Skript ab S57ff Flüssigchromatographie (liquid chromatography = LC) flüssige mobile Phase feste stationäre Phase 1
Flüssigchromatographie (LC) Die heute am häufigsten eingesetzte instrumentelle LC-Technik ist die HPLC high performance liquid chromatography ursprünglich: high pressure liquid chromatography Hochdruckpumpen zum Fördern der mobilen Phase (300 400 bar) Dicht gepackte Säulen mit kleinen Partikeln (µm-bereich) als stationäre Phase 2
LC: Einsatzbereich Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (also v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle) Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann: z.b. kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe Polymere grosse (Bio-)Moleküle (z.b. Proteine) Die Analyten müssen nur ausreichend in der mobilen Phase löslich sein. Es existieren verschiedene Trennprinzipien, welche Moleküle nach verschiedenen Eigenschaften trennen (z.b. Polarität, Ionenladung, Grösse) 3
LC: Trennprinzipien Trennmethode Trennprinzip Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 4
LC: Trennprinzipien Trennmethode Trennung nach... Normalphasen-HPLC Polarität (t R : polare > apolare Analyten) Umkehrphasen-HPLC Polarität (t R : apolare > polare Analyten) Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen Polarität.. Ladungsverschiebung à getrennte Ladungsschwerpunkte à Dipolmoment 5
Normalphasen- und Umkehrphasen-LC 6
Normalphasen- und Umkehrphasen-LC Normalphasen- (NP) und Umkehrphasen(RP)-HPLC machen den Grossteil aller flüssigchromatographischen Trennungen aus. Die RP-HPLC deckt etwa 70% aller Anwendungen ab. Methode stationäre Phase mobile Phase Elutionsreihenfolge NP-HPLC polar apolar apolare vor polaren Analyten RP-HPLC apolar polar polare vor apolaren Analyten NP- und RP-HPLC trennen die Moleküle nach ihrer Polarität. 7
Normalphasenchromatographie Stationäre Phase: polar (z.b. Kieselgel, Al 2 O 3 ) Mobile Phase: apolar (z.b. Hexan, Pentan) Polare Moleküle adsorbieren stark an die polare stationäre Phase und werden retendiert. Apolare Moleküle halten sich vor allem in der apolaren mobilen Phase auf und werden schnell eluiert. Geeignet für Moleküle, die in apolaren Lösungsmitteln löslich sind. 8
Umkehrphasenchromatographie Hydrophobisierung der Kieselgeloberfläche durch Reaktion mit Alkylchlorsilanen ODS = Octadecylsilan (C 18 bzw. RP18) 9
Umkehrphasenchromatographie Typische Umkehrphasen Am weitesten verbreitet ist die Octadecyl-Phase (auch C 18 oder RP18 genannt). 10
Umkehrphasenchromatographie Stationäre Phase: apolar (z.b. RP18-Kieselgel) Mobile Phase: polar (z.b. Wasser, Methanol, Acetonitril) Die Verteilung der Moleküle zwischen chemisch gebundener stationärer und mobiler Phase liegt für apolare Moleküle auf der Seite der stationären Phase, weshalb apolare Moleküle stärker retendiert werden als polare. Geeignet für Moleküle, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind (inkl. Wasser und wässrige Pufferlösungen). 11
Elutionsreihenfolge und elutrope Reihe 12
Elutionsreihenfolge Normalphasenchromatographie: apolare Moleküle eluieren vor polaren Molekülen n... <... < < gesättigte Kohlenwasserstoffe ungesättigte Kohlenwasserstoffe R aromatische Kohlenwasserstoffe O O O O < < NH 2 < ~ < O H Ether Ester Amine Aldehyde und Ketone OH O < < OH O NH 2 Alkohole Carbonsäuren Amide NP-Elutionsreihenfolge nach aufsteigender Retentionszeit geordnet. Umkehrphasenchromatographie: Elutionsreihenfolge dreht sich um 13
Elutionskraft Die Elutionskraft bezeichnet die Fähigkeit eines Lösungsmittels, Analytenmoleküle von der stationären in die mobile Phase zu überführen. Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Retentionszeiten. Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Verteilungskonstanten. Die Elutionskraft eines Lösungsmittels ist dann hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase ist. Analytenmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und brauchen eine mobile Phase mit hoher Elutionskraft, um eluiert zu werden. Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie. 14
Elutrope Reihe Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie. < < < n-heptan n-hexan n-pentan < < Cl Cl Cl Cl < < Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen Cl < < Cl O < < Cl Cl... Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform Fortsetzung è 15
Elutrope Reihe... Cl Cl < HO < H 3 C < CN < N Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril OH O H 3 C O S O < < O H 3 < < C 2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton O OH H 3 C OH O < < H N < H H < O H + Ionen H Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrige Pufferlösungen In der Umkehrphasenchromatographie dreht sich die Reihenfolge der Lösungsmittel im Vergleich zur hier gezeigten um. 16
Gradientenelution: Fliessmittelgradienten Eluent 1 geringe Elutionskraft Eluent 2 hohe Elutionskraft Gradient: Eluent 1 è Eluent 2 geringe è hohe Elutionskraft Meistens wird der Gradient so gewählt, dass die Elutionskraft während der Trennung ansteigt. 17
Aufbau einer HPLC-Anlage 18
Aufbau einer HPLC-Anlage Oft modularer Aufbau mit Modulen zum/ zur... Entgasen der Lösungsmittel Mischen von Lösungsmittelgradienten Pumpen der mobilen Phase Probeninjektion Trennung der Substanzen (Säule) Detektion der getrennten Substanzen 19
Aufbau einer HPLC-Anlage Entgaser Gradientenmischer Pumpe Eluentenvorrat Injektionsventil mit Probenschleife 20
HPLC-Injektionsventil 21
Aufbau einer HPLC-Anlage Gradientenmischer Entgaser Pumpe Computer Vorsäule Eluentenvorrat Injektionsventil mit Probenschleife Trennsäule Detektor Abfallgefäss 22
Fortsetzung: LC - Trennprinzipien Skript S79ff Trennmethode Trennprinzip Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC (Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Verteilung (und Adsorption) Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 23
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Stationäre Phasen: Meist Normalphasen (z.b. Kieselgel) oder Umkehrphasen (z.b. C18) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.b. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte) Mobile Phasen (Laufmittel): Lösungsmittel wie in der NP-HPLC und RP-HPLC Räumliche Trennung der Analyten auf der DC-Platte Analyten eluieren hier nicht von der stationären Phase Vorteile: einfach, kostengünstig, schnell (mehrere Proben gleichzeitig) 24
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Durchführung Auftragen der Proben Entwicklung (meist mit dünnen Kapillaren) 25
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Detektion: Visuell nur bei VIS-Absorbern (Farbstoffe) Fluoreszenzdetektion Auswertung: Anregung mittels UV-Lampe (254 oder 366 nm) Fluoreszierende Analyten è Autofluoreszenz UV-Absorber è Schwächung der Fluoreszenz eines Indikators in der Platte Chemische Anfärbemethoden z.b. H 2 SO 4 + Erhitzen è Schwarze, verkohlte Analytflecken z.b. KMnO 4 + Erhitzen è Flecken bei oxidierbaren Analyten Verzögerungsfaktor oder R F -Wert: R F = s x s f vgl. Retentionszeit LC bzw. GC! 26
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Beispiel: Standard Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC) IOWA DIVISION OF CRIMINAL INVESTIGATION! CRIMINALISTICS LABORATORY / DRUG IDENTIFICATION SECTION! 27
LC: Trennprinzipien Trennmethode Trennprinzip Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC (Dünnschichtchromatographie) Verteilung (und Adsorption) Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 28
Ionenchromatographie (IC) Ionenaustauschchromatographie (ion exchange chromatography = IEC) 29
Ionenchromatographie (IC) Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen Stationäre Phase: Ionenaustauscher (organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen) UV: 190 bis 400 nm Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher VIS: 400 (violett) bis Mobile 800 Phase: nm (rot) Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: oft Leitfähigkeitsdetektor (aber auch alle anderen LC-Detektoren im Prinzip möglich) + + + - - + - + - - + + - - + + - - + - + - + - + - - - + - + + + + 30
Ionenchromatographie (IC) Funktionelle Gruppen Eigenschaften Kationenaustauscher (negativ geladen) COOH, OPO 3 H 2 schwach sauer SO 3 H stark sauer Anionenaustauscher (positiv geladen) Primäre Amine NH 2 bzw. NH + 3 OH schwach basisch UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot) Quarternäre Ammoniumsalze NR 3 + OH stark basisch 31
Ionenchromatographie (IC) Mobile Phase: Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent + = H + ) Anionentrennung: z.b. NaHCO 3 -Lösung (Eluent = HCO 3 ) Prinzip: Gleichgewicht zwischen Analyt und Eluent. Menge und Stärke von Eluent entscheidet dann über Zeitpunkt der Elution! Kationentrennung: Harz SO 3 - Eluent + + Analyt + Harz SO 3 - Analyt + + Eluent + Anionentrennung: Harz NR 3 + Eluent - + Analyt - Harz NR 3 + Analyt - + Eluent - Trägermaterial 32
Ionenchromatographie (IC) Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit) Nicht immer leicht vorhersagbar, aber allgemein gilt: Stärker geladene und kleine Ionen binden stärker. Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet): Kationentrennung Li + < H + < Na + < NH 4 + < K + < Rb + < Cs + < Mg 2+ < Zn 2+ < Ca 2+ <Ba 2+ Anionentrennung Fluorid F - < Hydroxid OH - < Acetat CH 3 COO - < Chlorid Cl - < Nitrit NO 2 - < Bromid Br - < Nitrat NO 3 - < Iodid I - < Oxalat (COO) 2 2- < Sulfat SO 4 2- < Citrat C 6 H 5 O 7 3-33
Ionenchromatographie (IC) Beispiele Kationen Anionen 34
Ionenchromatographie (IC) Detektion: oft Leitfähigkeitsdetektor universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern (im Prinzip kann man aber auch alle anderen LC-Detektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten è Einsatz von Suppressorsäulen = entfernen von Störionen vor dem Detektor Trennsäule Suppressorsäule Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher 35
Ionenchromatographie (IC) Prinzip der Suppressorsäulen Anionentrennung (Beispiel: NaHCO 3 -Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl und Br ) Eluent: Harz SO 3 H + Na + + HCO 3 - Harz SO 3 Na + H 2 CO 3 Analyt 1: Analyt 2: Harz SO 3 H + Na + + Cl - Harz SO 3 Na + H + + Cl - Harz SO 3 H + Na + + Br - Harz SO 3 Na + H + + Br - Kationentrennung (Beispiel: HCl-Eluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na + und K + ) Eluent: Harz NR 3 OH + H + + Cl - Harz NR 3 Cl + H 2 O Analyt 1: Analyt 2: Harz NR 3 OH + Na + + Br - Harz NR 3 Br + Na + + OH - Harz NR 3 OH + K + + Br - Harz NR 3 Br + K + + OH - Erniedrigung der Grundleitfähigkeit und Erhöhung der Leitfähigkeit bei Anwesenheit von Analyten 36
LC: Trennprinzipien Trennmethode Trennprinzip Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC (Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Verteilung (und Adsorption) Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 37
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse (z.b. poröse Polymer oder Kieselgelpartikel) Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase (Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität) Unterteilung von SEC (size exclusion chromatography): UV: 190 bis 400 nm Gelpermeationschromatographie VIS: 400 (violett) bis (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten 800 nm (rot) (apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel) Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten (polare stationäre Phase, polares Lösungsmittel) 38
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden zurückgehalten. Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen Zu grosse Moleküle: Ausschlussgrenze Keine Diffusion in die Poren Keine Retention Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze Alle Moleküle können vollständig in die Poren eindringen Keine Retentionsunterschiede 39
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Retentionsvolumen V R V R = t R V V : Volumenstrom (ml/min) V R = V 0 + K C V i Molekülgrösse (logarithmische Achse) Ausschlussgrenze Permeationsgrenze V 0 V 0 + V i Retentionsvolumen (ml) V 0 : freies Lösungsmittelvolumen V i : Porenvolumen K C : Verteilungskonstante Alle Analyten verlassen zwischen V 0 und V 0 + V i die Säule. 40
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Beispiele: Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH 3 (CH 2 ) n COOH t R 1 log Molekulargewicht ( ) Trennung des Proteins Ovalbumin in seine mono-, di- und tetramere Form 41
Wann, welche Technik? (aus: Zusammenfassung S24) à Worin lösen sich die Analyten? à Polar/apolar/ionisch? à Molekulargewicht? 42
DETEKTOREN 43
Flüssigchromatographie (LC) Detektoren Detektor Trennsäule 44
1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible) UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot) Signal: Grundlinie: Prinzip: Extinktion von Eluent + Analyt Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen) Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer) 45
UV/VIS-Detektor Lichtintensität Lichtintensitä d Lambert-Beersches Gesetz E = lg I 0 I = ε ( λ ) c d I 0 Probe I E... Extinktion ε... Extinktionskoeffizient c... Konzentration Abstand d... Schichtdicke Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung ( extra column effects ) 46
UV/VIS-Detektor Lichtintensität Lichtintensitä d I 0 Probe I Abstand Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung ( extra column effects ) 47
Varianten des UV/VIS-Detektor Festwellenlängengeräte (z.b. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm) Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung Dioden array detektoren (DAD) 48
UV/VIS-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm) Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.b. Prisma + Spalt) 49
UV/VIS-Detektor Diodenarraydetektor (DAD) Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe) Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst. 50
UV/VIS-Detektor Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw. sichtbares Licht (VIS) absorbieren. Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwellig als die Eluentabsorption sein. UV/VIS-aktiv: R R R...... (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme Doppel- und Mehrfachbindungen Carbonylgruppen C=O Br, I 51
2. Brechungsindexdetektor (refractive index detector = RID) Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten Prinzip: Durchflussrefraktometer Messung der Änderung von Brechungswinkeln - Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert, aber unspezifisch - Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2 3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS- Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution. - Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein 52
Verdampfungs-Lichtstreudetektor (evaporative light scattering detector = ELSD) Signal: Intensität des an festen Analytpartikeln gestreuten Lichts Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt. Lösungsmittel verdampft Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst Universeller Detektor Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten Kompatibel mit Gradientenelution Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten 53
Fluoreszenz-Detektor I f I 0 Φ ε( λ ) Anregung c d I f... Fluoreszenzintensität Φ... Quantenausbeute ε... Extinktionskoeffizient c... Konzentration d... Schichtdicke λ Emission λ Anregung (Rotverschiebung) Im Gegensatz zu UV/VIS: Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0 Signal I 0 54
Fluoreszenz-Detektor Signal: Fluoreszenzintensität Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1) Detektion meist im 90 - Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung Sehr empfindlich (Faktor 100 1000 besser als UV/VIS) Nicht universell abhängig von der chemischen Natur der Analyten Nur fluoreszierende Analyten (z.b. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung 55
3.Massendetektoren Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man die Analytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impact ionization CI = Chemical Ionisation MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt) http://www.dgms-online.de/dgms1/wissen/das-ist-ms/massenspektrometer.php?navid=43 56
LC-ESI-MS (ESI = electrospray ionization) Ausgang der Trennsäule ESI produziert Pseudo- Molekülionen [M+H] + Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisionszelle möglich (z.b. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS) Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert) Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen 57
LC-APCI-MS (APCI = atmospheric pressure chemical ionization) Ausgang der Trennsäule Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisionszelle möglich (z.b. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS) Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert) Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet 58
Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC) Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber RID + universeller Detektor ELSD o ++ universeller Detektor Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten MS + / +++ + / ++ universeller Detektor + massenselektive Detektion + Massenspektren zur Strukturaufklärung Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie 59
Derivatisierung Derivatisierung: Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können. Umsetzung z.b. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern Fluoreszenz z.b. primäre Amine UV/VIS z.b. Aldehyde und Ketone H 3 C CH 3 N + H 2 N R - HCl H 3 C CH 3 N NO 2 NO 2 + O R 1 R 2 - H 2 O NO 2 NO 2 O S Cl O O S HN R O NH NH 2 NH N R 1 5-(N,N- Dimethylamino)- naphthalin- 1-sulfonylchlorid = Dansylchlorid Blau-blaugrün fluoreszierende Sulfonamide 2,4-Dinitrophenylhydrazin = DNPH R 2 DNP-Hydrazone λ max 360 nm 60
Beispiele: HPLC-Trennungen 61
Anwendungsbeispiele HPLC H 3 C O S O O H3 C O CH 3 Cl N O N H Trennung von Pestiziden Säule: C18 (RP) Eluenten: Wasser Acetonitril 55%:45% Flussrate: 1 ml/min Detektor UV λ = 225 nm 1. Benfuresate 2. Dymron 3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide 6. Iprodione Metabolite 7. Pencycuron t (min) 62
Anwendungsbeispiele HPLC Trennung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs) t (Minuten) Säule: C18 (RP) Eluenten: (A) Wasser (B) Acetonitril Gradient: 0 10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop Flussrate: 1 ml/min Detektor UV λ = 260 nm 63
Anwendungsbeispiele HPLC O N H Uracil NH O H 2 N N O CF 3 O H 3 C H N H H Sertralin Cl Cl HPLC-Trennung von Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva) Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Verunreinigung Fluvoxamin H N O Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer, ph 7) Acetonitril 40%:60% CF 3 Fluoxetin Flussrate: 1 ml/min Detektor: UV, λ = 230 nm Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase, gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase 64
Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC) Detektor Empfindlichkeit Analyten UV/VIS + UV- und VIS-Absorber Fluoreszenz +++ Fluorophore MS + / +++ universeller Detektor massenselektive Detektion MSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen: Fluorescein FITC fluorescin- Iso thiocyanate Emission bei höherer Wellenlänge! 65
UV Detektor Detektoren sind selektiv HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen. DAD = Diode Array Detektor 66
UV und RI Detektor Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren (1) Brechungsindexdetektor (RI): universell: erfasst alle Analyten (2) UV/VIS-Detektor (280 nm): für einige Analyten empfindlicher als RI Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural Peak 8: Ethanol J. Chromatograph. Sci. 39 (2001) 235 67
Massendetektoren Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu können, muss man diese vorher ionisieren = IONENQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impakt ionization CI = Chemical Ionization MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt) http://www.dgms-online.de/dgms1/wissen/das-ist-ms/massenspektrometer.php?navid=43 68
Massendetektoren 2 Spuren 3 1 2 "Chromatogram" TIC = total ion current Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen (CHO) Säule: Porous Graphitized Carbon (PGC) Eluenten: Wasser / Acetonitril Flussrate: 5 ul/min 2 1 Massenspur Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) 3 All (M-H)- 69
Massendetektoren Analyten getrennt betrachtbar 1 3 2 Chromatogram TIC = total ion current Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen (CHO) 1 SIM = single ion monitoring Säule: PGC m/z = 506 Eluenten: Wasser / Acetonitril 2 m/z = 426 Flussrate: 5 µl/min Detektor ESI-MS 3 m/z = 346 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) All (M-H)- 70
Anwendungsbeispiele HPLC TIC HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden A) Gesamtionenstrom (total ion current = TIC) B) Single ion monitoring = SIM Masse 1 Masse 2 Masse 3 Masse 4 71
Anwendungsbeispiele HPLC Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik oft auch bei MS nicht möglich. Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meist notwendig/sinnvoll à Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichen Massen (isobare Analyten) à Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzen der Probe (Salze, kleine polare Analyten...) Hunderte Analyten in einem kleinem Massenbereich Identifizierung nicht mehr möglich 72
Anwendungsbeispiele HPLC HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen) m/z = 342.2 m/z = 400.1 m/z = 404.0 m/z = 384.1 m/z = 331.0 m/z = 332.1 m/z = 706.4 m/z = 657.4 Aflatoxin B 1 Säule: C18 (RP) Eluent: Wasser (+ NH 4 OAc) + Acetonitril 73