den Kontrolltieren ohne Enzymzulage (KT = 100) 121 Tab. 66: Relative Cr 2 O 3 -Anflutung (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 121
Tab. 67: Relative Cr 2 O 3 -Anflutung (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) Tab. 68: Kalkulation der Stärke-VR anhand der Stärke-Anflutung und der mittels Cr 2 O 3 kalkulierten Menge an Stärke aus der Testmahlzeit S69 (153 g / 250g us, exemplarisch anhand der Dosierung D90, Kollektionszeitraum: 6 h n.f.) 122 Tab. 69: TS-VR (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 122 Tab. 70: TS-VR (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 123 Tab. 71: Rangierung der Enzyme anhand der TS-VR (%) im Ileumchymus 125 Tab. 72: Stärke-VR (%) bei Kontroll- und PL-0-Tieren (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 125 Tab. 73: Stärke-VR (% / 6 h) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen (Kollektionszeitraum: 6 h nach Farbwechsel) 126 Tab. 74: Relative Stärke-VR (%) nach Zulage verschiedener Enzymprodukte in Abhängigkeit der Dosierungen (D7,5 = 100) 126 Tab. 75: Stärke-Verschwindensraten nach Enzymsubstitution in Relation zu den PL- Tieren ohne Enzymzulage (PL-0-Tiere = 100) 128 Tab. 76: Stärke-Verschwindensraten nach Enzymsubstitution in Relation zu den Kontrolltieren (KT = 100) 129 Tab. 77: Rangierung der verschiedenen Enzymergänzungen bei Zulage in der Dosierung (D90) hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf folgende Parameter: TS- Anflutung, TS-VR, Stärke-Anflutung und Stärke-VR 129 Tab. 78: Stärke- und Zuckergehalt der Testmahlzeiten P21a und S52 in Abhängigkeit von der Dosierung des zugesetzten Enzymproduktes M1 (g us / 250 g Testmahlzeit) 131 Tab. 79: Anteil des Rp-Gehaltes des Enzymproduktes M1 am Gesamtproteingehalt der Ration (%) 132 Tab. 80: Mittlere praecaecale Stärke-Verschwindensrate (%) bei PL-0-Tieren in Abhängigkeit unterschiedlicher Chymuslagerungen 132 Tab. 81: Absoluter Cr 2 O 3 -Gehalt im braunen und grünen Chymus nach Fütterung einer Testmahlzeit inklusive 0,625 g Cr 2 O 3 142 Tab. 82: Gegenüberstellung der praecaecalen Rp-Verdaulichkeit (%) bzw. Rp- Verschwindensrate (%) aus verschiedenen Testansätzen 152
Einleitung 1 Einleitung Die chronische exokrine Pankreasinsuffizienz (EPI) wird immer häufiger sowohl beim Menschen als auch bei sogenannten Liebhabertieren diagnostiziert (WORNING 1990). Als Auslöser werden beim Menschen und der Katze eine chronische Pankreatitis beschrieben (SINGER und MÜLLER 1995; WILLIAMS 1995), wohingegen beim Hund oftmals eine Atrophie des Pankreasgewebes (z.b. aufgrund einer genetischen Disposition, u.a. beim Deutschen Schäferhund) ursächlich für die Entstehung der EPI ist (LEIDINGER 1997; SUTER 2001). Der Mangel an Pankreasenzymen führt zu einer Malabsorption und Maldigestion der aufgenommenen Nahrung, wobei aufgrund ungenügender Kompensationsmechanismen neben der Kohlenhydratund Proteinverdauung insbesondere die Fettverdauung betroffen ist, was sich in einer Steatorrhoe als Leitsymptom äußert (GREGORY et al. 2002). Neben diätetischen Maßnahmen besteht ein grundlegendes Ziel der Behandlung der EPI darin, den Mangel an pankreatischen Verdauungsenzymen und die daraus resultierende Maldigestion und Malabsorption durch oral substituierte Enzyme zu verringern. Hierbei wurde in der Vergangenheit vornehmlich auf Enzyme tierischen Ursprungs zurückgegriffen (porcines, aber auch bovines Pankreasgewebe). Zunehmend wird an der Entwicklung von Enzymprodukten nichttierischen Ursprungs geforscht. Eine standardisierte Gewinnung von Enzymen ohne Material tierischen Ursprungs würde einer Qualitätssicherung entgegen kommen. So könnte der Gefahr einer Übertragung von Krankheiten entgegengewirkt werden, und somit auch der geforderte Verbraucherschutz in noch größerem Umfang sichergestellt werden. Um neue Enzymformulierungen z.b. mikrobiellen (bakteriellen, fungalen) Ursprungs in ihrer Wirksamkeit testen zu können, sind neben in-vitro-tests auch in-vivo-tests notwendig. Die mit geringerem Zeit-, Material- und Arbeitsaufwand verbundenen in-vitro-tests haben den Nachteil einer oftmals nur geringen Korrelation der Ergebnisse mit jenen der in-vivo-tests, so dass auf letztere bisher nicht verzichtet werden kann. Als geeignetes Modell hat sich in zahlreichen Studien die Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit (Effizienzprüfung von A- mylasen und Proteasen) und der Gesamtverdaulichkeit (Lipasen) bei pankreasgangligierten Minipigs herausgestellt (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004). Bei Anwendung dieser klassischen Methoden besteht jedoch neben dem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand ein weiterer 16
Einleitung Nachteil in der Tatsache, dass die zu testenden Enzyme noch gar nicht in den entsprechenden Mengen verfügbar sind. Vor diesem Hintergrund testete KARTHOFF (2004) die Effizienz von Enzymformulierungen anhand von Blutparametern, die direkt die Absorption des zuvor spezifisch gespaltenen Substrates anzeigen (NBT-PABA-Test). Anknüpfend an diese Intentionen der Zeit- und Arbeitsersparnis bestand das Ziel der vorliegenden Dissertation in der Entwicklung eines in-vivo-screening-tests auf der Basis von Verdaulichkeitsstudien. Hierzu wurde wie in den vorangegangenen Arbeiten des Projektes (TA- BELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004) zur Beurteilung der Enzymwirkung die Nährstoffanflutung am Dünndarmende herangezogen. Der zu entwickelnde Screening-Test sollte dabei eine Differenzierung von Monoenzymprodukten (Amylasen und Proteasen) anhand ihrer Effektivität ermöglichen und eine Rangierung erlauben, so dass aufgrund dieser Vorauswahl lediglich die vielversprechendsten Produkte in etablierten jedoch auch wesentlich aufwändigeren Verdaulichkeitsstudien näher quantifiziert werden. Vor diesem Hintergrund sollten folgende Fragen geklärt werden: Ist es möglich im Rahmen eines solchen Screening-Tests auf die zeitaufwändige Anfütterungsphase von 10 Tagen zu verzichten, um den damit verbundenen hohen Verbrauch an Enzymen zu vermeiden? Inwiefern ist der Einsatz eines Markers gerechtfertigt, um den Fluss der Testmahlzeit zu ermitteln? Kann dieser trotz Verzicht auf eine Anfütterungsphase eingesetzt werden? Ist es möglich, anhand einer Testmahlzeit sowohl proteolytische als auch amylolytische Enzymprodukte bezüglich ihrer Effizienz zu testen? Inwieweit kann das als Goldstandard bezeichnete Verfahren der praecaecalen Verdaulichkeitsuntersuchung modifiziert werden - insbesondere im Hinblick auf den Kollektionszeitraum -, um in möglichst kurzer Zeit Enzymformulierungen testen zu können? Korrelieren die Ergebnisse des zu entwickelnden Verfahrens (Screening-Test) mit jenen aus herkömmlichen Verdaulichkeitsstudien sowie mit den Ergebnissen aus in-vitro- Untersuchungen? 17
Schrifttum 2 Schrifttum 2.1 Überblick zur Verdauung von Kohlenhydraten und Proteinen Um die in großen Molekülen vorliegenden und zum Teil wasserunlöslichen Nahrungsbestandteile (Stärke, Cellulose) resorbieren zu können, müssen diese im Magen-Darm-Trakt mechanisch und chemisch in kleinere Einheiten zerlegt und in eine wasserlösliche Form überführt werden. Um den als Hydrolyse bezeichneten Prozess zu beschleunigen, kommen Katalysatoren (neben futtereigenen, dem Futter zugesetzten oder mikrobiellen Enzymen v.a. die körpereigenen Verdauungsenzyme) zum Einsatz, welche zur Nahrungsaufspaltung essentiell sind (SCHMIDT-NIELSEN 1999; KAMPHUES et al. 2004). Die Verdauung von Nährstoffen wird durch deren Qualität und Quantität, durch das Vermögen des Magen-Darm-Traktes, Nährstoffe und deren Abbauprodukte zu resorbieren und durch die dafür zur Verfügung stehende Zeit beeinflusst. An den Orten einer verlängerten Retentionszeit des Chymus kann von einer gesteigerten Hydrolyse und Resorption von Nährstoffen in die Blut- und Lymphbahn, sowie von einer intensiven mikrobiellen Fermentation ausgegangen werden (CLEMENS et al. 1975). 2.1.1 Kohlenhydrat- bzw. Stärkeverdauung Die Kohlenhydratfraktion (KH), die mit dem Futter aufgenommen wird, kann nach dem von HOFFMANN et al. (2001) entwickelten Schema in eine Gruppe von KH, welche durch endogene Enzyme ZL GL.-Amylase des Speichels (nur bei Schweinen), der Bauchspeicheldrüse, sowie diversen bürstensaummembranständigen Enzymen) hydrolysiert werden kann, und in eine zweite Gruppe, welche - bis auf wenige Ausnahmen - lediglich aus mikrobiell fermentierbaren KH besteht, unterteilt werden (s. Abb. 1). 18
Schrifttum Pentosen, Hexosen Disaccharide durch körpereigene hydrolysierbare KH einige Oligosaccharide Enzyme verdaulich Stärke Nicht-Gerüstsubstanz- Kohlenhydrate Fruktane Nicht-Stärke-Polysaccharide resistente Stärke Galacto Oligosaccharide Fructo Oligosaccharide schnell Lösliche Faser - Mucine - Pectine mikrobiell - Polysaccharide fermentierbar Unlösliche Fasern - Hemicellulose - Cellulose - Lignocellulose langsam - ß Glucane Lignin unverdaulich Abb. 1: Schema der Kohlenhydratfraktionen im Futter (modifiziert nach HOFFMANN et al. 2001) Letztere können nicht von endogenen Enzymen der höheren Tiere hydrolysiert werden, da sie QLFK GXUF.-JOXFRVLGLVFK %LQGXQJ VRQGHU -glucosidisch verbunden sind. Diese unterliegen beim Schwein und anderen monogastrischen Tieren v.a. im Dickdarm (NEHRING 1972; CLEMENS et al. 1975; KIRCHGESSNER 1997; SCHARRER u. WOLFFRAM 2000a), aber auch in mäßigem Umfang im Magen (CLEMENS et al. 1975; GIESEKE 1990; SCHARRER u. WOLFFRAM 2000a) bzw. im Dünndarm (DROCHNER 1984; KAMPHUES 1987) einer mikrobiellen Fermentation. 'L GXUF L.-Amylase des Speichels und des Pankreas (vor allem im proximalen Drittel des Dünndarms) hydrolysierten Spaltprodukte der KH-Fraktion werden von bürstensaumständigen Disaccharidasen weiter abgebaut, in die Epithelzellen aufgenommen und über Kapillaren in die Pfortader weiter zur Leber sowie teilweise in die Vena cava caudalis transportiert (KIDDER u. MANNERS 1978). 19
Schrifttum Die Stärkeverdaulichkeit im Dünndarm des Schweins ist allgemein sehr hoch. Sie ist von der Qualität der Stärke (botanische Herkunft und thermische oder mechanische Bearbeitung) abhängig. Für die praecaecale Verdaulichkeit der Stärke beim Schwein wurden Werte zwischen 81,9 % und 99,2 % ermittelt (GRAHAM et al. 1986; BEDFORD et al. 1992; SCHMITZ et al. 1993; INBORR u. SUOMI 1993; BACH KNUDSEN et al. 1993; WELHAM 1994). Die Autoren der Vorgängerarbeiten dieser Dissertation berichten ebenfalls von praecaecalen Stärkeverdaulichkeiten zwischen 89 % und 100 % bei Kontrolltieren mit intaktem Pankreasausführungsgang (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; KAMMLOTT 2003). Bei Überschreitung der Verdauungskapazität für Kohlenhydrate im Dünndarm wird der in den Dickdarm abflutende Teil der Kohlenhydratfraktion in der Regel durch fermentative Prozesse vollständig abgebaut (HOLMES et al. 1973; KEYS u. DEBARTHE 1974; DROCHNER 1984; KAMPHUES 1987). Ändert sich die KH-Zufuhr längerfristig, so findet eine begrenzte Adaptation der pankreatischen Enzyme innerhalb von ca. 3 Tagen statt. Diese Adaptation trifft auch für das Vermögen der intestinalen Monosaccharidresorption zu (SCHARRER u. WOLFFRAM 2000b). 2.1.2 Proteinverdauung Aufgrund des sauren Milieus im Magen denaturieren Proteine endo- und exogener Herkunft, wodurch erste Spaltprodukte (Peptide und Aminosäuren) entstehen. Des Weiteren werden die Proteine durch die im Magen und Dünndarm wirksamen Proteasen zu höher- und niedermolekularen Peptiden (vor allem Di- und Tripeptide) und diese unter dem Einfluss von Endo- (Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin und Elastasen) und Exopeptidasen (Amino- und Carboxypeptidasen) bis hin zur Stufe resorbierbarer Aminosäuren hydrolysiert. Die genannten Enzyme liegen teils in aktiver und teils in inaktiver Form vor, wobei letztere eine Aktivierung bedürfen. Ähnlich den KH erfolgt der letzte Schritt des Abbaus durch Enzyme der Bürstensaummembran. Die Resorption der Aminosäuren geschieht vornehmlich im Ileum und ist bis zum Ende dieses Darmabschnittes abgeschlossen (PAYNE et al. 1968; KEYS u. DEBARTE 1974; BRAUDE et al. 1975; LOW 1977; BURACZEWSKA et al. 1979; WÜNSCHE et al. 1979; ZEBROWSKA et al. 1980; LEIBOLZ et al. 1986; KIES et al. 1986). Laut KAMPHUES (1987) wird bei erhöhter Futtermittelaufnahme ähnlich den KH - jedoch in geringerem Umfang - auch die N-Fraktion praecaecal durch Mikroben abgebaut. Neben den über die Nahrung bzw. das Fut- 20
Schrifttum ter zugeführten Proteinen werden auch endogene Proteine (aus Verdauungssekreten z.b. des Pankreas, Epithelzellen von Zellmauserungen oder Mucine) von den Peptidasen umgesetzt (SCHARRER u. WOLFFRAM 2000b). Die praecaecal unverdauten Proteine, Peptide und Aminosäuren endogener sowie exogener Herkunft gelangen mit dem Chymus in den Dickdarm. Dort werden die N-Verbindungen durch mikrobielle Enzyme umgesetzt und zur Synthese bakteriellen Proteins genutzt oder auf der Stufe des Ammoniaks absorbiert, um nachfolgend entweder zur Synthese nichtessentieller Aminosäuren und anderer Proteine genutzt oder als Harnstoff mit dem Harn ausgeschieden zu werden. In geringem Umfang entstehen aus dem Protein durch Decarboxilierung auch biogene Amine wie z.b. Histamin oder Cadaverin (KAMPHUES 1987). Die als Bakterienprotein gespeicherten Aminosäuren können vom monogastrischen Wirt nicht genutzt werden und werden mit der Fäzes ausgeschieden. Die Proteinfraktion in der Fäzes wird daher v.a. vom Aminosäurenprofil des Bakterienproteins und weniger von dem unverdauten Futterprotein bestimmt (MASON u. JUST 1976; KREUZER et al. 1989; SAUER et al. 1991). 2.1.3 Mikrobieller Abbau von Nährstoffen (Praecaecale Verdaulichkeit versus Gesamtverdaulichkeit) Die praecaecale Stärkeverdaulichkeit bei Schweinen beträgt zwischen 81,9 und 100 % (GRA- HAM et al. 1986; BEDFORD et al. 1992; BACH KNUDSEN et al. 1993; INBORR u. SUOMI 1993; SCHMITZ et al. 1993; WELHAM 1994; TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDI- SCHER 2002; KAMMLOTT 2003). Wird die Verdauungskapazität des Dünndarms für Kohlenhydrate und Proteine überschritten, so werden v.a. die KH nahezu vollständig im Dickdarm durch mikrobielle Enzyme fermentiert. TABELING (1998) beschreibt bei pankreasgangligierten Minipigs eine praecaecale Stärkeverdaulichkeit von 61,9 %. Bei gleichen Tieren beträgt die Gesamtverdaulichkeit der Stärke 99,3 %, dies entspricht einer relativen postilealen Stärkeverdaulichkeit von 98,1 %. Laut DROCHNER (1984) finden 15 % der gesamten Rp-Verdauung im Dickdarm statt. Hierdurch entstehen dem Tier, gegenüber der Hydrolyse durch körpereigene Enzyme im Dünndarm, energetische Nachteile (FULLER et al. 1994). Der energetische Gewinn über den Abbau von Fettsäuren, welche durch die Fermentation im Dickdarm gebildet werden, ist geringer als der energetische Nutzen, der durch die im Dünndarm resorbierten Monosaccharide entsteht (WEISTHOFF 1990). Des Weiteren bestehen aufgrund mikrobieller Metabolisierung von Stickstoffverbindungen im Dickdarm der Tiere zum Teil große Unterschiede im 21
Schrifttum Aminosäurenmuster von Futter und Kot, weshalb eine Beurteilung der Verdaulichkeit von Proteinen und Aminosäuren auf Basis der Gesamtverdaulichkeit nicht oder nur mit Einschränkungen möglich ist. Die Ermittlung der Gesamtverdaulichkeit würde somit zu einer Fehleinschätzung der Verdaulichkeit führen (OELFKE 1978; DROCHNER 1987; KAMPHUES 1987). Neben der oben beschriebenen postilealen Kompensation der verminderten praecaecalen Stärkeverdaulichkeit bei pankreasgangligierten Minipigs konnte TABELING (1998) von ähnlich eindeutigen Kompensationsvorgängen in Bezug auf die Rohproteinverdaulichkeit berichten (praecaecale Rp- Verdaulichkeit: 29,6 %, Gesamtverdaulichkeit: 56,7 %, relative postileale Verdaulichkeit: 38,4 %). Daher ist die Ermittlung der praecaecalen Verdaulichkeit zwingend notwendig, wenn der energetische Nutzen näher quantifiziert werden soll. Zu beachten ist allerdings, dass auch bei Berechnung der scheinbaren praecaecalen Verdaulichkeit die endogenen N-Verbindungen aus dem Chymus nicht berücksichtigt werden und man trotz Abgrenzung von den mikrobiellen Umsetzungen im Dickdarm im Bezug auf das Protein nicht von wahrer praecaecaler Verdaulichkeit sprechen kann. Dafür sind zusätzlich Korrekturen für die endogenen Sekretionen notwendig, die über gestaffelte Proteinmengen oder Markierung von Aminosäuren gemessen werden (siehe unter 2.3.2). 2.2 Die Magen-Darm-Motorik sowie Fütterungseinflüsse auf die Chymuspassage 2.2.1 Physiologie der Magen-Darm-Motorik 2.2.1.1 Magen Der Magen des Schweins kann funktionell in zwei Bereiche untergliedert werden: Der proximale Teil (Korpus und Fundus) dient - neben dem Dickdarm - als Speicher der aufgenommenen Nahrung, der distale Teil (das Antrum sowie der distale Teil des Magenkörpers) als Pumpe (SLEISENGER u. FORTAN 1973; CLEMENS et al. 1975; EHRLEIN 2000a). Durch das Zusammenspiel von Magenspeicher und Magenpumpe wird der Chymus geschichtet, zerkleinert und selektiv zurückgehalten (DOUGHERTY 1965; PICKARD u. STEVENS 1972; ARGENZIO et al. 1974; EHRLEIN 2000a). Die selektive Retention beruht auf der Tatsache, dass der genügend zerkleinerte und verflüssigte Mageninhalt nicht durch Druck in den Darm gepresst wird, son- 22
Schrifttum dern durch peristaltische Wellen in den Darm gespült wird. Dieser Mechanismus der Antrumpumpe ist zugleich mit einer Siebwirkung verbunden. Es werden daher zunächst nur die ausreichend verflüssigten und anverdauten Bestandteile des Chymus (die obere Schicht des Mageninhaltes) durchmischt und in das Duodenum entleert, wohingegen die größeren Futterbestandteile noch länger im Magenspeicher verweilen. Der ph-wert bleibt im Innern des Nahrungsbreies somit hoch, wodurch die Speichelamylase die Stärke weiter spalten kann (EHR- LEIN 2000a). Der ph-wert des Nahrungsbreies ist dabei von der Lokalisation des Chymus im Magen abhängig. In den cranialen Bereichen des Magens ermittelte KAMPHUES (1987) ph- Werte von 6,3 bis 6,9, wohingegen sich der ph-wert in Richtung Pylorus verringert (ph 2,9 bis 4,0). Die Aufnahme, Speicherung und Weiterleitung des Nahrungsbreies wird nach OEHLER (1988) und EHRLEIN (2000a) von unterschiedlichen Einflüssen und Reizen beeinflusst und gesteuert. So übt der Nahrungsbrei durch Stimulation von Mechanorezeptoren in der Mundhöhle und im Pharynx eine sogenannte rezeptive Relaxation der Magenwand aus. Hierdurch wird der Magen auf die Aufnahme eines Bissens vorbereitet. Des Weiteren beschreibt EHRLEIN (2000a) eine adaptive Relaxation der Magenwand, wodurch die Futterbestandteile so lange im Magen verweilen, bis sie ausreichend zerkleinert und verflüssigt sind. Diese wird durch Spannungsrezeptoren im Magen selbst sowie durch Gastrin bewirkt. Durch die in den Dünndarm weitertransportierten Nahrungsbestandteile werden dort lokalisierte Rezeptoren angesprochen (Feedback-Relaxation, bedingt durch Osmorezeptoren, Glucoserezeptoren, Rezeptoren für Fett und Tryptophan-Rezeptoren). Diese sorgen durch einen Feedback-Mechanismus für eine Hemmung der Magenentleerung (sogenannte Duodenal-, Jejunum- und Ileumbremse) und sind somit Voraussetzung für eine Anpassung der Magenentleerung an die Verdauungs- und Resorptionsvorgänge des Darms. Neben der durch Pepsin und Salzsäure erfolgenden Proteinverdauung und der in begrenztem Maße im Magen erfolgenden Fortführung der Stärkeverdauung durch die Speichelamylase besteht eine weitere Aufgabe des Magens darin, den Nahrungsbrei so lange zu speichern, bis er zum Weitertransport ausreichend zerkleinert und verflüssigt ist. Der Dünndarm sorgt durch 23
Schrifttum eine Feedback-Regulation dafür, dass die Passagegeschwindigkeit des Chymus aus dem Magen in den Darm den Verdauungs- und Resorptionsvorgängen angepasst wird. 2.2.1.2 Dünndarm Der Chymus durchfließt den Dünndarm im Vergleich zum Dickdarm verhältnismäßig schnell und ohne nennenswerte Retentionen (CLEMENS et al. 1975). Dabei nimmt die Geschwindigkeit des Chymusflusses von cranial nach caudal aufgrund langsamer und kürzer werdender peristaltischer Wellen ab (GROVUM u. WILLIAMS 1973). Hierdurch wird der Chymustransport in distaler Richtung in dem Maße verlangsamt, wie das Volumen des Darminhaltes durch Resorption von Nährstoffen und Wasser abnimmt. Einige Autoren berichten von Retentionen (Verweilen des Chymus an einer Lokalisation), wenn große Chymusmengen das distale Ileum durchfließen (GROVUM u. WILLIAMS 1973; ARGENZIO et al. 1974). Durch Einschnürungen infolge von Kontraktionen der glatten Muskulatur des Darms wird der Chymus durchmischt. Die Dünndarmmotorik wird postprandial auf zweierlei Wegen beeinflusst. Zum Einen wird die Motorik durch Dehnungsreize stimuliert, zum Anderen beeinflusst die luminale Nährstoffkonzentration den Weitertransport des Chymus. Ähnlich der Feedback-Regulation des Darms auf den Magen übt auch der zunehmend stärker gefüllte distale Darmabschnitt eine hemmende Wirkung auf die Motorik der proximalen Teile des Darms aus. Dies ist neben dem Einfluss bestimmter Hormone (Peptid YY, Glucagon-ähniches Peptid GLP-1) der wichtigste Steuerungsmechanismus (EHRLEIN 2000b). Um die Passage des Nahrungsbreis durch den Dünndarm zu verfolgen, werden die myeloelektrischen Potentiale am Darm gemessen. Diese lassen sich in eine Nüchternmotilität (MMC oder IDMC, 2-stündige Periodik) und in eine Aktivmotilität (Spike Potentiale) unterscheiden. Laut HELLEMANS et al. (1977) werden die MMC s durch den Kaloriengehalt der Nahrung gehemmt. Die Spike-Potentiale hingegen sind weniger von dem Energiegehalt als vielmehr von der biochemischen Qualität der Nahrung abhängig. Sowohl Omnivoren als auch Karnivoren haben innerhalb von ca. 12 Stunden ihren täglichen Nährstoffbedarf verdaut und resorbiert. Hiernach schließt sich eine interdigestive Phase an, innerhalb welcher der Magen-Dünndarm-Bereich von Chymusresten und Sekreten gereinigt wird (EHRLEIN 2000b). 24
Schrifttum 2.2.1.3 Dickdarm Die Entleerung des Chymus aus dem Ileum ins Caecum erfolgt beim Schwein plötzlich und schubartig in einer Frequenz von 7-9 mal pro Stunde (EHRLEIN 2000c). Laut DROCHNER (1984) fließt der Chymus ppr. rhythmisch vom Ileum in das Caecum, mit einem maximalen Chymusfluss in der Zeit 4,5 5,5 Stunden nach Fütterung. Das Caecum spielt beim Schwein, im Unterschied zu anderen Tierarten, keine Rolle für die Speicherung von Chymus (CLEMENS et al. 1975). Dahingegen fungiert das Colon neben dem Magen als Speicherorgan. Es besitzt im wesentlichen zwei Aufgaben: Zum einen nimmt es Einfluss auf die Regulation der Passagerate löslicher Futterbestandteile, die Wasserresorption und somit auf die Kotbildung. Laut CLEMENS et al. (1975) sind für die Flüssigkeitsretention beim Schwein das centripetale Colon (Colon ascendens) und das Colon descendens von Bedeutung. Zum anderen fungiert das Kolon als große Gärkammer, in welcher der Abbau zuvor unverdauter Nährstoffe durch Mikroorganismen erfolgt. Für beide Aufgaben ist eine kräftige Durchmischung und ein langsamer Weitertransport nach caudal wichtig; dies wird unter anderem durch die für das Schwein typischen Haustren gewährleistet. Der beim Hund und Kaninchen recht stark ausgeprägte gastrocolische Reflex, der durch die Nahrungsaufnahme (Dehnung des Magens und Nährstoffanflutung im Duodenum) eine Stimulierung der Dickdarmmotorik bewirkt (EHRLEIN 2000c), ist beim Schwein ebenso wie beim Schaf nur gering ausgeprägt. 2.2.2 Einflüsse der Ration auf die Chymuspassage (Passagezeit) Unter physiologischen Umständen verbleibt die aufgenommene Nahrung 2 6 Stunden im Magen, bevor sie in den Dünndarm weitertransportiert wird. 4 6 Stunden ppr. flutet der Chymus an der ileocaecalen Fistel an (KEYS u. DEBARTHE 1974). DROCHNER (1984) beschrieb bereits 2 Stunden ppr. einen ersten ileocaecalen Digestafluss, maximale Flussraten jedoch ebenfalls 4 6 Stunden nach Futteraufnahme. Im Dickdarm verweilt der Chymus über einen längeren Zeitraum von ca. 24 Stunden (s. Abb. 2). 25
Schrifttum Oesophagus Magen: 2-6 h Pankreas Dünndarm: 4-6 h Dickdarm: 22-25 h Rektum Abb. 2: Verweildauer des Futterbreies in den einzelnen Abschnitten des Magen-Darm- Traktes (modifiziert nach KAMPHUES 2000 1 ) Bezogen auf die Gesamtretentionszeit beträgt die Verweildauer des Chymus bis zum Ende des Ileums (bis zur ileocaecalen Fistel) je nach Futterbeschaffenheit zwischen 14 (lösliche Futterbestandteile) und 31 % (große Partikel) (CLEMENS et al. 1975). Ausgehend von einer Dünndarmlänge von 20 m und einer Verweildauer im Dünndarm von 4 6 Stunden berechnete KAMPHUES (2000, pers. Mitteilung 1 ) bei Schweinen eine Passagegeschwindigkeit des Chymus von 5,6 cm / min. Die Passagerate des Nahrungsbreies hängt stark von der Struktur (Partikelgröße, Vermahlungsgrad), dem TS-Gehalt, der Zusammensetzung des Chymus (Qualität der Nährstoffe) sowie der Menge an aufgenommenem Futter (Quantität) ab. 2.2.2.1 Struktur des Futters Die Struktur des Futtermittels beeinflusst die Passagerate des Chymus. Im Magen werden durch einen Separationsprozess größere, feste und faserreiche Futterpartikel vom Pylorus zurückgehalten, um weiter zerkleinert und verflüssigt zu werden, bevor sie ins Duodenum entleert werden (DOUGHERTY 1965; PICKARD u. STEVENS 1972; ARGENZIO et al. 1974; CLEMENS et al. 1975). Feinvermahlenes Futter bewirkt bei Absatzferkeln eine beschleunigte Magenentleerung (KAMPHUES 1987). 1 pers. Mitteilung, Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues, Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Han- nover 26
Schrifttum Auch im Dickdarm erfolgt in Abhängigkeit von der anflutenden Menge (s.u.) eine verlängerte Retention der festen Phase des Chymus mit gröberen Partikeln (CLEMENS et al. 1975; KAMPHUES 1987). 2.2.2.2 TS-Gehalt im Futter Chymus mit einem niedrigen TS-Gehalt passiert den Magen schneller als solcher mit einem hohen Anteil an Trockensubstanz, da die Magenentleerung durch Flüssigkeit stimuliert wird (BRAUDE et al. 1970; DECUYPERE et al. 1985). Dies gewährleistet einen schnellen selektiven Abfluss der flüssigen Phase aus dem Magen in das Duodenum. Im weiteren Verlauf nach Nahrungsaufnahme nimmt die Entleerungsrate der Flüssigkeit exponentiell ab (EHRLEIN 2000a). Insgesamt ist die Passagedauer einer flüssigen Nahrung im gesamten Magen-Darm- Trakt verkürzt (COENEN 1986; KAMPHUES 1987). Die viskösen Anteile werden etwas langsamer weitergeleitet. 2.2.2.3 Chemische Zusammensetzung des Futters Eine wichtige Rolle in der Regulation der Chymuspassage spielen Feedback-Mechanismen. Die Magenmotorik wird unter anderem durch Hydrolyseprodukte aus dem Dünndarm gehemmt. Auch die Dickdarmmotorik wird durch Spaltprodukte der Nährstoffe beeinflusst: Kohlenhydrate (im Besonderen Glucose) haben aufgrund ihrer osmotischen Wirkung einen hemmenden Effekt auf die Magenentleerung (HUNT u. STUBBS 1975; MACGREGOR et al. 1978). Dabei ist nicht die Konzentration der Lösungen, sondern primär die Darmlänge und somit die Rezeptorzahl, auf welche die Glucose einwirken kann, ausschlaggebend für die Intensität der Hemmung der Magenentleerung (LIN et al. 1989). Hohe Fettmengen und dessen Hydrolyseprodukte wirken ebenfalls durch einen negativen Feedback-Effekt hemmend auf die Magenentleerung (HUNT u. STUBBS 1975; READ 1984). Ein erhöhter Rfa-Anteil in der Ration wirkt sich retardierend auf den praecaecalen Chymusfluss aus (DROCHNER 1984), bezogen auf den gesamten Magen-Darm-Trakt führt ein höherer Rfa-Anteil jedoch zu einer erheblichen Förderung der Passage. Da Ballaststoffe das Kotvolumen aufgrund ihrer Wasserbindungskapazität erhöhen, verkürzt sich die Passagezeit aufgrund einer durch Dehnungsreize erhöhten Peristaltik (CUNNINGS et al. 1978; DROCHNER 1984). Auch die Energiedichte des Futters hat Einfluss auf die Magenentleerung. Je kalorienreicher das Futter ist, desto weniger Chymus wird in den ersten 30 Minuten in das Duodenum entleert (HUNT u. STUBBS 1975; BURN- 27
Schrifttum MURDOCH et al. 1978). Ebenso hat die Osmolarität des Futterbreies einen Einfluss auf die Magenentleerung: Mahlzeiten niedriger Osmolarität bedingen eine vergleichsweise schnelle Magenentleerung. Zur Auslösung von Kontraktionen des Dickdarms ist Fett effektiver als Proteine und Kohlenhydrate (OEHLER 1988). Dies könnte unter anderem auf den motilitätssteigernden Effekt des Neurotensins zurückzuführen sein, das bei der Fettaufnahme freigesetzt wird. Aminosäuren wirken laut BATTLE et al. (1980) eher hemmend auf die Colonmotorik. 2.2.2.4 Futtermenge Eine hohe Futteraufnahme bewirkt eine Beschleunigung der Magen-Darm-Passage (ROTH 1984; KAMPHUES 1987). Dies wird u.a. durch Volumeneffekte (Dehnungsreize) des Chymus und durch eine mechanische Reizung der Darmwand verursacht. Aufgrund einer forcierten Passagerate wird die Kontaktzeit der Nährstoffe zu den bürstensaumständigen Enzymen verkürzt, wodurch diese in geringerem Maße abgebaut werden. 2.2.2.5 Exokrine Pankreasinsuffizienz Aufgrund eines Mangels an Lipasen und Proteasen bei der EPI werden die inhibitorischen Effekte, die durch die Abbauprodukte der Nahrungsbestandteile erzeugt werden (Aminosäuren und Fettsäuren), aufgehoben. Daraus resultiert bei EPI ein beschleunigter Weitertransport des Chymus aus dem Magen in den Dünndarm (MALLINSON 1968; KNOX und MALLINSON 1971). 28