Martin Raiber Chemie Protokoll Nr.5 Harnstoffspaltung durch Urease Versuch 1: Materialien: Reagenzglasgestell, Reagenzgläser, Saugpipetten, 100 ml-becherglas mit Eiswasser, 100 ml-becherglas mit Wasser von Zimmertemperatur, Wasserbad von ca. 40 C, Thermometer, Gasbrenner, Stoppuhr Chemikalien: 5%ige Harnstofflösung, Phenolphthaleinlösung, Urease-Aufschwemmung 0,1%, Bariumchloridlösung Durchführung: a) Wir gaben zu etwa 10 ml Harnstofflösung und 10 ml Thioharnstofflösung jeweils einige Tropfen Phenolphthaleinlösung, und versetzten diese Gemische mit jeweils 8 Tropfen Urease-Aufschwemmung. b) Wir gaben in 3 Reagenzglaser je 10 ml Harnstofflösung und fügten einige Tropfen Phenolphthaleinlösung hinzu. Wir stellten - das eine Reagenzglas in Eiswasser - eines bei Raumtemperatur (Temperatur notieren) - das dritte in ein Wasserbad von ca. 40 C Wir gaben nach etwa 5 Minuten in jedes Reagenzglas 3 Tropfen Urease- Aufschwemmung und wir stoppten die Zeit bis zum Farbumschlag. c) Wir gaben in drei Reagenzglaser je 2 cm hoch Wasser und fügten jeweils 10 Tropfen Urease-Aufschwemmung hinzu. Ein Reagenzglas kochten wir auf und ließen es wieder abkühlen. Zum zweiten gaben wir 10 Tropfen Bariumchloridlösung - das dritte diente als Kontrolle. Wir pipettierten in jedes Reagenzglas 4 ml Harnstofflösung und fügten je einen Tropfen Phenolphthaleinlösung hinzu. Beobachtungen: a) In der Harnstofflösung färbt sich das Phenolphthalein nach Zugabe von Urease rosa, in der Thioharnstofflösung nicht. b) Nach Zugabe der Urease in das Eiswasser war dieses trüb/milchig. Die Lösungen schlugen mit der vorgeschlagenen Ureasemenge nicht um. Bei Zugabe von mehr Urease ergab sich ein sehr schneller Umschlag und diese ungefähre Reihenfolge: 1. Eiswasser 2. Raumtemperatur 3. Wasserbad
c) In den beiden Reagenzgläsern findet kein Umschlag statt. Nur in dem zur Kontrolle dienenden Reagenzglas. Reaktionsgleichung: Somit ist eine Verfärbung des Indikators ein Beweis dafür, dass die Reaktion stattfindet. a) Urease ist ein Enzym d.h. es katalysiert nur bestimmte Reaktionen ->Substratspezifität Man kann sich die Wirkungsweise nach einem Schlüssel-Schloss-Prinzip vorstellen:
Das aktive Zentrum der Urease ist vollständig an den Harnstoff angepasst. Ändert der sich auch nur minimal ist es wahrscheinlich, dass die Urease den neuen Stoff (hier: Thioharnstoff) nicht mehr spalten kann. In diesem Fall ist das Schwefelmolekül sehr viel größer als das Sauerstoffmolekül. b) Die Reaktion ist stark temperaturabhängig. Dies kommt daher, dass das Substrat erst an das Enzym andocken muss - somit sich eine aktive Zone nur mit einem Substrat befassen kann. Eine Temperaturerhöhung beschleunigt den Andockvorgang und den Vorgang der Substratveränderung. Der Durchsatz an Reaktionen pro Zeiteinheit wird erhöht. c) Es finden keine Reaktionen bei den aufgekochten und mit Bariumchlorid versetzen Lösungen statt, weil diese Aktionen die Urease denaturierten. Das Abkochen zerstörte H-Brücken und das Bariumchlorid Ionenbindungen. Somit wurde die aktive Zone verändert und das Enzym war nicht mehr funktionsfähig. Fehleranalyse: Es gab erhebliche Schwierigkeiten bei Teilversuch b), was eine quantitative Messung unmöglich machte. Die Menge an Urease die vorgeschlagenen war reichte nicht aus um in einem angemessenen zeitlichen Rahmen zu einem Ergebnis zu führen. Wahrscheinlich war unsere Urease aufgrund der langen Lagerungszeit nicht mehr sehr wirkungsvoll. Wir waren also gezwungen Urease nachzuschütten, was uns nur noch eine qualitative Messung ermöglichte.
Versuch 2: Materialien: Computer, CASSY Lab, ph-einstabmesskette, Leitfähigkeits-Messzelle, Magnetrührer, Becherglas 250 ml, Bürette, Stativmaterial, Digital-Thermometer Chemikalien: Urease-Aufschwemmung 0,1%, Harnstofflösung 1%, Eiswasser, Wasserbad ca 40 C, Kupfersulfat Durchführung: Aufbau entsprechend Skizze: ph-wert und Leitfähigkeit wurden vom Sensor- CASSY über die ph-box an Eingang A und die Leitfähigkeitsbox an Eingang B gemessen. Wir füllten die 50 ml 1%ige Harnstofflösung ein und bestimmten die Temperatur. Wir tauchten die Elektrode ein und befestigten sie so, dass sie einerseits eine ausreichende Eintauchtiefe aufwies, andererseits aber auch nicht vom rotierenden Rührstäbchen getroffen wurde. Dann gaben wir 2 ml Ureaselösung in die Harnstofflösung. Gleichzeitig starteten wir die Messung durch Anklicken des entsprechenden Symbols. Als die Messkurve keine signifikanten Änderungen mehr vorwies, beendeten wir die Messung. Wir wiederholten den Versuch mit veränderter Temperatur und vergifteten auch einmal die Urease mit Kupfersulfat.
Beobachtungen: Leitfähigkeit bei verschiedenen Temperaturen Hier sieht man die Kurven bei 3 unterschiedlichen Temperaturen (C1=8 C, C2=20 C, C3=36 C ). Exemplarische Analyse bei t=300: C1=1,1 C2=2,73 C3=3,55 RGT-Regel: Verdoppelung der Temperatur führt zu einer 2-4-fach so schnellen Reaktion. Hier: 9 C zu 20 C ca. 2,5fache Reaktionsgeschwindigkeit 20 C zu 36 C ca. 1,3fache Reaktionsgeschwindigkeit
-> RGT-Regel nur zu einem gewissen Maß anwendbar Bei C3 wurde die Urease vergiftet, das heißt sie wurde mit dem Ionenbindungen zerstörenden Schwermetall Kupfersulfat denaturiert. Ab diesem Punkt kommt die Reaktion fast vollständig zum Erliegen. Das Enzym wirkt nicht mehr als Katalysator. Die Leitfähigkeit erhöht sich deswegen an diesem Punkt, weil das Schwermetall aus Ionen besteht. Leitfähigkeit und ph-wert bei Zimmertemperatur Hier erkennt man zusätzlich, dass ein gleichbleibender ph-wert bei dieser Reaktion nicht bedeutet, dass der Reaktion schon abgelaufen ist. Hier entsteht eine Pufferlösung zwischen dem entstehenden Ammoniak und den Ammonium-Ionen (siehe RG oben). Es entstehen also immer mehr Ionen aber der ph-wert ändert sich nicht mehr.
Leitfähigkeit und ph-wert bei 40 Durch ein Steigungsdreieck kommt man hier auf die Steigung m=0,0048. Bei der obrigen Kurve auf eine Steigung von m=0,0036. Das heißt diese Reaktion lief 1,35 Mal so schnell, wie die bei Zimmertemperatur ab, was das Ergebnis der obigen Leitfähigkeitsmessungen bestätigt. Fehleranalyse: Die Schwankungen beim ph-wert rühren vom fehlenden Magnetrührer her, auf den zugunsten einer konstanten Temperatur im Wasserbad verzichtet wurde.