Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/ ETH Zurich Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch Zusammenfassung der letzten Einheit: HPLC high performance liquid chromatography Normal Phase = NP (Normalphasen auch HILIC) Reversed Phase = RP (Umkehrphasen) polare (hydrophile) stationäre Phase wasserliebend apolare (hydrophobe) stationäre Phase wasserabweisend 2
Zusammenfassung der letzten Einheit: NP und RPHPLC trennen die Moleküle nach ihrer Polarität Polarität ( entsteht durch die Ausbildung elektrischer Dipole. Große Unterschiede in der Elektronegativität der Atome führt zu ungleich verteilten Bindungselektronen) O, N und Halogene werden negativ polarisiert C und H positiv polarisiert Verbindungen der beiden Gruppen miteinander generiert mehr oder weniger polare Moleküle Daraus leitet man die Elutrope Reihe ab Für die Trennung gilt dann: Gleiches löst Gleiches Analytenmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und werden nur von einer mobilen Phase mit hoher Elutionskraft eluiert. Die Elutionskraft einer mobilen Phase ist hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase wird. 3 Fortsetzung: LC Trennprinzipien Skript S79ff Trennmethode NormalphasenHPLC UmkehrphasenHPLC (Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Grössenausschlusschromatographie Affinitätschromatographie Chirale Chromatographie Trennprinzip Adsorption (und Verteilung) Verteilung (und Adsorption) Ionische Wechselwirkung Grössenausschluss Bindungsaffinität (nichtkovalent) Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 4
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Stationäre Phasen: Meist Normalphasen (z.b. Kieselgel) oder Umkehrphasen (z.b. C 18 ) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.b. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte) Mobile Phasen (Laufmittel): Lösungsmittel wie in der NPHPLC und RPHPLC Räumliche Trennung der Analyten auf der DCPlatte Analyten eluieren hier nicht von der stationären Phase! Vorteile: einfach, kostengünstig, schnell (mehrere Proben gleichzeitig) 5 Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Durchführung Auftragen der Proben (meist mit dünnen Kapillaren) Entwicklung 6
Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Auswertung: Detektion: Visuell nur bei VISAbsorbern (Farbstoffe) Fluoreszenzdetektion Anregung mittels UVLampe (254 oder 366 nm) Fluoreszierende Analyten Autofluoreszenz UVAbsorber Schwächung der Fluoreszenz eines Indikators in der Platte Chemische Anfärbemethoden z.b. H 2 SO 4 Erhitzen Schwarze, verkohlte Analytflecken z.b. KMnO 4 Erhitzen Flecken bei oxidierbaren Analyten Verzögerungsfaktor oder R F Wert: R F = s x s f vgl. Retentionszeit LC bzw. GC! 7 Dünnschichtchromatographie (DC / TLC) Beispiel: Standard Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC) IOWA DIVISION OF CRIMINAL INVESTIGATION CRIMINALISTICS LABORATORY / DRUG IDENTIFICATION SECTION 8
LC: Trennprinzipien Trennmethode NormalphasenHPLC UmkehrphasenHPLC (Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Grössenausschlusschromatographie Affinitätschromatographie Chirale Chromatographie Trennprinzip Adsorption (und Verteilung) Verteilung (und Adsorption) Ionische Wechselwirkung Grössenausschluss Bindungsaffinität (nichtkovalent) Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 9 Ionenchromatographie (IC) Ionenaustauschchromatographie (ion exchange chromatography = IEC) 10
Ionenchromatographie (IC) Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen Stationäre Phase: Ionenaustauscher (organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen) UV: 190 bis 400 nm VIS:400 (violett) bis Mobile 800 Phase: nm (rot) Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher oft Leitfähigkeitsdetektor (aber auch alle anderen LCDetektoren im Prinzip möglich) 11 Ionenchromatographie (IC) Funktionelle Gruppen Eigenschaften Kationenaustauscher (negativ geladen) COOH, OPO 3 H 2 schwach sauer SO 3 H stark sauer Anionenaustauscher (positiv geladen) Primäre Amine NH 2 bzw. NH 3 OH schwach basisch UV: 190 bis 400 nm VIS:400 (violett) bis 800 nm (rot) Quarternäre Ammoniumsalze NR 3 OH stark basisch 12
Ionenchromatographie (IC) Mobile Phase: Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent = H ) Anionentrennung: z.b. NaHCO 3 Lösung (Eluent = HCO 3 ) Prinzip: Gleichgewicht zwischen Analyt und Eluent. Menge und Stärke von Eluent entscheidet dann über Zeitpunkt der Elution! Kationentrennung: Harz SO 3 Eluent Analyt Harz SO 3 Analyt Eluent Anionentrennung: Harz NR 3 Eluent Analyt Harz NR 3 Analyt Eluent Trägermaterial 13 Ionenchromatographie (IC) Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit) Nicht immer leicht vorhersagbar, aber allgemein gilt: Stärker geladene und kleine Ionen binden stärker! Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet): Kationentrennung Li < H < Na < NH 4 < K < Rb < Cs < Mg 2 < Zn 2 < Ca 2 <Ba 2 Anionentrennung Fluorid F < Hydroxid OH < Acetat CH 3 COO < Chlorid Cl < Nitrit NO 2 < Bromid Br < Nitrat NO 3 < Iodid I < Oxalat (COO) 2 2 < Sulfat SO 4 2 < Citrat C 6 H 5 O 7 3 14
Ionenchromatographie (IC) Beispiele Kationen Anionen 15 Ionenchromatographie (IC) Detektion: oft Leitfähigkeitsdetektor universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern (im Prinzip kann man aber auch alle anderen LCDetektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten Einsatz von Suppressorsäulen = entfernen von Störionen vor dem Detektor Trennsäule Suppressorsäule Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher 16
Ionenchromatographie (IC) Prinzip der Suppressorsäulen Anionentrennung (Beispiel: NaHCO 3 Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl und Br ) Eluent: Harz SO 3 H Na HCO 3 Harz SO 3 Na H 2 CO 3 Analyt 1: Analyt 2: Harz SO 3 H Na Cl Harz SO 3 Na H Cl Harz SO 3 H Na Br Harz SO 3 Na H Br Kationentrennung (Beispiel: HClEluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na und K ) Eluent: Harz NR 3 OH H Cl Harz NR 3 Cl H 2 O Analyt 1: Analyt 2: Harz NR 3 OH Na Br Harz NR 3 Br Na OH Harz NR 3 OH K Br Harz NR 3 Br K OH Erniedrigung der Grundleitfähigkeit und Erhöhung der Leitfähigkeit bei Anwesenheit von Analyten 17 LC: Trennprinzipien Trennmethode Trennprinzip NormalphasenHPLC UmkehrphasenHPLC (Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Adsorption (und Verteilung) Verteilung (und Adsorption) Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss Affinitätschromatographie Chirale Chromatographie Bindungsaffinität (nichtkovalent) Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren 18
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse (z.b. poröse Polymer oder Kieselgelpartikel) Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase (Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität) Unterteilung von SEC (size exclusion chromatography): UV: 190 bis 400 nm Gelpermeationschromatographie VIS:400 (violett) bis (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten 800 nm (rot) (apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel) Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten (polare stationäre Phase, polares Lösungsmittel) 19 Grössenausschlusschromatographie (SEC) Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden zurückgehalten. Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen Zu grosse Moleküle: Ausschlussgrenze Keine Diffusion in die Poren Keine Retention Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze Alle Moleküle können vollständig in die Poren eindringen Keine Retentionsunterschiede 20
Grössenausschlusschromatographie (SEC) Retentionsvolumen V R V R = t R V V : Volumenstrom (ml/min) V R = V 0 K C V i Molekülgrösse (logarithmische Achse) Ausschlussgrenze Permeationsgrenze V 0 V 0 V i Retentionsvolumen (ml) V 0 : freies Lösungsmittelvolumen V i : Porenvolumen K C : Verteilungskonstante Alle Analyten verlassen zwischen V 0 und V 0 V i die Säule. 21 Grössenausschlusschromatographie (SEC) Beispiele: Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH 3 (CH 2 ) n COOH t R 1 log Molekulargewicht ( ) Trennung des Proteins Ovalbumin in seine mono, di und tetramere Form 22
Wann, welche Technik? (aus: Zusammenfassung S24) Worin lösen sich die Analyten? Polar/apolar/ionisch? Molekulargewicht? 23