HPLC Praktikum Skript

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1 HPLC Praktikum Skript Assistenten: Lukas Meier HCI E330, , [email protected] mon Weidmann HCI D330, , [email protected] Rui Wang HCI E331, , [email protected] Inhaltsverzeichnis 1. Theorie HPLC Gerät Der verwendete Chromatograph Aufgaben Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation des Chromatogrammes einer homologen Phenon Reihe Quantitative Analyse von Koffein in Energy Drinks Qualitative Analyse von Lidocain und Prilocain in EMLA Lokalanästhesie Crème und deren Verunreinigungen Literatur Theorie Die Trennung verschiedener Komponenten beruht auf unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften, im Allgemeinen in der Verteilung zwischen zwei Phasen, in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase, in der Permeabilität etc. Zur Einführung sollen die Seiten 1 18 aus dem Kapitel 1 Das Chromatogramm von D. Stauffer aus dem Buch Chromatogramme richtig integrieren und bewerten: Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC, Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans Joachim Kuss, 2008, WILEY VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, ISBN: gelesen werden. Das Kapitel ist auf zu finden. Das benötigte Passwort wird vom Assistenten im Voraus per Mail bekannt gegeben. Damit an den Versuchstagen effizient gearbeitet werden kann, ist eine seriöse Vorbereitung notwendig.

2 2. HPLC Gerät HPLC ist eine Methode der Flüssigkeits Chromatographie, bei der die Trennung unter hohem Druck (bis 300 bar bei einem Fluss von typischerweise 1 ml/min) abläuft. Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist licagel (Normalphasen HPLC) oder licagel modifiziert mit langen Alkylketten (Umkehrphasen HPLC). Die Partikelgrösse beträgt μm. Damit sind theoretische Trennstufen von bis zu N = möglich. Abbildung 1 Schematischer Aufbau einer HPLC Apparatur. 1 Laufmittelreservoir, 2 Laufmittel Degasser, 3 Ventil zum Einstellen des Gradienten, 4 Mischgefäss für Bereitstellung der mobilen Phase, 5 Hochdruckpumpe, 6 und 6 Sechskanalventil in Inject respektive Load Position, 7 Probenschleife, 8 Vorsäule, 9 Trennsäule, 10 Detektor, 11 Datenaquisition, 12 Abfall. (Graphik von Radbound University, Bioorganic chemistry, Nijmegen). licagel ist eine polare stationäre Phase. Somit sollte für eine gute Trennung eine apolare mobile Phase verwendet werden (z.b. Heptan, Dichlormethan). In Fall der Umkehrphasen HPLC ist das licagel chemisch modifiziert: Durch die Modifikation erhält man eine apolare berfläche. H H H H H H C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 H H H H H H C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 C18H37 Abbildung 2 Schematische Darstellung des Säulenmaterials einer Normalphasen (links) und einer Umkehrphasentrennsäule (rechts). Deshalb sollte bevorzugt eine polare mobile Phase verwendet werden (Methanol, Acetonitril, Wasser). Die Polarität der mobilen Phase kann über das Mischungsverhältnis zweier oder mehrerer Lösungsmittel kontinuierlich verändert werden. Der Einfluss der Laufmittel Polarität wird in Aufgabe 1 aufgezeigt.

3 2.1 Der verwendete Chromatograph Das im Praktikum verwendete System des Herstellers Shimadzu besteht aus mehreren separaten Komponenten: System Controller SCL 10A. Dieser Teil des Systems steuert die anderen Komponenten. Es ist möglich, das System manuell oder über die Software zu steuern. Der Diode Array Detector SPD 10A VP besteht aus vielen, gleichzeitig arbeitenden Dioden, die elektromagnetische Strahlung feststellen können. Jede Diode misst die Intensität innerhalb eines Spektralbereiches von 2 nm Breite. Man kann also gleichzeitig das ganze Spektrum im Bereich von nm messen. Es gibt drei Möglichkeiten, Messresultate zu visualisieren: 1) Chromatogramm bei einer bestimmten Wellenlänge 2) Maximum Absorbance Chromatogramm maximale Extinktion gemessen für jede Substanz im angegebenen Bereich 3) 3D Chromatogramm Zusammenfassung aller Chromatogramm im angegebenen Bereich Liquid Chromatograph LC 10A VP. In diesem Geräteteil befindet sich das eigentliche Herzstück des Trennsystems, die Säule mit der stationären Phase. Dazu gehört auch das Injektionsventil mit einem maximalen Probevolumen von 20 μl (wie bei unserem Versuch). Der Degasser DGU 14A reduziert gelöste Luft in der mobilen Phase, verhindert Luftblasen und Unregelmässigkeiten in der Basislinie. Die Vacuum Pump VCV 10AL VP saugt und mischt die Laufmittelkomponenten, kontrolliert die Flussgeschwindigkeit. Das Laufmittel kann aus maximal 4 Komponenten zusammengesetzt werden. Erst nach dem Mischen wird das Laufmittel unter Druck gesetzt. Pumpenparameter kann man manuell oder via Software einstellen. Der Druck sollte 200 bar nicht überschreiten. Wenn der Druck zu hoch oder zu niedrig ist, wird die Pumpe automatisch abgeschaltet. Wichtig: In den Kapillaren vor der Pumpe dürfen sich keine Luftblasen befinden, ansonsten muss die Purge Prozedur durchgeführt werden.

4 3. Aufgaben 3.1 Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation der Chromatogramme einer homologen Phenon Reihe Vorgehen: Eine verdünnte Lösung von Acetophenon, Propiophenon, n Butyrophenon und n Valerophenon in Acetonitril: Wasser (1:1) steht zur Verfügung (Konzentration pro Phenon: 100 g/l). Abbildung 3 Von links nach rechts, Acetophenon, Propiophenon, Butyrophenon und Valerophenon. Die beiden Chormatographen sind mit unterschiedlichen Säulen bestückt. Der Einfluss auf das Trennverhalten der folgenden Parameter wird untersucht: Laufmittelzusammensetzung (ACN:H 2, 50:50, 70:30, 80:20, 95:5) Flussrate ( ml/min, 0.5 ml/min, 0.75 ml/min, 1 ml/min) Partikelgrösse (3 m, 5 m) Die folgenden Kombinationen sollen gemessen werden: Tabelle 1 Übersicht über die in Versuch 3.1 zu messenden Parameter. Auf linkem HPLC Gerät (5 m Säule) Auf rechtem HPLC Gerät (3 m Säule) Lösungsmittelverhältnis [ACN : H 2 ] Flussrate [ml/min] Lösungsmittelverhältnis [ACN : H 2 ] Flussrate [ml/min] : : : : : : : : 5 1 Auswertung: Die Chromatogramme werden von Hand ausgewertet und zusammen mit dem Bericht abgegeben. Auf den Chromatogrammen werden die verwendeten Wendetangenten (analog [1]) eingezeichnet und die Basispeakbreite (in cm) ausgemessen und in eine zeitliche Peakbreite umgerechnet. Weiter werden folgende chromatographischen Parameter berechnet: Retentionszeit, Nettoretentionszeit, Kapazitätsverhältnisse, relative Retentionen, Trennstufenzahl, Auflösung. Dabei wird folgende Annahme getroffen: V 0 = 1 ml bei einer Flussrate von 1mL/min.

5 Diskussion: Besprechen sie anhand der gemessenen chromatographischen Parametern die Eigenheiten der Trennung wie z.b. Einfluss der Partikelgrösse, Analysedauer, Trennleistung. Bestimmen und begründen sie die optimalen Parameter für das vorliegende Trennproblem. 3.2 Quantitative Analyse von Koffein in Energy Drinks Vorgehen: Es wird eine 100 mg/l Coffein Stammlösung im Laufmittel (ACN:H2 (v:v, 15:85)) hergestellt. Aus dieser Stammlösung werden drei Kalibrationslösungen zwischen mg/l Coffein (im Laufmittel gelöst) hergestellt. Jede Kalibrationslösung wird dreimal bei 270 nm mit 1 ml/min Fluss gemessen. Es wird der Chromatograph mit der 3 m Säule verwendet. Der Energy Drink (auch Kaffee möglich, von Studenten mitgebracht) wird zum Entgasen durch einen 0.45 m Cellulosefilter filtriert und anhand der vom Hersteller deklarierten Coffeinmenge verdünnt. Dabei muss darauf geachtet werden, dass die verdünnte Konzentration dem gewählten Kalibrationsbereich entspricht. Auch diese Messung wird dreimal bei denselben Bedingungen gemessen. Abbildung 4 Strukturformel von Coffein. Auswertung: Das Flächenintegral des Coffeinpeaks wird mit den gemessenen Konzentrationen verglichen und eine Kalibrationsgerade erstellt. Die Konzentation der verdünnten Energy Drink Probe wird durch Vergleich des Flächenintegrals mit der Kalibrationsgerade bestimmt. Mithilfe des verwendeten Verdünnungsfaktors kann die tatsächliche Konzentration berechnet werden. Der Messfehler wird mithilfe der Student t Verteilung bestimmt. Diskussion: Es soll der gemessene Wert in Bezug zur Herstellerangabe gesetzt werden. Mögliche Fehlerquellen sollen eruiert und besprochen werden. Ebenfalls sollen mögliche Verbesserungen im Analyseprotokoll beschrieben werden.

6 3.3 Qualitative Analyse von Lidocain und Prilocain in EMLA Lokalanästhesie Crème und deren Verunreinigungen Vorgehen: Mithilfe einer Spritze wird eine 50 mg/ml Lösung der Crème im Laufmittel (0.18g/L NaH 2 P g/l Na 2 HP 4 in ACN:H 2 (v:v, 40:60), ph 8.0) hergestellt. Eine 1:10 Verdünnung dieser Lösung wird auf der 5 m Säule mit 1 ml/min getrennt und bei 230 nm detektiert. Eine Lösung der Verunreinigungen A (2,6 Dimethylanilin) und H (2 Chloro N (dimethylphenyl)acetamid) von Lidocain steht bereit. Die Konzentration beträgt 0.5mg/mL A sowie 5 mg/ml H. Diese Lösung wird ebenfalls 1:10 verdünnt und bei denselben Bedingungen gemessen. In einem weiteren Schritt wird eine mit Verunreinigungen versetzte Lösung der EMLA Crème gemessen. Dafür wird 1 Teil der Crème Lösung, 1 Teil der Verunreinigungslösung mit 8 Teilen des Laufmittels verdünnt und gemessen. In weiteren Schritten wird der Anteil der Verunreinigung um jeweils den Faktor 10, 100, 1000 verringert. Der Anteil der Crème bleibt gleich. Diese Lösungen werden ebenfalls bei den oben genannten Bedingungen analysiert. Abbildung 5 Strukturformeln von Prilocain (links) und Lidocain (rechts). Diskussion: Die Konzentration der Verunreinigung in der Crème wird mittels Standardaddition abgeschätzt. Dafür werden die Flächenintegrale der Verunreinigungen gegen die Konzentrationen aufgetragen. Diese Kalibrationsgerade wird auf das Flächenintegral der Verunreinigungen in der Crème extrapoliert. Die in der europäischen Pharmakopöe festgeschriebenen Grenzwerte der Verunreinigungen sollen überprüft und mit den abgeschätzten Konzentrationen verglichen werden. Da es sich bei dieser Methode lediglich um eine grobe Abschätzung der Konzentration handelt, ist keine Fehlerrechnung notwendig. Mögliche Fehlerquellen und Gründe für das eventuell erhöhte Vorhandensein der Verunreinigungen sollen diskutiert werden. 4. Literatur [1] Daniel Stauffer Das Chromatogramm in Chromatogramme richtig integrieren und bewerten: Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans Joachim Kuss, 2008, WILEY VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, ISBN: [2] European Pharmacopoeia ( ( )