Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale hawaiensis Cell type specification in the crustacean Paryhale hawaiensis Gerberding, Matthias Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Tübingen Korrespondierender Autor E-Mail: matthiasg@tue.mpg.de Zusammenfassung Die Embryonen aller Tiere legen früh vier verschiedene Zelltypen an. Wie dies passiert, ist eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie. Untersucht wird, wie dieser Prozess im 8-Zellstadium des Krebses Parhyale hawaiensis abläuft. Die Bildung der Keimzellen benötigt z.b. die Gene vasa und nanos. Ihre Funktion weicht von der in der Fliege Drosophila melanogaster ab. Dies verdeutlicht Funktionswechsel von Genen in der Evolution. Summary Animal embryos specify four early cell types. Determining the underlying mechanism is one central question of developmental biology. At present, it is studied how the crustacean Parhyale hawaiensis manages such developmental program at the eight-cell stage. Specification of germ cells, e.g., depends on the genes vasa a n d nanos, however, in a different way than in Drosophila melanogaster, demonstrating change of gene function during evolution. Die Festlegung von Zelltypen in frühen Embryonen Embryos bewältigen eine vielschichtige Aufgabe in der frühen Entwicklung. Zellen teilen sich nicht nur, sondern erzeugen einen komplexen Organismus mit vielen verschiedenen Zelltypen, die alle aus einer einzelnen Zelle hervorgehen, nämlich der befruchteten Eizelle. Untersucht wird, welche Programme diese Entwicklung steuern [1]. Forschungsgegenstand ist ein Organisms, der erst vor wenigen Jahren als Labortier eingeführt wurde: der Krebs Parhyale hawaiensis [2]. Die Frage nach der Festlegung von Zelltypen im Ei ist eine der Leitfragen der Entwicklungsbiologie. Mehrere Aspekte dieser Frage sind für verschiedene andere Labortiere bereits gut verstanden. Im 19. Jahrhundert führten erste Analysen der frühen Entwicklung bei den höheren, das heißt bilateral symmetrischen Tieren, zur Entdeckung von vier Zelltypen: den Keimzellen und den Zellpopulationen der drei Keimblätter. Die Keimzellen sind verantwortlich für die Reproduktion des Organismus. Die drei Keimblätter stellen das Ektoderm, Endoderm und Mesoderm dar, die, vereinfacht dargestellt, Aufgaben erfüllen als äußeres Schutzgewebe (Ektoderm), inneres Gewebe zur Verdauung (Endoderm) und dazwischen liegendes Muskelgewebe für die Bewegung (Mesoderm). Diese vier Zelltypen werden auch mit den heute eingesetzten Analyseverfahren als erste 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 1/6
Bausteine von Embryonen erkannt. Gene, welche die Bildung dieser Zelltypen steuern, wurden durch Untersuchungen der Modellorganismen Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans entdeckt. Diese Untersuchungen zeigten ein allgemein gültiges Prinzip, dass Komplexität im Embryo schrittweise angelegt wird. Die Vielfalt der verschiedenen Zelltypen entsteht durch eine Kette von binären Entscheidungen, bei denen Zellen Instruktionen bekommen, bestimmte Gene einzuschalten und andere Gene abzuschalten. Gemäß dieser genetischen Steuerung der Embryonalentwicklung proliferieren die Zellen nicht nur, sondern sie durchlaufen eine Kette von Stationen bis zu ihrer vollständigen Differenzierung. Diese Stationen ähneln Wegkreuzungen, an denen die Zellen eine von zwei möglichen Richtungen einschlagen können. Im Embryo des Krebses Parhyale hawaiensis legt eine invariante frühe Cell Lineage alle frühen Zelltypen fest Wie werden in dem Krebstier P. hawaiensis, verglichen mit D. melanogaster und C. elegans, die Keimzellen sowie Ektoderm, Endoderm und Mesoderm festgelegt? Diese Fragestellung wurde aufgeworfen durch die Entdeckung, dass die Zelltypen in P. hawaiensis in einer invarianten frühen Cell Lineage festgelegt werden [3]. Solche invarianten frühen Cell Lineages waren vor den Untersuchungen an P. hawaiensis für Krebse nicht aufgeklärt worden. Unter einer invarianten Cell Lineage versteht man die Koppelung eines Zelltyps an eine festgelegte Folge von Zellteilungen. Die Zellteilungen wiederum sind festgelegt in der Orientierung der Spindeln und der Aufteilung des Plasmas auf die Tochterzellen und erzeugen so in allen Embryonen eine immer wiederkehrende, stereotype Anordnung der Zellen. Die Cell Lineage von P. hawaiensis ist in zweierlei Hinsicht invariant: Zum einen werden in der dritten zygotischen Teilung immer vier größere und vier kleinere Zellen erzeugt. Zum anderen sind alle diese Zellen bereits darin festgelegt, welcher Zelltyp aus ihren Tochterzellen hervorgeht. Dies wurde aus Experimenten abgeleitet, bei denen in die Zellen des 8-Zellstadiums Farbstoff injiziert wurde und für jede der je acht Zellgruppen, die aus einer injizierten Zelle hervorgegangen sind, bereits getrennte Zelltypen auftraten. Von den vier größeren Zellen bilden drei ausschließlich Ektodermzellen, während eine ausschließlich Zellen des vorderen Mesoderms erzeugt. Von den vier kleineren Zellen bilden zwei die Zellen des hinteren Mesoderms, eine die Zellen des Endoderms, und die kleinste schließlich bildet die Keimzellen [3]. Dies bedeutet, dass die sehr kleine Zahl von lediglich acht Zellen, die nach nur drei zygotischen Zellteilungen nach der Befruchtung entstanden sind, bereits ausreichend unterschiedliche Instruktionen bekommen hat, um je einen der vier genannten Zelltypen auszubilden (Abb. 1). Diese Aufteilung der vier Zelltypen im 8-Zellstadium läuft in P. hawaiensis deutlich früher ab als in anderen Tieren. Diese frühe Aufteilung der Zelltypen unterstützt und erleichtert die Suche nach denjenigen Genen, die diesen acht Zellen Instruktionen erteilen. 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 2/6
Cell Lineage in Parhyale hawaiensis am Beispiel der drei Vorläuferzellen für das Ektoderm. (a) 8-Zellstadium, die drei Vorläuferzellen des Ektoderm s wurden m it drei verschiedenen Farbstoffen injiziert. (b) Die drei Zellen haben nach weiteren Zellteilungen am Vorderende des Em bryos drei Ektoderm - Klone erzeugt, erkennbar wieder an den drei verschiedenen Farben, die nahtlos aneinander grenzen. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Gerberding Bei der Ausrichtung unserer Experimente mit P. hawaiensis orientieren wir uns an dem für andere Modellorganismen bereits erzielten tiefgreifenden Verständis der frühen Entwicklung. Dabei verfolgen wir den so genannten Kandidatengen-Ansatz. Mit diesem Ansatz testet man die Rolle derjenigen Gene in den Embryonen von P. hawaiensis, deren Rolle in den Modellorganismen bereits charakterisiert wurde. Im Kandidatengen-Ansatz werden also keine neuen Gene identifiziert, sondern unterschiedliche homologe Gene bezüglich ihrer Funktion in den verschiedenen Organismen miteinander verglichen. Unter homologen Genen versteht man solche, die mindestens zwei Organismen in ihren jeweiligen Genomen aufweisen, sie stammen von einem Gen eines gemeinsamen Vorfahren ab. Nicht-homologe Gene dagegen sind solche, die unabhängig voneinander durch Konvergenz entstanden sind und dem gemeinsamen Vorfahren fehl(t)en. Unter den Modellorganismen stellt die Fruchtfliege D. melanogaster den evolutionär nächsten Verwandten von P. hawaiensis dar. Deshalb gibt es Grund zu der Annahme, dass die Keimblattbildung bei P. hawaiensis ähnlichen Regeln folgt wie in der Fruchtfliege. Dort steuern Transkriptionsfaktoren die Festlegung von Keimzellen, Ektoderm, Endoderm und Mesoderm, indem sie dafür sorgen, dass die Zellen jedes Zelltyps ganz bestimmte Gene, die für die Ausbildung ihres Zelltyps benötigt werden, in Boten-RNA (mrna) umschreiben, und ganz bestimmte andere Gene, die für die Ausbildung eines anderen Zelltypes nötig sind, gerade nicht umschreiben. Eine Reihe von Unterschieden zwischen D. melanogaster und P. hawaiensis lassen erwarten, dass dieser Mechanismus von D. melanogaster nicht eins zu eins auch auf P. hawaiensis übertragen werden kann. So werden die Keimblätter in D. melanogaster nicht bereits im 8-Zellstadium festgelegt, sondern erst nach mehr als einem Dutzend Teilungen, wenn der Embryo bereits Tausende von Zellen besitzt. Weiterhin ist die frühe Furchung von D. melanogaster syncytial, das heißt, nur die Kerne trennen sich voneinander, während sie weiter von einem gemeinsamen Zytoplasma umgeben sind. Bei P. hawaiensis dagegen ist die Furchung von Anfang an total, also Kern und Zytoplasma der Tochterzellen werden vollständig durch neue Membranen voneinander getrennt. Deshalb ist zu erwarten, dass in P. hawaiensis Kandidatengene andersartig ausgeprägt sind [4]. Die Untersuchung des genetischen Programms in P. hawaiensis zielt ab auf einen detaillierten Vergleich mit D. melanogaster. Dieser Vergleich stellt einen Einblick her in den Ablauf der Evolution von Insekten und Krebsen, die durch D. melanogaster und P. hawaiensis repräsentiert sind. Dabei geht es um die Beantwortung der Frage, wie bei der Aufspaltung der gemeinsamen Stammlinie in die zwei Linien Insekten und Krebse vor etwa 500 Millionen Jahren die Unterschiede in der frühen Entwicklung evolvierten. 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3/6
Die Gene vasa, nanos sowie beta- catenin sind in P. hawaiensis zu anderen Zeitpunkten an der Festlegung der Keimzellen beteiligt als in D. m elanogaster Bei der Suche nach Genen, die die Bildung der Keimzellen steuern, wurden die zwei Kandidatengene vasa und nanos aus P. hawaiensis kloniert. Für D. melanogaster war bekannt, dass deren Transkripte (mrnas) unverzichtbar für die Bildung von Keimzellen sind. Bei P. hawaiensis verhalten sich diese beiden mrnas anders als bei D. melanogaster. Boten-RNA, transkribiert von vasa und nanos, wird im Krebs vom 1- bis zum 16- Zellstadium in allen Zellen gefunden. Erst ab dem 32-Zellstadium beschränkt sich die Verteilung der vasa und nanos mrna auf die Keimzellen. Neben dieser unerwarteten räumlichen und zeitlichen Dynamik für diese mrnas haben wir ein weiteres Gen gefunden, dessen mrna in den Keimzellen akkumuliert, jedoch früher als mrna von vasa und nanos. Bei einer Durchmusterung für Gene, die an Signaltransduktionen beteiligt sind, konnte gezeigt werden, dass sich die mrna des Gens beta-catenin bereits im 1-Zellstadium, also noch vor der ersten Zellteilung nach Befruchtung, auf ein punktförmiges abgegrenztes Gebiet an der Oberfläche der Eizelle konzentriert. In den darauf folgenden Teilungen wird die beta-catenin mrna immer nur an eine von zwei Tochterzellen weitergegeben und verbleibt schließlich in der Zelle, die die Keimzellen hervorbringt. Die Verteilung bestimmter Boten-RNAs ist aber noch keine vollständige Erklärung eines solch komplexen Entwicklungsprogramms. Deshalb wird versucht, Gene gezielt auszuschalten, um ihre Funktion genau zu studieren. Die Injektion von antisense RNA beispielsweise ist ein Weg, die Menge eines ausgewählten Genprodukts, wie eben der mrna, zu reduzieren. Antisense RNA ist in ihrer Nukleotidabfolge komplementär zu derjenigen mrna, deren kodierendes Gen ausgeschaltet werden soll. Durch ihre Komplementarität bindet die antisense RNA an das Start-Codon der mrna und hemmt damit deren Translation mit der Folge, dass kein Protein gebildet werden kann die Genexpression wird damit inhibiert. Zum ersten Mal seit Beginn der Untersuchungen an P. hawaiensis im Jahr 1999 und als erstem Labor weltweit gelang es, die Translation von vasa und nanos mit Hilfe von antisense Morpholinos zu hemmen, einer zur antisense-rna alternativen Technik. In den Experimenten zeigten die zwei vasa und nanos Morpholinos unterschiedliche Effekte auf die Bildung der Keimzellen in P. hawaiensis: In keinem der beiden Morpholino- Experimente wurde die frühe Bildung der Keimzellen unterbunden, aber in beiden Experimenten gingen die Keimzellen nach der Gastrulation zugrunde. Im Fall von vasa wurde die Teilung der Keimzellen nach der Gastrulation angehalten. Im Fall von nanos war nicht nur die Teilung der Keimzellen gestoppt, sondern auch ihre Wanderung herabgesetzt (Abb. 2). Im Versuch mit vasa konnte detailliert aufgeklärt werden, dass der Embryo nicht mit von der Mutter ins Ei gelegtem Protein ausgestattet ist und dass die mrna in der Zeit, in der sie vom 1-Zellstadium bis zum 32-Zellstadium noch in allen Zellen vorliegt, nicht zu Protein translatiert wird. Dies wurde erst lange nach ihrer Lokalisierung in die Keimzellen, nämlich im 175-Zellstadium, beobachtet. 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 4/6
Rolle von vasa in der Bildung der Keim zellen. (a - c) Keim zellen in der norm alen Entwicklung: (a) Die kleinste Zelle im 8-Zellstadium ist die Vorläuferzelle für die Keim zellen, (b) 30 % Entwicklungsfortschritt: Die Keim zellen bilden ein Cluster (Pfeile), (c) 40 % Entwicklungsfortschritt: Das Cluster hat sich geteilt. (e - g) Bildung von Keim zellen bei gleichzeitiger Inhibition der Translation durch vasa Morpholinos: (e) Injektion des Morpholinos in die kleinste Zelle, (f) das Cluster ist kleiner als in Kontrollen, (g) das Cluster teilt sich nicht, die Zellen sterben. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Özhan Fazit Unsere Tests zur Funktion von vasa und nanos in P. hawaiensis zeigen deutlich, dass diese zwei Gene anders als bei D. melanogaster keine frühe Rolle in der Bildung von Keimzellen spielen, jedoch genauso wie bei D. melanogaster eine späte Rolle. Die Expression des Gens beta-catenin in den Keimzellen stellt wiederum einen Fall dar, in dem mrna unerwartet in ihrer Verbreitung innerhalb der Zelle eng eingegrenzt ist. Für die Spezifizierung der Keimzellen konnte gezeigt werden, dass die frühen Embryonen von P. hawaiensis und D. melanogaster sich nicht nur auf den zwei Ebenen ihrer Morphologie und der Ausbildung einer Cell Lineage unterscheiden, sondern auch auf der Ebene der unterschiedlichen zeitlichen wie räumlichen Expression homologer Gene. In einem anderen Projekt werden Gene aus P. hawaiensis analysiert, deren Homologe auch im Mesoderm von D. melanogaster exprimiert werden. Auch hier hat sich durch Arbeiten in unserem Labor und in dem Labor von Nipam Patel in Berkeley gezeigt, dass diese Gene in P. hawaiensis andere zeitliche und räumliche Expressionsmuster und auch andere Funktionen haben als bei D. melanogaster [4]. In der Gesamtschau wird damit deutlich, wie die Funktion von homologen Genen im Verlauf der Evolution wechselt. Als langfristiges Ziel möchten wir verstehen, wie alle Zelltypen des 8- Zellstadiums im Embryo von P. hawaiensis festgelegt werden und wie die Evolution der Arthropoda (= Gliedertiere) die Funktionen homologer Gene in der frühen Embryonalentwicklung derart abgewandelt hat, dass sie so unterschiedliche Entwicklungsmechanismen wie in D. melanogaster und P. hawaiensis steuern können. Originalveröffentlichungen 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 5/6
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