4. Flüssigchromatographie

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1 4. Flüssigchromatographie 4.1 Einleitung/Messprinzip Als Flüssigchromatographie werden jene chromatographischen Verfahren bezeichnet, bei denen als mobile Phase eine Flüssigkeit verwendet wird. Die stationäre Phase wird entweder in Säulen eingefüllt (Säulenchromatographie) oder auf Platten aufgebracht (Flachbettverfahren: Dünnschichtchromatographie und Papierchromatographie). Für die Bezeichnung der heute üblichen Flüssigkeits-Chromatographie hoher Trennleistung werden die folgenden Ausdrücke verwendet: Hochleistungs-Flüssigchromatographie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Hochdruck-Flüssigchromatographie High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Der grosse praktische Durchbruch der Flüssigchromatographie kam mit dem Gebrauch von Hochdruckpumpen, die einen Druck von bar aufrechterhalten können. Dies erlaubt den Einsatz von sehr dicht gepackten Säulen, was wesentlich die Trenneffizienz der Methode beeinflusst. Die HPLC hat sich zu einer leistungsfähigen Trenn- und Analysentechnik entwickelt, deren Anwendungsbereich von der Analytik von anorganischen und organischen Ionen, neutralen organischen Stoffen, organometallischen Komplexen bis zu den Biopolymeren und Polymeren reicht. Diese Anwendungsbreite und ihre Verwendung als Analysentechnik haben sie zu einem unentbehrlichen Werkzeug in der Umweltanalytik, pharmazeutischen Industrie, Lebensmittelchemie und Biochemie werden lassen. Die moderne HPLC ergänzt die stoffbedingt eingeschränkten Möglichkeiten der unzweifelhaft höchst leistungsfähigen Kapillargaschromatographie. Ein wesentlicher Unterschied der Flüssigchromatographie gegenüber der Gaschromatographie besteht darin, dass auch sehr polare und thermisch labile Substanzen behandelt werden können. Voraussetzung ist aber eine ausreichende Löslichkeit des Analyten im Laufmittel. Prinzip der Flüssigchromatographie bwohl sich die HPLC bezüglich ihrer technischen Anforderungen eindeutig charakterisieren lässt, ist eine klare Abgrenzung und systematischen Klassifizierung gegenüber anderen Trennverfahren auf der Basis der zugrunde liegenden Mechanismen schwierig. In der präparativen Säulenchromatographie (zur Aufreinigung organischer Verbindungen) oder der Dünnschichtchromatographie sind gleiche Trennmechanismen wirksam. Andererseits kann die Ionenchromatographie, die sich über ihren Trennmechanismus deutlich abgrenzen lässt, mit einer typischen HPLC-Anlage durchgeführt werden. Je nach Art der möglichen Wechselwirkungen der Stoffe mit der stationären Phase wirken folgende Trennmechanismen: Normalphasenchromatographie Adsorption/Verteilung Umkehrphasenchromatographie Verteilung/Adsorption Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse Ionenaustauschenchromatographie Ionische Wechselwirkung Affinitätschromatographie Ligand-Bindungsaffinität Komplexierungschromatographie Metal-Ligand-Komplexierung Chiralchromatographie Diastereomere-Bildung 42

2 Aufgrund der grossen Bedeutung (rund 80% der Anwendungen) der Umkehrphasen- Flüssigkeitschromatographie (Reversed Phase Liquid Chromatography RPLC) wird diese Technik anhand vieler Beispiele besonders ausführlich behandelt. In der RPLC erfolgt die Trennung der Komponenten eines Substanzgemisches durch ein Phasensystem bestehend aus der polaren mobilen Phase und der unpolaren stationären Phase. Die Probenkomponenten stören in Abhängigkeit von ihren hydrophoben Eigenschaften die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Molekülen der mobilen wässrigen Phase unterschiedlich stark. Die Analyten werden daher aus der mobilen Phase herausgedrückt und an dem hydrophoben Reversed-Phase-Kieselgel bzw. Polymerträger mit zunehmenden hydrophoben Charakter verzögert. Je lieber sich das Analytmolekül in der mobilen Phase aufhält, umso schneller durchläuft es die Trennstrecke. Stark hydrophobe Probemoleküle (z.b.: polycyclische Kohlenwasserstoffe) halten sich somit länger an der stationären Phase auf (werden stärker retardiert) als Verbindungen mit polaren funktionellen Gruppen (z.b.: Phenol, Anilin). Die Retentionskraft der stationären Phase steigt mit ihrer Hydrophobizität, d.h. mit der Kettenlänge der Alkylgruppen auf ihrer berfläche. Über die Art der gebundenen Gruppen ist die Selektivität der Phase für bestimmte Stoffklassen veränderbar. Beiträge zur Bodenhöhe Der Kurvenverlauf der van-deemter-gleichung ist in unterstehender Abbildung qualitativ dargestellt. bwohl sich die Kurvenverläufe in der Gas- und der Flüssigchromatographie ähneln, bestehen einige quantitative Unterschiede. Während man für die Gaschromatographie van-deemter-kurven mit einem breiten Minimum beobachtet, erhält man in der Flüssigchromatographie meist sehr schmale Minima, deren zugehörige Lineargeschwindigkeiten deutlich kleiner sind. H = 2λ d p + 2k D D M u f (d 2 + u p,d 2 c ) D M + q k d 2 f (1+ k) 2 D S Theoretische Bodenhöhe H! Minimum H! Minimaler H-Wert! optimale u! Die Eddy Diffusion tritt bei der gepackten HPLC-Säule viel stärker als bei der Kapillarsäule auf, kann aber durch die Wahl kleiner und kugelförmiger Partikel sowie durch Homogenität und Dichte der Säulenpackung reduziert werden. Je kleiner und sphärischer die eingesetzten Partikel der stationären Phase sind, desto geringer ist der Effekt der Eddy-Diffusion. In der Flüssigchromatographie kann die longitudinale Diffusion (B-Term) wegen der sehr kleinen Diffusionskoeffizienten (D M ) normalerweise vernachlässigt werden. 43

3 Der Massentransferterm C ist in der Flüssigchromatographie von entscheidender Bedeutung für die Effizienz eines Trennsystems. Aufgrund des stets beweglichen Eluenten haben die Analyten nicht genug Zeit, den Gleichgewichtszustand zwischen den beiden Phasen zu erreichen. Das bedeutet, dass sich eine chromatographische Säule immer unter Nichtgleichgewichtsbedingungen befindet. Die Beiträge des C-Terms zur Bodenhöhe sind vom Diffusionskoeffizienten der Analyten (D M und D S ) und der Filmdicke (df) abhängig. Die Verzögerung des Massentransfers in der stationären Phase kann für feste stationäre Phasen vernachlässigt werden, aber bei flüssigen stationären Phasen sollte man unbedingt beachten, dass die Verzögerung des Massentransfers wegen kleiner D S -Werte und der vergrösserten Filmdicke wesentlich erhöht und die Effizienz der Trennung somit herabgesetzt wird. In der mobilen Phase ist die Stoffaustauschbeiträge zur Bodenhöhe dem D M -Werte umkehrt proportional. Da der Diffusionskoeffizient D M in Flüssigkeiten direkt proportional zur Temperatur ist, lässt sich die Effizienz einer HPLC- Trennung neben der ptimierung der Lineargeschwindigkeit der mobilen Phase auch durch eine Temperaturerhöhung verbessern Apparatur Der Aufbau einer HPLC-Anlage ist in nachstehender Abbildung dargestellt: (1) Lösungsmittelbehälter und Entgasungsvorrichtung, (2) Pumpe, (3) Filter, (4) Injektorventil, (5) Vorsäule und Trennsäule und (6) Detektor. He/Ar (2) Pumpe! bar! LM 10 ml/min! (1a) LM Behälter! (6) Detektor! (1b) LM Aufteilungsventil! (5) Vorsäule/Trennsäule! (3) Filter! (4) Injektorventil! a) Eluentvorrat/Pumpe: Der Eluent wird aus einem Vorratsgefäss mit einer Hochdruckpumpe auf die Säule geleitet. Bevor der Eluent die Pumpe erreicht, werden in einem Entgaser (degasser) gelöste Gase (Stickstoff, Sauerstoff) entfernt, um Blasenbildung in der Pumpe oder der Säule zu verhindern. Hierzu wird der Eluent z.b. in einem Teflonschlauch durch eine Vakuumkammer geführt, wo die gelösten Gase von der Flüssigkeit durch die poröse Schlauchwand in die Vakuumkammer diffundieren. An HPLC-Pumpen werden sehr hohe Ansprüche gestellt, da sie reproduzierbar und pulsationsfrei Drücke von bis zu 400 bar aufrechterhalten müssen. b) Injektor 44

4 Die Probe wird meist mit einer Spritze durch eine spezielle Injektionsschleife (Sechswegeventil) in den Eluentenstrom eingebracht. Typische Injektionsvolumina betragen 10-50µl. Probe ein! Probe ein! Probe aus! Probe aus! zur Säule! zur Säule! Eluens! Laden! Probenschleife! Eluens! Injizieren! Injektion der Probe Ausspülen der Probe in die Säule Zur drucklosen und reproduzierbaren Einführung der Probe in den Eluentenstrom dient das Injektionsventil. Verbreitet sind Sechs-Wege-Ventile. Man dosiert ein ausreichend grosses Volumen der flüssigen Probe mit einer Spritze in die Probeschleife ( Load - Stellung). Das Schleifenvolumen ist vorgegeben und beträgt zwischen 5 und 2000 µl. Das überschlüssige Volumen wird dem Abfall zugeführt. Durch Umlegen des Ventils in die Inject -Stellung wird die Probe aus der Probenschleife auf die Säule transportiert. c) Filter Da Partikel im Eluent oder aus der Probe die sehr dicht gepackten HPLC-Säulen verstopfen können, wird die Probe entweder vor der Injektion oder direkt vor der Säule gefiltert. d) Säule HPLC-Säulen sind meist Stahlrohre (seltener Glas, wegen des hohen Drucks) mit typischen Längen von cm und Innendruchmessern von 1-10 mm. HPLC-Säulen sind in den meisten Fällen mit porösen Partikeln von 3-10 µm Durchmesser gepackt, wobei eine dichte und einheitliche Packung wichtig ist. Die Partikel bestehen meist aus Kieselgel, Aluminiumoxid, Zirkonoxid oder Polymeren und weisen eine enge Grössenverteilung auf. Je nach Verwendungszweck kommen poröse oder nicht poröse Partikel zum Einsatz, die häufig mit einer organischen Phase beschichtet werden. Chemisch modifiziertes Kieselgel ist die am häufigsten eingesetzte stationäre Phase. Physikalische Eigenschaften: Partikelgrösse, Form und Grössenverteilung Porosität, Porengrösse, berfläche und Volumen Stärke (mechanisch) gegen Druck und Lösungsmettel (Bruch und Deformation) Für eine lange Lebensdauer der in der Regel recht teuren Säulen sollte man unbedingt darauf achten, dass die vom Hersteller angegebenen Parameter wie ph-bereich, Flussrate, Temperatur und Druck eingehalten werden. Sehr hilfreich ist der Einsatz von so genannten Vorsäulen. Diese bestehen aus derselben stationären Phase wie eigentliche Trennsäule und halten all jene Komponenten zurück, die ansonsten für immer auf der analytischen Säule haften würden, sodass diese für weitere Trennungen nicht mehr zu 45

5 benutzen wäre. Vorsäulen müssen in regelmässigen Abständen ausgetauscht werden, um ihre Schutzfunktion zu gewährleisten. e) Detektoren Es muss darauf geachtet werden, dass die Totvolumina zwischen Säulenende und Detektor möglichst klein sind, damit keine unnötige Bandenverbreiterung auftritt. Mehr Informationen über HPLC-Detektoren werden in Abschnitt 4.5 beschrieben. 4.3 Eluent (mobile Phase) Einer der wesentlichen Unterschiede zwischen Flüssigchromatographie und Gaschromatographie besteht darin, dass die mobile Phase in der Flüssigchromatographie wesentlich zur Trennung der Analyten beiträgt. e dient nicht nur als Trägermedium, sondern auch als Lösemittel. Deshalb muss der Eluent Voraussetzungen wie Reinheit, chemisch Inaktivität, Toxizität, allenfalls UV Durchlässigkeit, Mischbarkeit und Haltbarkeit erfüllt. Die Viskosität, Elutionsstärke und Selektivität beeinflussen die Trennleistung am meisten. Eine wichtige Eigenschaft ist dabei die Polarität der mobilen Phase. Meist wird ein Eluent gewählt, dessen Polarität sich von jener der Analyten möglichst unterscheidet und eine stationäre Phase mit ähnlicher Polarität wie die Analyten. Gradientenelution Wenn ein Substanzgemisch sehr unterschiedliche Polaritäten aufweist, kann es hilfreich sein, die Zusammensetzung des Eluenten während eines Chromatograms zu ändern. Dies nennt man Gradientenelution im Gegensatz zur isokratischen Elution, bei der die Eluentzusammensetzung über das ganze Experiment konstant bleibt. in der Praxis werden Gradientenelutionen häufig angewendet, d.h., die Polarität des Eluenten wird während des Experiments kontinuierlich verändert. Meistens wird dabei die Elutionskraft des Eluentgemisches gegen Ende des Chromatogramms erhöht. In einer Umkehrphasen- Chromatographie kann man z.b. mit einem polaren Eluenten das Chromatogramm beginnen (z.b. 95% Wasser und 5% Acetonitril) und dann kontinuierlich immer mehr von einem relativ apolareren Lösungsmittel dazumischen (z.b. Acetonitril), sodass der Eluent am Ende des Experiments z.b. zu 10% Wasser und 90% aus Acetonitril besteht. Gradientenelution führt häufig zu schärferen Peaks und kürzeren Retentionszeiten: Vergleich einer a) isokratischen Elution und b) einer Gradientenelution. 46

6 4.4 Flüssigkeitschromatographische Trennmethoden Aufgrund der vielfältigen stationären Phasen unterscheidet man in der Flüssigkeits chromatographie verschiedene Unterarten. Folgende Prinzipien kommen zur Anwendung: Adsorption an der berfläche der stationären Phase (Adsorptionschromatographie: NP) Verteilung in die (organische) stationäre Phase (Verteilungschromatographie: NP und RP) Ionische Wechselwirkung (Ionenaustauschchromatographie, IC: Ionenpaarchromatographie, IPC) Grössenabhängige Diffusion in enge Poren der stationären Phase (Gelpermeationschromatographie, GPC) Affinitätschromatographie Stationäre Phasen, die nach dem Prinzip der Adsorption oder Absorption eine Trennung von Analyten bewirken, werden weiter unterteilt in Normalphasen (grosse Polarität) und Umkehrphasen (kleine Polarität). Die Benennung in Normalphase und Umkehrphase hat historische Gründe, da zuerst polare Phasen (Normalphasen) eingesetzt wurden, bevor man die heute häufiger verwendeten Umkehrphasen entwickelte. Die Trennwirkung der meisten Normalphasen beruht auf den unterschiedlichen Stärke der Wechselwirkung der Analyte mit den aktiven Stellen der stationären Phase. (z.b. lanolgruppen bei Kieselgel). Dabei tritt der Analyt in Konkurrenz mit den Eluentmolekülen, die ebenfalls an der berfläche der stationären Phase adsorbieren können. Man kann sich vorstellen, dass die Analytmoleküle die Eluentmoleküle (die immer in grosser Überzahl vorhanden sind) von der berfläche der stationären Phase verdrängen müssen um retardiert zu werden. Sehr polare Eluenten können also nur geringfügig von der stationären Phase verdrängt werden, wodurch die Analyten schnell mit der mobilen Phase ausgeschwemmt werden, d.h. es sind kleine Retentionszeiten zu beobachten. Man kann die Lösungsmittel in eine Reihenfolge steigenden Polarität bringen. Man spricht von der eluotropen Reihe der Lösungsmittel für Normalphasen-Säulen, wobei polare Eluenten eine grosse Elutionskraft besitzen und kurze Retentionszeiten zur Folge haben. Eluotrope Reihe: Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan < Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol < Methanol < Wasser Je nach Polarität der stationären Phase kann diese Reihenfolge auch leicht ändern Adsorptionschromatographie (Normalphasen) Die Adsorptionschromatographie (Flüssigkeits-Festkörper-Chromatographie) gehört zu den ältesten chromatographischen Methoden (Tswett, 1906). Die Retention wird bei der Adsorptionschromatographie durch die Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und den aktiven Stellen einer festen stationären Phase (Adsorbens) verursacht. Das Adsorbens ist ein poröser Festkörper mit grosser berfläche ( m 2 /g) wie z. B. licagel und Aluminiumoxid. 47

7 H H H H H H H Die Trennung der Probenmoleküle an polaren Adsorbentien (Normalphasen) erfolgt durch Polaritätsunterschiede, wobei polare Probenmoleküle stärker adsorbiert werden als apolare. Für die Abhängigkeit der Elutionsgeschwindigkeit von der Art der funktionellen Gruppen der Probenmoleküle lässt sich deshalb eine empirische Reihenfolge aufstellen: Reihenfolge der Polarität: Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe < gesättigte Kohlenwasserstoffe < Aromaten < halogenierte Verbindungen < Aether < Nitrile < Nitroverbindungen < Ester < Ketone < Aldehyde < primäre Amine < Amide < Phenole < Alkohole < Carbonsäuren. Die Adsorptionschromatographie erzielt oft gute Trennungen von Isomerengemischen und wird aber im Allgemeinen nicht sehr häufig angewandt Verteilungschromatographie (Normalphasen und Umkehrphasen) Man unterscheidet zwei Formen der Verteilungschromatographie: Die Flüssigkeits- Flüssigkeits-Chromatographie bei der flüssige stationäre Phasen verwendet werden und Chromatographie an gebundenen Phasen, bei der die organische stationäre Phase an einer berfläche immobilisiert wird Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie Die Trennung in der Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären Phase (aufgesogen von einem porösen, inerten Festkörper Träger) und der mobilen Phase. Die mobile und die stationäre Phase sollten dabei nicht miteinander mischbar sein. Die für die Chromatographie generell geforderte Nichtmischbarkeit von mobiler und stationärer Phase führt oft zu praktischen Schwierigkeiten (Sättigungsprobleme, mangelnde Stabilität, etc.). So ist z.b. keine Gradienten-Elution möglich. Zudem bedingt der ständige Verlust der stationären Phase (die nur durch physikalische Adsorption an den Teilchen des Packungsmaterials zurückgehalten wird) eine periodische Erneuerung der stationären Phase. Aus diesen Gründen ist die Flüssigkeits-Flüssigkeits- Chromatographie für Routineanalysen weniger gut geeignet. Entsprechend der Polarität der stationären Phase unterscheidet man grundsätzlich zwischen zwei Arten: Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge der Analyten Bezeichnung polar apolar (z.b. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP) apolar Polar (z.b. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen (RP: reversed-phase) 48

8 Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen Wird die stationäre Phase chemisch kovalent an die Partikel der Packung gebunden, spricht man von Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen. Dies erhöht die Stabilität gegenüber Auswaschen durch die mobile Phase. Chromatographie an gebundenen Phasen ist deshalb heute eine der am häufigsten verwendeten Verfahren. Säulenmaterial für chemisch gebundenen Phasen Die organische stationäre Phase wird meist an Kieselgel-Partikel gebunden, die Durchmesser von 3-10µm haben. Kieselgel hat den Vorteil, dass es mechanisch stabil ist (was bei den hohen Drücken der HPLC nötig ist) und dass organische Verbindungen relativ einfach und vor allem in dichter Packung daran gebunden werden können. Es werden z.b. poröse Teilchen verwendet, wobei auf eine enge Verteilung der Porengrösse geachtet werden muss. Meist werden apolare Beschichtungen verwendet, also Umkehrphasen. Es gibt aber auch chemisch gebundene Normalphasen. Für eine unpolare stationäre Phase werden meist Alkysilyl-Verbindungen an die berfläche der Kieselgelpartikel gebunden. Modifikation: H Cl R R Straight-chain hydrocarbons (C 18, C 12, C 8 C 6, C 4, C 3, C 2, C 1 ))! R R = C 1 C 18 Cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl! R sind oft C 2 -C 18 -Alyklketten. Mit diesen Substitutionsreaktionen können aufgrund sterischer Limitierungen oft nur die Hälfte oder weniger der lanolgruppen derivatisiert werden. Somit ist die stationäre Phase immer noch relativ polar. Um einen Teil der restlichen H-Gruppen auch noch umzusetzen, kann ein End-capping durchgeführt werden, indem man (CH 3 ) 3 -Gruppen mit der berfläche reagieren lässt. Durch die Länge des Alkylrestes kann die Trenneigenschaft der Säule wesentlich beeinflusst werden. Eine lange C 18 -Kette weist eine deutlich höhere Trennleistung auf als eine C 1 -Phase. End-capping H HN[(CH 3 ) 3 ] 2 (CH 3 ) 3 Zusammen mit der Länge der Alkylkette beeinflussen auch die Packungsdichte und der Grad des End-cappings die Retentionseigenschaften einer Phase. Alle diese Parameter werden zusammenfassend als Kohlenstoff-Gehalt einer Säule bezeichnet, um verschiedene Säulen miteinander vergleichen zu können. 49

9 Diese sehr apolaren Phasen bedingen den Einsatz von polaren mobilen Phasen wie Wasser oder Methanol. An die organischen Alkylreste der stationären Phasen können polare Substituenten gebunden werden, um die Polarität der gebundenen Phase zu erhöhen. Solche Säulen sind also Normalphasen. Übliche Alklyderivate sind Cyano-, Alkohol-oder Amino-Gruppen. Bei diesen polareren Phasen können auch apolare Eluenten wie Hexan oder Chloroform eingesetzt werden. CN NH 2 H H Normale (polare) Phase Bei HPLC-Säulen muss häufig auf den eingeschränkten ph-bereich geachtet werden, bei denen sie eingesetzt werden können. Polymer-Partikel als stationäre Phase sind zudem relativ druckempfindlich, sie sind aber in extremen ph-bereichen stabiler als Kieselgel- Partikel Ionen(austausch)chromatographie (IC) Ionische Analyten können mit konventionellen Säulen kaum getrennt werden. Beschichtet man jedoch Kieselgel- oder Polymer-Partikel mit Alkylketten, an deren Enden sich ionisierbare funktionelle Gruppen befinden, können ionische Wechselwirkungen für eine Trennung ausgenutzt werden. Man nennt diese stationären Phasen Austauscherharze. Substituenten zur Trennung von Kationen und Anionen: Kationentrennung Anionentrennung Sulfonsäuren: S 3 H + Quartäre Amine: N(CH 3 ) 3 + H Carbonsäuren: -C 2 H + Primäre Amine: NH 3 + H Als mobile Phase wird oft Wasser eingesetzt, dem ein Puffer beigegeben wird, wobei die Pufferionen mit den Analyten um die Austausch-Plätze an der stationären Phase konkurrieren. Mit der mobilen Phase wird auch ein gewisser ph-wert eingestellt, bei dem die stationäre Phase ionisiert wird. Elutionsreihenfolge für Kationen: Ba 2+ < Ca 2+ < Zn 2+ < Mg 2+ <Cs + < Rb + < K + < NH 4 + < Na + < H + < Li + Elutionsreihenfolge für Anionen: Citrat < Sulfat < xalat < Iodid < Nitrat < Phosphat < Bromid < Nitrit < Chlorid < Acetat < Hydroxid Mit IC werden hauptsächlich kleinere anorganische und organische Ionen getrennt. Als Detektoren werden fast ausschliesslich Leitfähigkeitsdetektoren eingesetzt. Die hohe Empfindlichkeit dieser Detektoren wird jedoch stark von den Pufferionen 50

10 beeinträchtigt, sodass das gnal der Analytionen oft nicht mehr sichtbar ist. Es werden deshalb Supressorsäulen zwischen die eigentliche Trennsäule und den Detektor geschaltet, in der selektiv die Pufferionen neutralisiert werden. Für Kationentrennungen wird oft HCl als Puffer eingesetzt. In der Supressorsäule findet folgende Reaktion statt: Harz-H + H + + Cl Harz-Cl + H 2 Die zu trennenden Kationen hingegen zeigen keine Wechselwirkung mit dem anionischen Harz. Für Anionentrennung (Puffer: Na + HC 3 ): Harz-H + Na + + HC 3 Harz-Na + H 2 C Ionenpaarchromatographie (Ion-pair chromatography, IPC) Mit Hilfe der Ionenpaar-Chromatographie lassen sich ebenfalls Proben analysieren, die ionische Komponenten enthalten. Man unterscheidet folgende Arten von Ionenpaar- Chromatographie: Normalphasen-Ionenpaar-Chromatographie Umkehrphasen-Ionenpaar-Chromatographie Ionenpaar-Adsorptionschromatographie Im Falle der Ionenpaar-Chromatographie an einer Umkehrphasen-Säule wird der mobilen Phase ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente zugesetzt. Als Gegenion wird z. B. das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben und das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben verwendet. Zur Erklärung des Trennmechanismus werden zwei Modelle vorgeschlagen: 1) Paarbildung in der mobilen Phase. Das der mobilen Phase zugesetzte grosse Gegenion bildet mit dem ionischen Probenmolekül ein Ionenpaar. Dieses Ionenpaar verhält sich wie eine neutrale, nicht polare Verbindung, die von der Umkehrphasen-Säule zurückgehalten wird. 2) Ionenaustausch an der stationären Phase. Das Gegenion wird mit seinem organischen Teil an den Umkehrphasen-Teilchen adsorbiert. Seine ionische Funktionalität bewirkt eine Trennung nach einem Ionenaustausch-Mechanismus Gelpermeationschromatographie (GPC) (Gel-Filtration, Ausschluss-Chromatographie, ze-exclusion chromatography, SEC) In der Gelpermeations-Chromatographie beruht die Trennung auf der unterschiedlichen Grösse der Analytmoleküle, wobei das Porenvolumen des Packungsmaterials ausgenützt wird. Die kleinen Moleküle haben die Möglichkeit, in die Poren des Packungsmaterials (poröse Kieselgele oder Polymere) vorzudringen und verweilen daher länger in der Trennsäule als grosse Moleküle, welche nicht in die Poren diffundieren können und schnell durch die Zwischenräume zwischen den Packungskörnern hindurchgespült werden. Moleküle bis zu einer Masse von ca Dalton können getrennt werden, wobei ein Masseunterschied von ca. 10% für eine Trennung nötig ist. 51

11 Die mobile Phase bei der Gelpermeations-Chromatographie zeigt im Idealfall keine Wechselwirkung mit dem Packungsmaterial und soll nur als Transportmittel für die Probe dienen. Aus diesem Grund sollte die Probe in der mobilen Phase gut löslich sein. Die Probe sollte auch mit dem Packungsmaterial keine Wechselwirkungen eingehen. Die Beziehung zwischen der Elutionszeit (-volumen) und der Molekülgrösse (oder relativen Molmasse) für ein bestimmtes Packungsmaterial wird mittels Kalibrationskurven dargestellt: Der lineare Bereich der Kalibrationskurve wird im wesentlichen durch die Porengrösse bestimmt. Somit kann durch die Wahl eines Packungsmaterials mit einer entsprechenden Porengrösse der jeweils gewünschte Molmassenbereich abgedeckt werden. Durch Verwendung von langen Trennsäulen erhält man genügend Porenvolumen und Trennleistung. Zur Steigerung der Trennleistung wird oft bei erhöhter Temperatur gearbeitet. CH 3 (CH 2 ) n CH t R " 1 log 10 MW Affinitäts-Chromatographie Die Affinitäts-Chromatographie nutzt spezifische Wechselwirkungen aus, die bei vielen biochemischen Systemen zu beobachten sind (z. B. Antigen/Antikörper; Enzym/Substrat), um z.b. Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und andere Klassen 52

12 von natürlich vorkommenden Verbindungen zu isolieren. Zu diesem Zweck wird ein spezifisches Protein oder ein anderes, biospezifisches Molekül (oft als Ligand bezeichnet) an einen unlöslichen Träger (z. B. Agarose-Gel, Cellulosederivate, Polyacrylamid-Gel) kovalent gebunden. Die Affinitätschromatographie unterscheidet sich im experimentellen Verlauf leicht von einem normalen chromatographischen Experiment. Es wird selektiv eine Substanz durch Komplexbildung mit dem trägergebundenen Liganden auf der Säule festgehalten, während alle anderen Begleitsubstanzen von der Säule gespült werden. Anschliessend wird der Komplex durch Änderung der mobilen Phase (z. B. ph, Ionenstärke) zerlegt und die gewünschte Substanz in gereinigter, konzentrierter Form von der Säule eluiert. 4.5 Detektoren Eine Vielzahl von Detektoren wird für HPLC-Analysen eingesetzt, wobei es keine universellen Detektoren gibt, wie etwa den FID in der Gaschromatographie. HPLC- Detektoren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: solche, die ausschliesslich auf die Analyten ansprechen, wobei darauf zu achten ist, dass der Eluent nicht zu stark auf solche Detektionsmethoden anspricht. Andere Detektoren sprechen auf Eigenschaften der gesamten Lösung an (= Eluent + Analyt), wobei Änderungen von reinem Eluent und Eluent + Analyt gemessen werden. UV/VIS-Detektor Die Ultraviolett Absorption ist eine der meist verwendeten LC-Detektionsmethoden aufgrund der guten Empfindlichkeit für viele Substanzklassen und der relativen Unempfindlichkeit gegenüber Lösungsmittelgradienten. Hauptnachteil: Nur empfindlich auf Substanzen mit UV Absorptionen bei grösserer Wellenlänge als diejenige vom Lösungsmittel. Typische absorbierende Gruppen: Br, I, S C= zwei oder mehr konjugierte Doppelbindungen (Aromatische Ringe) Um das gnal zu maximieren muss ein möglichst langer Absorptionspfad genutzt werden, wobei zu lange Messwege die Auflösung beeinträchtigen können. Bei einfachen Detektoren wird die Absorption bei nur einer Wellenlänge gemessen. Bessere (und teurere) Detektoren können simultan ein ganzes UV-Spektrum aufnehmen (Diodenarray-Detektoren). Somit kann ein Spektrum von ca nm für jeden Peak aufgenommen werden. Brechungsindex-Detektor Der Brechungsindexdetektor ist ebenfalls weit verbreitet. Der Brechungsindex eines reinen Lösungsmittels ist nicht (oder sehr selten) gleich jenem eines Analyt- Lösungsmittelgemisches. Der Brechungsindexdetektor ist allgemeiner einsetzbar als der UV Detektor, da der Brechungsindex fast aller Substanzen unterschiedlich ist zu jenen der Lösungsmittel. Die Empfindlichkeit des Detektors ist eine Funktion des Analyt- 53

13 Laufmittelpaars. e hängt somit nicht nur vom Analyt, sondern auch vom Laufmittel ab. Einer der grössten Nachteile ist jedoch seine geringe Empfindlichkeit. Die durchgezogene Linie in der Abbildung zeigt den Strahlengang, wenn reines Lösungsmittel durch die Küvette fliesst. Der Strahl kommt auf der Photodiode an. Die gestrichelte Linie zeigt der Strahlengang wenn Analyt mit dem Laufmittel durch die Küvette fliesst. Der Lichtstrahl wird seitlich versetzt, und die Photodiode sieht ihn weniger oder gar nicht mehr. Falls mit Gradientenelution gearbeitet wird, muss eine Referenzzelle benutzt werden. IR-Detektor Ein IR-Detektor ist im Prinzip ähnlich aufgebaut wie ein UV-Detektor, wobei eine Infrarotstrahlung durch eine Küvette geschickt wird und das IR-Absorptionsspektrum des Eluenten (+Analyt) aufgenommen wird. Da das Lösungsmittel auch IR-Absorptionsbanden hat, muss es sorgfältig ausgewählt werden, um die Analytbanden nicht zu überdecken. Aufgrund dieser Limitierungen kann ein IR-Detektor oft nur begrenzt eingesetzt werden. Die Empfindlichkeit der IR-Detektoren ist nicht besonders gut und etwa vergleichbar mit jener des Brechungsindexdetektors. Fluoreszenz-Detektor Wenn die zu analysierenden Substanzen fluoreszieren, ist dieser Detektor wegen seiner hohen Empfindlichkeit, die rund 1000 mal besser ist als jene eines UV- Detektors, sehr vorteilhaft. Für nicht fluoreszierende Verbindungen können zum Teil Derivate hergestellt werden, welche fluoreszierende Eigenschaften haben. optimieren. Einfache Geräte benutzen eine fixe Anregungswellenlänge und Glasfilter, um das Fluoreszenzlicht selektiv zu beobachten. Bessere Geräte benutzen Monochromatoren am Ein- und Ausgang, um Empfindlichkeit und Selektivität zu Leitfähigkeits-Detektor 54

14 Leitfähigkeit ist vor allem als Detektionseigenschaft für Ionen von Interesse. Die Leitfähigkeit des Laufmittels darf aber nicht sehr hoch sein, da dies eine sehr geringe Messempfindlichkeit zur Folge hätte. Zur Trennung von Ionen werden jedoch häufig gepufferte mobile Phasen eingesetzt. Problematisch dabei ist lediglich, dass sämtliche Eluenten ionische Spezies enthalten, sodass deren Grundleitfähigkeit bereits sehr hoch ist. Deshalb werden die Pufferionen in kleinen Säulen (Suppressor) vor dem Leitfähigkeitsdetektor neutralisiert. Die Aufgabe dieses Suppressors ist es, die Grundleitfähigkeit des Eluenten vor dem Eintritt in den Detektor zu erniedrigen. Beispiel von Cl and Br Suppressor Grundleitigkeit zu erniedrigen Analyt-signal zu verstärken Harz-S 3 H + Na + + HC 3 > Harz-Na + H 2 C 3 Harz-S 3 H + Na + + Cl > Harz-Na + H + + Cl Harz-S 3 H + Na + + Br > Harz-Na + H + + Br! (H + ) = 350! (Na + ) = 50 Die ablaufenden Suppressor-Reaktionen werden am Beispiel in einer Anionenanalytik dargestellt. Wird ein Gemisch von NaCl und NaBr mithilfe eines NaHC 3 /Na 2 C 3 -Puffers eluiert, so reagieren diese Substanzen mit dem Kationenaustauscher des Suppressors. Wie die erste Reaktion zeigt, wird das gut leitende NaHC 3 des Puffers in die nur noch sehr schwach dissoziierte Kohlensäure umgewandelt. Die Grundleitfähigkeit des Eluenten wird erniedrigt. Die zweite und dritte Reaktionen zeigen einen weiteren Vorteil. Da die Leitfähigkeit des entstehenden Protons in wässrigen Lösung sehr hoch [Λ(H + ) 350 >> Λ(Na + ) 50] ist, wird auf diese Weise das Analyt-gnal im Leitfähigkeitsdetektor verstärkt. Massenspektrometer Das Grundproblem für die Kopplung von LC mit MS-Detektoren besteht darin, dass die Probe für eine MS-Messung in gasförmiger Form vorliegen muss. Wenn dies nicht der Fall ist, muss eine geeignete Methode gefunden werden, um die Probe in die Gasphase zu bringen. Die zwei üblichsten Arten, wie das Lösungsmittel von den Analyten getrennt wird und wie die Analyten ionisiert werden, sind APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization und ESI Elektrospray Ionsation. APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Das Eluat wird in einer geheizten Kapillare mit einem Vernebler-Gas zersprüht. In der Ionisationskammer werden in dem ersten Schritt vor allem Moleküle des Lösungsmittels und des Trägergases durch eine Corona-Entladung ionisiert. Die Ionisation der Analyt- Moleküle erfolgt dann durch Reaktionen mit den Lösungsmittel-/Trägergasionen (chemische Ionisation), was eine sehr weiche Ionisationsmethode darstellt. Weiche Ionisationsmethoden haben den Vorteil, dass die Analytmoleküle wenig fragmentieren und so beim Molekülion ein starkes gnal erscheint, was zu einer grossen Empfindlichkeit führt. Als Nachteil muss in Kauf genommen werden, dass über unbekannte Substanzen, 55

15 abgesehen von der Molmasse, keine Information über die Struktur erhältlich ist. Die Ionen werden daraufhin in den Vakuumteil des MS überführt, wobei meist mehrstufige Vakuumsysteme verwendet werden. Elektrospray-Ionisation (ESI) Das Eluat wird mit einer dünnen Nadel, an der eine Hochspannung angelegt ist, versprüht. So entstehen geladene, flüssige Tröpfchen, die im Vernebler-Gas schnell abtrocknen. Die Ladung der Tröpfchen wird auf die Analyten übertragen. Die Einleitung ins MS kann linear oder rechtwinklig zur Einspritzrichtung sein. Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor (Evaporative Light Scattering Detector, ELSD) Der ELSD ist ein relativ universeller Detektor für Verbindungen, die einen kleineren Dampfdruck als das Laufmittel besitzen. Der Eluent wird zersprüht und das Laufmittel in einer nachfolgenden Heizstrecke verdampft. Die schwererflüchtigen Analyten bleiben als kleine Partikel (mit Durchmesser im µm Bereich) im Gasstrom zurück. Mit einem Laser wird nun die Lichtstreuung der Partikel gemessen, wobei die Anzahl und Grösse der Partikel proportional zur Analytkonzentration ist. Da eventuell vorhandene Pufferionen ebenfalls ein gnal ergeben, ist dieser Detektor auf Anwendungen ohne Puffer oder nur mit flüchtigen Puffern im Eluenten beschränkt. Magnetresonanz-Spektroskopie (NMR) Wegen der Möglichkeiten zur Strukturaufklärung ist NMR prinzipiell eine hervorragende Detektionsmethode. NMR ist allerdings nicht sehr empfindlich, was technisch aufwendige stopped-flow Einrichtungen nötig macht, da eine NMR Messung Minuten dauern kann. Eine weitere Voraussetzung ist das Verwenden von deuterierten Lösungsmitteln. Da NMR zudem eine teure Methode ist, wird sie in der Praxis selten direkt mit LC gekoppelt. Elektrochemische Detektoren In diesen Detektoren wird ein Strom gemessen, der durch Analytmoleküle, die oxidiert oder reduziert werden können, entsteht. Es gibt verschiedene Anordnungen für elektrochemische Detektoren, grundsätzlich wird aber immer ein Strom zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode gemessen. 4.6 Derivatisierungen Generell sind zwei Typen von Derivatisierungen möglich: vor- oder nach der Säule. Die Vorsäulen-Derivatisierung wird meist eingesetzt, wenn Probleme bei der Trennung der Substanzen auftreten. Falls lediglich die Detektionseigenschaften verbessert werden sollen, kann auch eine Nachsäulen-Derivatisierung durchgeführt werden. In der HPLC werden Derivatisierungen meist in Verbindung mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren verwendet. Beispiel: Derivatisierung von Carbonylen mit DNPH Eine Standardmethode zur Bestimmung von Aldehyden ist die Derivatisierung mit 2,4- Dinitrophenylhydrazin (DNPH), die nach folgendem Schema abläuft. 2 N HN NH 2 + H 2 2 N HN N N 2 N 2 56

16 Die Analyse der Reaktionsprodukte (Hydrazone) erfolgt meist mit einer RP-Säule und einer UV-Detektion. Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC: Funktionelle Gruppe -NH 2 (Amine, Aminosäuren) -H (Alkohole) -CH (Aldehyde) -CR (Ketone) -CH (Säuren) -SH (Thiole) Derivatisierungsreagenz 5-(N,N-Dimethylamino)-naphthalin- 1-sulphonylchlorid 2,4-Dinitrofluorbenzol 3,5-Dinitrobenzochlorid lylierungsreagenzien 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) 4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan 4-Brommethyl-7-methoxycoumarin Dansylaziridin 4.7 Dünnschichtchromatographie (DC, Thin Layer Chromatography, TLC) Bei der DC ist die stationäre Phase nicht in einer Säule untergebracht, sondern als dünne Schicht auf einer Glas-, Metall- oder Kunststoffträgerplatte aufgetragen. DC ist gegenüber säulenchromatographischen Methoden meist schneller und billiger, da viele Experimente gleichzeitig durchgeführt werden können. DC wird deshalb häufig zu Tests bei der Methodenentwicklung eingesetzt. Ein Nachteil der DC ist die beschränkte bzw. aufwendige Detektion DC-Platten DC-Platten haben meist Kantenlängen zwischen 5-20 cm. Die Platten sind mit einer µm dicken Schicht der stationären Phase (=Partikel von 3-20 µm Durchmesser) beschichtet, wobei dieselben Materialien verwendet werden wie bei der Säulenchromatographie. Es sind also Normalphasen- und Umkehrphasen DC-Experimente möglich. Die Anzahl theoretischer Böden beträgt für Hochleistungs-DC-Platten /10 cm Ein DC-Experiment Die Analyten werden als Lösung an einem Ende der Platte in einem möglichst kleinen Tropfen aufgetragen, wobei viele verschiedene Proben gleichzeitig aufgetragen werden können. Nach Verdampfen des Laufmittels wird die Platte in die Entwicklungskammer gestellt und somit in die mobile Phase getaucht. 57

17 Durch Kapillarkräfte wandert die mobile Phase gleichmässig der Platte entlang hoch und trennt dabei die Substanzen im Probengemisch, die unterschiedlich schnell mit dem Laufmittel mitwandern. Das Experiment wird beendet, indem die Platte aus der Entwicklungskammer genommen und getrocknet wird. Während GC- und HPLC-Chromatogramme eine zeitliche Auflösung der getrennten Peaks ergeben, erhält man nach der Entwicklung einer DC-Platte eine räumliche Auflösung des Substanzgemisches. In der DC bezieht man die Wanderstrecke des Probeflecks auf die Wanderstrecke des Fliessmittels zwischen Auftragstelle (Startlinie) und der Fliessmittelfront. Dieser Parameter wird als Verzögerungsfaktor (R F -Wert) bezeichnet: R F = S x S f Sx = Entfernung des Probenflecks von der Auftragstelle, Sf = Entfernung der Fliessmittelfront von der Auftragstelle. Der Verzögerungsfaktor R F ist eine dimensionslose Grösse. Die wichtigsten Parameter, die R F beeinflussen, sind die Schichtdicke, die Temperatur, die Sättigung des Kammervolumens mit Lösungsmittel und die Menge der aufgegebenen Probe. DC-Platte nach der Auftrennung von 2 Proben und einem Standard D Dünnschichtchromatographie ft wird keine gute Trennung bei einem DC mit nur einem Laufmittel erreicht. Wird nach der Entwicklung die DC-Platte getrocknet, kann man eine zweite Entwicklung mit einer mobilen Phase anderer Polarität durchführen und somit eine verbesserte Trennung erzielen. Führt man die zweite Entwicklung in 90 Grad gedrehter Laufrichtung durch, spricht man von 2D-DC, die vergleichbar ist mit der Gradientenelution Detektion Nach der Entwicklung und der Trocknung müssen die getrennten Substanzbanden auf der DC-Platte detektiert werden. Hierbei ist die direkte visuelle Auswertung in der Regel nicht geeignet, weil nur wenige Substanzklassen eine Eigenfärbung besitzen. Eine häufig verwendete Detektionsmethode ist die mit UV-Indikatoren (F-254 oder F- 366) markierte DC-Schicht-Platte, die kommerziell erhältlich sind. Die Verbindungen werden mit geeigneten Absorptionsmaxima bei 254 nm oder 366 nm als dunkle Spots detektierbar. 58

18 Eine weitere sehr einfache und generelle Methode zum chtbarmachen von Substanzen auf einer DC-Platte ist das Besprühen der Platte nach dem Chromatographie-Experiment mit Schwefelsäure/Salpetersäure (1:1). Nach Erhitzen auf C für weinige Minuten werden fast alle organischen Substanzen oxidiert und sind als braun/schwarze verkohlte Flecken sichtbar. Die Proben können nach Ermittlung ihrer Position auf der Platte weiter analysiert werden, indem sie z.b. von der Platte gekratzt und mit geeignetem Lösungsmittel befreit und mit MS, NMR oder IR weiter analysiert werden. Mit Laser-Desorptionsmethoden (kombiniert mit MS) oder Sekundärionen-MS (SIMS) kann die Platte auch direkt beprobt werden. Alle Gleichungen zur quantitativen Charakterisierung des Chromatogramms, die im Kapitel über Grundlagen besprochen wurden, können auch auf DC-Experimente angewendet werden, wobei die Retentionszeiten (aus der Säulenchromatographie) durch Entfernungen von der Startlinie (des Chromatogramms) ersetzt werden. Trennstrategie und Beispiele werden separat als Handout verteilt. 59