Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.)
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- Evagret Schräder
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1 Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 Martin.pabst@org.chem.ethz.ch ETH Zurich Dr. Thomas Schmid schmid@org.chem.ethz.ch Wiederholung der letzten Einheit: Auflösung Wie Selektiv? Wie unterschiedlich sind die Gleichgewichtseinstellungen beider Analyten? (Kc1/Kc2) Wie lange ist der Analyt in der Säule? Wie viel mehr Zeit braucht der Analyt durch die Säule als die mobile Phase? (tr/tm) Wie viele Gleichgewichtseinstellungen? Wie breit sind meine Peaks? Höhe der theoretischen Böden und Länge der Säule R S = α 1 k 2 α 1+ k 2 N 4 α: Trennfaktor k: Retentionsfaktor N: Anzahl theoretischer Böden 2
2 Auflösung R S α 1 k = α 1+ k 2 2 N 4 k 1 + k N 4 α Erhöhung von α: Grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm k Erhöhung von k: bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten N Erhöhung von N: geringere Peakbreite (Standardabweichung σ) Veränderung von t R von zumindest einem Peak längere Analysenzeiten breitere Peaks Bei Optimieung durch L/u: Veränderung t R 3 k = t' / R t M Wechsel Stationäre/Mobile Phase N = L/ H höheres [u] geringeres [u] längere Säule L t R2 α = t t R2 M = = k 2 = K C 2 t R1 t M t R1 k 1 K C1 Peakbreite verändert sich nicht 4
3 Beschreibung der Effizienz der Chromatographie = Van Deemter Gleichung H wie breit werden die Peaks? U proportional zur Retentionszeit N = L/ H H H = A + B u +C u - A: Eddy-Diffusion B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte u: Lineare Flussgeschwindigkeit Lineare Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase + Optimum - Schlechter Bereich 5 Quantitative Analyse mittels Chromatographie Statistik und Kalibrierung Meist ist das WIEVIEL? genauso wichtig wie das WAS?! Allein die Dosis macht das Gift 6
4 Quantitative Analyse WAS? WIEVIEL? 7 Ein kleiner Ausflug in die Statistik 8
5 Statistische und systematische Fehler Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit 9 Statistische und systematische Fehler Schüsse 1 3 Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik 10
6 Mittelwert und Standardabweichung x Mittelwert : x = 1 n Standardabweichung σ σ x = n i =1 x i 1 n 1 n i =1 ( x i x ) 2 relative Standardabweichung σ rel,x : Häufigkeit eines Messwertes Messwerte x i σ rel, x = σ x x x 11 Angabe eines Analysenergebnisses In einem Analysenbericht muss ein Messergebnis immer mit einer Fehlerangabe versehen werden. Messergebnis mit absolutem Fehler: x ± σ x z.b µg/l ± 0.8 µg/l Messergebnis mit relativem Fehler: Häufigkeit eines Messwertes x ± σ rel,x z.b µg/l ± 7% Messwerte x i x 12
7 Kalibrierung Das Detektorsignal ist im Idealfall proportional zur Analytenmenge grössere Analytenmenge mehr Peakfläche Um das Detektorsignal in Mengenangaben umrechnen zu können (mg, mol, oder mg/ml.) muss man eine Kalibrierung vornehmen 13 Kalibrierung = a + b c Analyt y-achse: Detektorsignal z.b. in Volt oder Ampere (Peakfläche oder höhe) x-achse: Probenkonzentration z.b. in mg/l, µg/l, mol/l,... c Analyt 14
8 Empfindlichkeit und Nachweisgrenze Was gilt noch als Peak? 15 Empfindlichkeit und Nachweisgrenze Empfindlichkeit: = a + b c Analyt b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD): ( NG = A + 3σ 0 A 0 ) a b Minimale Konzentration deren Signal sich gerade noch also solches erkennen lässt bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschen unterscheidet. σ A0 = Standardabweichung des Blindwerts 3σ-Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σ A0 über dem Grundrauschen liegt. Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ): BG = A 0 + 6σ A 0 ( ) a b Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann. Die BG lässt sich nach dem 6 σ-kriterium ermitteln. Das Signal bei der BG liegt also 6 σ A0 über dem Grundrauschen. Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschen nicht mehr. 16
9 Linearität des Detektors = a + b c Analyt b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit unterer Bereich: LOD / LOQ, das Signal lässt sich vom Grundrauschen des Detektors nicht mehr unterscheiden oberer Bereich: Durch Überladung des Detektors kommt es zu keiner Signalzunahme mehr! Kalibrierung Kalibrierung ohne internen Standard Kalibrierung mit internem Standard Kalibrierung mittels Standardaddition 18
10 Kalibrierung ohne internem Standard (extern) c Analyt = a b = a + b c Analyt Bevorzugt eingesetzt, wenn: viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen, systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag, Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind. Limitierungen: Matrixeffekte und systematische Fehler 19 Kalibrierung mit internem Standard Allen Proben wird dieselbe Menge eines internen Standards hinzugefügt Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.b. während der Probenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.b. Aufkonzentrieren der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytenmolekülen bei der Filtration,...). interner Standard Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird. 20
11 Kalibrierung mit internem Standard Ein interner Standard soll: dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben nicht in der Probe vorkommen neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein Beispiel: Coffein Theophyllin Analyt Interner Standard Ideal: Stabilisotopen-markierte (z.b. D, 13 C) Analytenmoleküle als interner Standard und MS-Detektion. 21 Kalibrierung mit internem Standard A interner Standard = a + b c Analyt c internerstandard A Analyt a A interner Standard c Analyt = c interner Standard b Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis der Peakflächen bestimmt. Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probenaufarbeitung wie der Analyt Systematische Fehler können ausgeglichen werden. Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt. 22
12 Kalibrierung mittels Standardaddition Für die Kalibrierung werden keine Standardlösungen hergestellt, die Kalibrierung erfolgt in der Probe selbst. 1) Messung der Probe 2) Messung der Probe nach Zugabe bekannter Analytenkonzentration (Standard) c Analyt c Standard = + Standard 23 Kalibrierung mittels Standardaddition + Standard = a + b c Standard 24
13 Zusammenfassung Kalibrierung: Kalibrierung ohne internen Standard: einfachstes Kalibrierverfahren Fehler in der Aufarbeitung werden nicht berücksichtigt Matrixeffekte werden nicht kompensiert Kalibrierung mit internem Standard: Kompensation systematischer Fehler Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt Matrixeffekte werden nicht kompensiert Kalibrierung mittels Standardaddition Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard Matrixeffekte können kompensiert werden 25
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