Viren Viren sind obligat intrazelluläre Parasiten. Viren haben keine proteinproduzierenden Strukturen keinen energiegenerierenden Mechanismus. Allgemeiner Aufbau Viren sind Partikel mit einer Größe zwischen 20 bis 300 Nanometer (nm) und bestehen aus einer Proteinhülle (= Capsid), die je nach Vermehrungszyklus noch Lipoide enthalten können. Innerhalb dieser Hülle ist Nukleinsäure in Form von DNA oder RNA eingeschlossen. Deshalb kann man die Viren auch in DNA-Viren und RNA-Viren einteilen. Die genetische Information, hat also eine von zwei möglichen Formen, RNA oder DNA. Um diese RNA- oder DNA-Moleküle besteht eine Schutzhülle aus Protein. Es gibt zwei Arten von Schutzhüllen: einfache und doppelte. Eine einfache Verpackung haben die nicht-behüllten Viren. Diese Viren sind stabil und resistent. Eine doppelte Verpackung haben die behüllten Viren. Behüllte Viren sind labil und leicht zerstörbar. Die Außenhülle solcher behüllter Viren stammt von der Wirtszelle, von der das Virus produziert wurde. Es ist eine Lipidmembran. Viren bestehen also nicht aus Zellen und sind deshalb auch keine Lebewesen. Jedoch besitzen sie einige Eigenschaften lebender Zellen: Sie benutzen Wirtszellen, um sich zu vermehren. Dabei können eukaryotische und prokaryotische Zellen befallen werden. Viren, die Bakterienzellen infizieren nennt man Phagen. Tabakmosaikvirus 1 Viren wurden 1898 von Löffler Bakteriophage und Frosch erstmals beschrieben. Anhand Ihres Wirtsspektrums können Viren in 4 Gruppen eingeteilt werden:
Viren, die Bakterien befallen (Bakteriophagen) Viren, die Algen, Pilze und Protozoen befallen Viren, die Pflanzen infizieren Viren, die Tiere (Invertebraten und Vertebraten) befallen Bacteria 15 Algae/fungi 4 Bacteria Algae/Fungi Pflanzen Invertebraten Vertebraten Pflanzen 34 2* Invertebraten 14** Vertebraten 22 * Rhabdoviridae und Bunyaviridae ** Manche Viren können sich sowohl in Invertebraten als auch in Vertebraten vermehren (replizieren) Die meisten Viren infizieren nur in ihrer Gruppe, es gibt jedoch zwei Arten von Viren, Rhabdoviridae und Bunyaviridae, die sowohl Pflanzen als auch Tiere infizieren können. Dies ist wohl die Folge, wenn infizierte Tiere (hauptsächlich Insekten) an Pflanzen fressen. Dabei können tierische Viren an Pflanzen weitergegeben werden und sich irgendwann an diesen neuen Wirt adaptieren. Tiere, die so den Virus weitergeben, nennt man Vektor. Einige Viren replizieren nur in Vertebraten, werden aber passiv von Invertebraten übertragen (Vektor). Besonders interessant sind dabei die Insekten. Interessant in der Humanpathologie vorwiegend Viren, die Vertebraten infizieren, jedoch dürfen wir die anderen Gruppen nicht vergessen, da: viele Entdeckungen in der Virologie, besonders im Bezug auf die Interaktion zwischen Wirt und Virus, ursprünglich bei Bakteriophagen erforscht wurden; Bakteriophagen für die molekulare Biologie als Werkzeug sehr wichtig sind und Viren von Invertebraten (z.b. Baculoviren) als Protein-Produktionssysteme in der Forschung eingesetzt werden. Die Vielfalt der Viren und ihre Einteilung Die Klassifizierung der Viren beruht auf 3 Kriterien mit/ohne Hülle DNA/RNA-Genome einzelsträngig (single stranded = ss) / doppelsträngig (double stranded = ds) Anzahl und Verteilung Gruppen tierischer Viren ssrna dsrna ssdna dsdna unbehüllt 4 2 1 3 behüllt 11# 0 0 5* # Retroviren replizieren mittels DNA-Intermediat * Hepadnaviren replizieren mittels RNA-Intermediat 2
Einteilung verschiedener Virusgruppen Bakteriophagen Pflanzenviren Lambda Lanbdoide Phagen M 13 Phagen Mu Phagen P1 Phagen P22 Phagen Qß Phagen T-even phage T-odd phage T2 Phagen T4 Phagen T7 Phagen Alfalfa mosaik virus Bromovirus Capillovirus Carlavirus Carmovirus Caulimovirus Closterovirus Cryptovirus Cucumovirus Dianthovirus Fabavirus Fijivirus Furovirus Geminivirus Hordeivirus Ilarvirus Luteovirus Machlovirus Marafivirus Necrovirus Nepovirus Phytoreovirus Plant Rhabdovirus Potexvirus Potyvirus Sobemovirus Tenuivirus Tobamovirus Tobravirus Tomato spotted wilt Tombusvirus Tymovirus Viren bei Tieren Adenovirus Arenaviridae Baculoviridae Birnaviridae Bunyaviridae Caliciviridae Cardioviren Coronaviridae Corticoviridae Cystoviridae Epstein-Barr Virus Enterovirus Filoviridae Flaviviridae FMD-Viren Hepadnaviridae Hepatitisviren Herpesviridae Immunodefizienzviren Influenzavirus Inoviridae Iridoviridae Orthomyxoviridae Papovaviren Paramyxoviridae Parvoviridae Picornaviridae Poliovirus Polydnaviridae Poxviridae Reoviridae Retroviren Rhabdoviridae Rhinoviren Semliki Forest Virus Tetraviridae Togaviridae Toroviridae Vacciniavirus Vesicular stomatitis Virus Links ein relativer Größenvergleich eines großen Virus mit einer Bakterien- und eukaryotischen Zelle. In einem Stecknadelkopf haben ca. 500 Millionen Rhinoviren (Schnupfen) Platz. Seit 1966 klassifiziert man Viren nach dem International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) entsprechend den Organismen in Taxonomiestufen der Viren 3
Beispiel: Ebola-Virus Ordnung (-Virales) höchste Taxonomiestufe. - Ordnung Mononegavirales - Familie (-Viridae) - Familie Filoviridae (=Fadenviren) - Unterfamilie (-Virinae) - Gattung (-Virus) - Gattung Filovirus (Fadenvirus) - Art (Name) - Art: Ebola Virus Zaire Man kennt derzeit 20 verschiedene Virenfamilien, die Mensch und Tier befallen. Einige wichtige Virus-Familien sind: DNA-Viren Paramyxoviren: Masern-Virus, Mumps-Virus Herpesviridae: Herpes simplex Virus Myoviridae: T2/4-Phagen bei E.Coli Poxviridae: Pockenviren bei Wirbeltieren RNA-Viren Totiviridae: Saccharomyces cerevisiae Virus L-A Flaviviridae: Gelbfieber Virus und verschiedene Pflanzenviren Picornaviridae: Poliovirus, Rhinovirus, Hepatitis A Virus Picornaviridae: Tabak-Mosaik-Virus Paramyxoviridae: Mumps-Virus, Masern-Virus Orthomyxoviridae: Influenzavirus A,B,C Retroviridae: HIV Die Proteinhülle der meisten Viren besteht besitzt entweder die kubische Symmetrie eines Eicosaeders (20- Flächner) mit dreieckigen Flächen wie z. B. beim Herpes Virus oder helikale Symmetrie aus identischen Proteinmolekülen wie beim Tabakmosaikvirus (TMV). Gefärbtes EM-Bild eines TMV- Virus, (außergewöhnlich ist die Stäbchenform). Neben den vielen rundlich gebauten Viren mit Eicosaeder-Capsid, wie dem sehr kleinen Parvovirus B19 (DNA), der zu den kleinsten Viren gehört und der die Erythrozyten von Menschen, Säu- 4
getieren und Vögeln befällt, gibt es noch viele andere, die sich in Größe, Capsidaufbau und Wirtszelle unterscheiden. Modelle verschiedener Viren Viraler Replikationszyklus Da Viren mangels Synthesestrukturen keine eigene Replikation betreiben können, sind sie obligat auf lebende Zellen, die syntheseaktiv sind, angewiesen. Dies bedeutet, dass sie in die empfängliche Zelle eindringen, den Synthesemechanismus zur Replikation ausnützen und dann die Zelle wieder verlassen müssen. Hierbei verwenden die verschiedenen Viren unterschiedliche Strategien, das Grundprinzip bleibt aber immer gleich. Der Zyklus kann in folgende Phasen eingeteilt werden: Initiation: Anlagerung (attachment) Eindringen (penetration) Freisetzung der viralen Nukleinsäuren (uncoating) Hierbei wird das genetische Material ins Zytoplasma entlassen, meist noch mit enzymatischen Kofaktoren. Replikation: Genomsynthese RNA-Produktion Proteinsynthese Die Genomgröße, -struktur und -zusammensetzung zeigen bei den Viren eine enorme Vielfalt. Daher ist die Replikation der einzelnen Viren sehr individuell. Gemeinsam ist ihnen, dass sie Proteine codieren, die 3 Aufgabenfelder abdecken: 1. Die Replikation des Virusgenoms muss sichergestellt sein, 2. das Virusgenom muss in die Partikel verpackt werden und 3. der Metabolismus der infizierten Zelle muss so beeinflusst werden, dass er vollständige Viruspartikel produziert. In ein paar Ausnahmefällen (wie z.b. Parvovirus) replizieren zelleigene Enzyme das Virusgenom. Sie werden aber von Virusproteinen unterstützt bzw. stimuliert. Meistens sind aber Virusproteine für die Replikation verantwortlich, nützen aber, wenn es nötig ist, zelleigene Enzyme. Das letzte Stadium, die Ausschleusung, wird immer von viralen Proteinen gesteuert. Ausschleusung: (Release) Zusammenbau (assembly) Reifung (maturation) Austritt (exit from cell) 5
Initiationsphase Anlagerung (Attachment) Virusanlagerung an eine Zelle setzt spezifische Bindungsstrukturen voraus. Dazu hat das Virus spezielle viral attachment proteins (V.A.P) oder Liganden, die an zelluläre Rezeptoren binden können. Diese Bindung ist in den meisten Fällen reversibel (bevor es zur Penetration kommt), einige Viren haben sogar einen Ablösemechanismus (Influenzaviren - Neuraminidase). Es kommt jedoch beim Ablösen oft zu Konformationsänderungen, die dann eine weitere Bindung des Virus erschweren. Rezeptoren sind normalerweise oberflächliche Zellstrukturen, die für ein normales Funktionieren der Zellfunktionen wichtig sind. Viren haben diese immer gleichen Strukturen als Chance erkannt, sich an diesen Zellen spezifisch anzulagern. Moleküle, die auch als Virusrezeptoren fungieren: Molekül Funktion Virus ICAM-I Adhäsion an andere Zellen Rhinoviren MHC I Ligand für CD 8 T-Zellen Adenovirus MHC II Ligand für CD 4 T-Zellen CR 2 Complementrezeptor C3d Epstein Bar Virus IgA Rezeptor Bindet IgA zum Transport durch die Zelle Hepatitis B Virus CD 4 Ligand für MHC II HIV-1, HIV-2, SIV IgM B-Zellrezeptor Maus Leukämievirus IgG, gebunden an Zellen mittels Fc Bindet Virus Dengue Virus und andere Viren ß-Adrenerger Rezeptor Bindet Adrenalin Reovirus Acetylcholin Rezeptor Bindet Acetylcholin Tollwut-Lyssavirus N-Acetylneuraminsäure gibt den Zellen ihre negative Ladung Influenza, Polyoma, Reo- Phosphotidylserin Zellmembranbestandteil Vesicular stomatitis Virus Die Bindung eines Virus an einen Rezeptor muss nicht dessen Funktion beeinflussen. Das Vorkommen des Rezeptors bedingt weitgehend das Wirtsspektrum und den Tropismus des Erregers. Es sind nur sehr wenige Rezeptoren bisher gut charakterisiert. Die Zelloberfläche dürfte zwischen 500 und 500.000 Rezeptoren aufweisen. Rezeptoren können ganz spezifische Glycoproteine sein, es reichen aber auch Zuckerreste an Glycoproteinen oder Glycolipiden, selten sogar nur Lipide, um die Bindung herzustellen. Normalerweise ist ein Rezeptor für ein bestimmtes Virus spezifisch, manchmal wird er aber auch von verschiedenen Viren benutzt, besonders wenn es sich um einen Zuckerrest handelt. Komplexe Viren (z.b. Pox, Herpes, etc.) können mehrere Rezeptoren benutzen, wodurch ihnen mehrere Wege in die Zielzelle zur Verfügung stehen. Manche Viren besitzen auf dem Liganden mehrere Domänen, die mit verschiedenen zellulären Rezeptoren interagieren können. Die Interaktion zwischen viralem Ligand und Rezeptor führt meistens zu irreversiblen Änderungen am Virus. 6
Ein klassisches Beispiel für dies ist die Infektion mit Influenza. Das Virus wird mit Hilfe seines Hämagglutinin-Liganden an N-Acetylneuraminsäure-Resten (Rezeptoren) gebunden, was zu einer Spaltungsreaktion führt. Dies hat eine Konformationsänderung zur Folge, die eine Fusionsdomäne am Ende des Hämagglutinins freilegt. Oft genügt ein Rezeptor nicht allein zur Infektion einer Zielzelle. Dann ist auch noch ein Korezeptor vonnöten. Ein Beispiel hierfür ist die Infektion mit HIV. Das Virus bindet mittels seines gp120 Liganden an CD4+ Zellen, wobei Korezeptoren wie Fusin eine Rolle spielen. Die bisher identifizierten Ko-Rezeptoren von HIV sind Mitglieder der Familie der Chemokin-Rezeptoren, die in der normalen Immunantwort bei der Rekrutierung von T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen ihre Funktion haben. Die Korezeptor- Funktion ist scheinbar von der Zielzelle abhängig. Fusin ist für T-Zell-tropische HIV-Isolate von Bedeutung, während CKR5 für Makrophagen-tropische HIV-Isolate als Korezeptor dient. Identifikation von Rezeptoren Durch Expression des Gens, das für den Rezeptor codiert, in einer anderen Zelle, die normalerweise nicht vom Virus infiziert werden kann. Blockierung der Anlagerung an den Rezeptor mit Hilfe spezifischer monoklonaler Antikörper Initiation Eindringen (Penetration) Dieser Prozess erfordert metabolische Aktivität von der Zelle, da es sich um einen Einschleusungsvorgang handelt. Drei Mechanismen sind bekannt: Endozytose: Einschließen vom Virus in eine Vakuole; diese wird intrazellulär mittels Lysosomen (niedriger ph, degradierende Enzyme) wieder aufgelöst; dies führt bei behüllten Viren zu Konformationsänderungen, die die Fusions-Domäne freilegen. Dadurch fusionieren beide Membranen und das Virus kann ins Zytoplasma entlassen werden. Bei nichtbehüllten Viren kommt es dabei zu einer Permeabilisierung und zum Freisetzen der Nukleinsäuren. Fusion: Die Virushülle verbindet sich mit der Zellmembran mittels eines Fusionsproteins des Virus. Dieser Prozess ist ph-unabhängig, setzt aber hydrophobe Proteinstrukturen in der Hülle voraus. Das Virus wird als Nucleocapsid, also ohne Hülle, direkt ins Zytoplasma entlassen. Translokation: Durchschleusen des ganzen, nichtbehüllten Virus durch die Zellmembran direkt ins Zytoplasma. 7
Generell muss gesagt werden, dass alle Einschleusungsprozesse bis zu einem gewissen Grad ineffizient sind. virale RNA kann degradiert werden; nur wenige Liganden treffen den Rezeptor richtig, um eine Penetration herbeizuführen; nur wenige virale Rezeptoren sind zu einer erfolgreichen Infektion in der Lage. Die ineffiziente Penetration hat zur weiteren Folge dass das Virus-Partikel/infektiöse Partikel-Verhältnis sehr groß ist; nichtinfektiöse Partikel können in einem Verhältnis bis zu 1000/1 vorhanden sein, wobei keine strukturellen Unterschiede festgestellt werden können und beide Typen Nukleinsäuren enthalten. Die Endozytose wird sowohl von den behüllten wie auch den unbehüllten Viren als Eindringmechanismus verwendet. Jedoch können nur behüllte Viren durch die Fusion mit der Zellmembran in die Zielzelle eindringen. Freisetzung der viralen Nukleinsäuren (Uncoating) ist ein genereller Begriff für Prozesse, die nach der Penetration stattfinden, wobei das Capsid entfernt und die Nukleinsäuren in Form eines Nukleoproteinkomplexes freigelegt werden. Der Nukleoproteinkomplex kann sehr einfach sein: z.b. Picornaviren haben ein kleines basisches Protein von 23 aa (VpG) das am 5'Ende des vrna Genoms kovalent befestigt ist, oder sehr komplex: 8
z.b. Retroviren, die im Core zusätzlich zu den diploiden RNA-Genomen auch verschiedene Proteine (Integrase, reverse Transkriptase, etc.) gebunden haben. Die Freisetzungsphase ist schwer (wenn überhaupt) von der Penetrationsphase zu separieren und ist sehr individuell für den jeweiligen Virustyp. Außerdem wird diese Phase noch ungenügend verstanden. Im Kern replizierende Viren Einige Viren, die im Nukleus replizieren, wandern als Capsid mit Hilfe ihrer Nukleoproteine am Zellskelett entlang zum Kern, dort lagern sie sich an Kernporen, streifen das Capsid ab und die Nukleinsäure schleust sich in den Kern (Herpes, Adeno, Papova). Andere Viren verlieren nach dem Eindringen das Capsid im Zytoplasma, wobei Ribonukleoprotein-Komplexe freigesetzt werden, die dann zum und in den Kern wandern (Orthomyxo, Paramyxo). Im Zytoplasma replizierende Viren Häufig werden Viren, die im Zytoplasma replizieren, dort einfach freigesetzt (Picorna). Es gibt auch Viren, die sich im partiell desintegrierten Capsid-Partikel replizieren, wobei ihre genetische Information nie freigesetzt wird (Reo). Einige Viren werden zunächst von Zellenzymen zerlegt, bevor sie ihr Genom mittels eigener virus-assoziierter Enzyme (DNA-abhängige DNA-Polymerase) replizieren (Pocken). Replikation Nobelpreisträger David Baltimore schlug vor, die Viren nach deren Genexpression und -replikation zu klassifizieren. Dies führt zwar auch zu dubiosen Gruppierungen (Bakteriophage T2 und Variola sind in derselben Gruppe, ohne auch nur das Geringste miteinander zu tun zu haben), aber für die Replikationsmechanismen macht dies die Sache überschaubar. Die Replikationsstrategie ist klarerweise vom Aufbau des Genoms abhängig mrna wird hierbei als +RNA bezeichnet, zur mrna komplementäre DNA oder RNA als - RNA, -DNA. Die Viren werden dabei in 7 Gruppen eingeteilt: 1. Doppelsträngige DNA (Adeno, Herpes, Pocken, etc.) 2. Einzelsträngige DNA (Parvo) 3. Doppelsträngige RNA (Reo, Birna) 4. Einzelsträngige positivgerichtete RNA (Picorna, Toga, Calici, Flavi, Corona) 5. Einzelsträngige negativgerichtete RNA (Orthomyxo, Rhabdo, Paramyxo, Filo, Bunya, Borna) 6. Einzelsträngige positivgerichtete RNA mit DNA-Zwischenschritt (Retro) 7. Doppelsträngige DNA mit RNA-Zwischenschritt (Hepadna) Replikation: +RNA; -RNA; ds-rna; +RNA mit DNA-Zwischenschnitt; ds-dna mit RNA- Zwischenschnitt 9
Transkription Als Transkription bezeichnet man das Umschreiben einer Nukleinsäure in RNA mittels einer RNA-Polymerase. Grundlegend sucht sich die Polymerase eine Andockstelle, bei DNA Promotor genannt, auf dem Nukleinsäurefaden, verdrängt den komplementären Strang (natürlich nur bei ds) und startet mit der Synthese kurzer RNA-Fragmente (initialer Transkriptionskomplex). Eine Konformationsänderung in der Polymerase führt zum Übergang in den Elongations-Zyklus. Dabei wandert die Polymerase zwischen 30-60 Basen /sec. stromabwärts, also vom 5'-Ende zum 3'-Ende der zu transkribierenden Matrize. Im Moment wo die Andockstelle frei wird, lagert sich die nächste Polymerase an, was die nächste Transkription initiiert. Damit die Synthese auch ein vernünftiges Ende findet, wird sie durch einen Terminator (Terminator-Sequenz) beendet. Dabei unterscheidet man die einfache Termination, wobei eine Folge von GC-Nukleotiden sich doppelstrangartig verwindet, und diese Keule scheinbar den Enzym/DNA/RNA-Komplex auseinanderdrückt. die Rho-abhängige Termination, wo ein Hexamer aus Rho-Protein sich an einen praktisch unstrukturierten RNA-Bereich lagert und die RNA vom Enzym entkoppelt. Die Regulation der Genexpression kann sowohl auf der transkriptionellen, als auch auf der translationellen Ebene stattfinden. Protein-Synthese Virale Proteine werden durch die Synthese-Maschinerie der Wirtszellen synthetisiert Während dieses Prozesses wird die Synthese der Wirtsproteine beeinflusst Unterschiede bestehen in der Art der Beeinflussung der Wirts-Proteinsynthese durch einzelne Viren. Einige Viren haben keinen Einfluss, während andere die Wirtszellproteinsynthese praktisch zum Erliegen bringen. Obwohl dies einen schweren Eingriff in die Zellfunktion bedeutet, scheint dies aber in den meisten Fällen nicht schnell genug zu sein, um zum Untergang der individuellen Zelle zu führen. Es gibt eine Vielzahl von Strategien, wie das Virus spezifisch die Wirtszellproteinsynthese unterdrückt und gleichzeitig seine eigene Proteinsynthese aufrechterhält. Oft sind jedoch die genauen Mechanismen nicht bekannt. Poliovirus inaktiviert die Cap-bindenden Faktoren, die für die Translation von ge-capter zellulärer mrna nötig sind. Poliovirus ist nicht ge-capt (hat jedoch ein 5'-gekoppeltes VPg-Protein) und wird so in Abwesenheit von Cap-bindenden Faktoren translatiert. Virus-kodierte Proteine können grundsätzlich in 2 Klassen unterteilt werden Strukturproteine, die einen Teil der Viruspartikel darstellen und Nicht-Strukturproteine, die für die Replikation nötig sind Regulation der Genexpression kann sowohl auf der translationellen, als auch auf der transkriptionellen Ebene stattfinden. Ausschleusung Dies letzte Stadium der Virusgenese kann in 3 Abschnitte eingeteilt werden Der Zusammenbau Die Reifung Der Austritt Diese Stadien sind jedoch schwer voneinander abgrenzbar. Es wird angenommen, dass eine hohe Konzentration an viralen Proteinen und Genom-Molekülen dieses Stadium initiiert. Häufig werden diese Produkte in Vesikeln und anderen subzellulären 10
Strukturen gesammelt, die dann als Einschlusskörperchen im Lichtmikroskop beobachtet werden können. Die Größe und die Lokalisation dieser Einschlusskörper ist häufig pathognomonisch; z.b. Negrikörperchen bei Tollwut. Andererseits können hohe Konzentrationen von Syntheseprodukten auch an den Zellmembranen (Membran assoziierte virale Proteine, z.b. Hüllproteine) zustande kommen, diese mit anderen Virusproteinen (z.b. Core-Proteinen) assoziieren und somit für die behüllten Viren die Grundlage des buddings darstellen. Der Zusammenbau Virus-Genom und Virusproteine werden normalerweise separat synthetisiert. Also müssen sie zu Partikeln zusammengebaut werden. Hierfür gibt es 3 Wege 1. Self assembly; spontane Aggregation von Komponenten zum Partikel, was als minimalenergetischer Status aufgefasst wird (ähnlich der Kristallbildung). 2. Gerüst-induzierter Zusammenbau; spezifische morphogenetische Faktoren (Chaperone) werden synthetisiert, sind im Virus aber nicht zu finden 3. Vorläuferprotein-Modifikation; Precursorproteine unterlaufen eine Modifikation zum Virion. Einzelproteine können also nicht zu einem Virus zusammengebaut werden. Reifung Das finale Stadium, in dem das Virus infektiös wird. Manchmal in der Wirtszelle, manchmal auch erst nach Freisetzung. Reifung bedingt Strukturveränderungen im Partikel, die auf Modifizierungen (Spaltung von Vorläuferproteinen) der Capsid-Proteine oder Konformationsänderungen basieren. Virale Proteasen aber auch zelluläre Enzyme sind häufig involviert. Virale Proteasen sind hochspezifisch. Oft werden sie nur nach direktem Kontakt mit der Erkennungssequenz, die nur nach Konformationsänderung oder Sequenzänderung unter bestimmten ph und pk Konzentrationen freigelegt werden, aktiviert. Retrovirus-Protease sind ein gutes Beispiel: Bei hoher Konzentration kommt es zur Aktivierung im Capsid, wo Gag und Pol-Proteine aus Vorläuferproteinen gespalten werden und somit das Virus infektiös wird. Nicht alle Reifungsprozesse sind so scharf kontrolliert. Das Hämagglutinin von Influenza kann von jedem trypsinähnlichen Enzym in HA1 und HA2 gespalten werden, die sich dann in den Vesikeln befinden, in die das Virion buddet. Diese Spaltung ist unbedingt nötig, damit das Virus mit der Membran der Zielzelle fusionieren kann. Freisetzung Da ein Virus nur leben kann wenn es genügend Unterstützung von einer lebenden Zelle erfährt, muss es früher oder später in eine neue Zelle "umziehen". Da Viren so konstruiert sind, daß sie in Zellen einbrechen, ist es schwer zu verstehen, wie sie sie z.b. durch budding wieder verlassen. Einige Viren haben Enzyme, die sowohl den Eintritt wie auch das Verlassen unterstützen. Ein Beispiel ist das Neuraminidase-Protein des Influenzavirus. Dieses Protein ist nicht nur fähig, die Bindung vom Virus an den Rezeptor abzulösen, sondern scheint auch in der Freisetzung des Virus eine bedeutende Rolle zu spielen. Behüllte und nichtbehüllte Viren zeigen Unterschiede bei der Freisetzung. Während die Behüllten noch Bausteine der Zelle für Ihre Hülle brauchen, warten die Unbehüllten bis der Zelltod eintritt, um sich zu befreien, oder sie töten die Zelle mittels "death-proteins". 11
Bakteriophagen Viren, die Bakterienzellen befallen nennt man Bakteriophagen oder Phagen. T2-Phage (Myoviridae; DNA-Virus). Seine gesamte Proteinhülle ist dazu ausgelegt, um das eine DNA-Molekül in seinem Kopf in E.Coli zu injizieren. Er besteht aus dem ca. 100nm großen Kopf, dem Hals, dem Kragen, einer kontraktilen Scheide, an deren Ende 6 Schwanzfasern sitzen. Die Bodenplatte besitzt 6 Spikes um die Bakterienwand anzustechen. Vermehrung Nach dem Befall einer Wirtszelle kann die Vermehrung in 2 Formen ablaufen: als lytischer Zyklus und als lysogener Zyklus. Die Art des Zyklus ist von Virus zu Virus verschieden. Letztendlich wird die Wirtszelle zu einer Virenfabrik umfunktioniert, wobei am Ende bis zu 500 neue Viren die Zelle durch Knospung (=Abschnüren von Viren) oder durch Aufplatzen der Membran (= Lyse) verlassen. Dabei sterben die Wirtszellen meist. Die Generationszeiten können sehr kurz sein (ca. 20 Minuten), so dass bei einer Infektion an einem Tag eine gigantische Zahl an neuen Viren entsteht. Viren sind also immer potentiell pathogen. Beide Vermehrungsarten sind am Beispiel eines T-Phagen dargestellt: 12
Der lytische Zyklus läuft in 4 Phasen ab: 1. Adsorptionsphase - das Virus lagert sich an die Rezeptoren der Wirtszelle an 2. Injektionsphase - das Virus injiziert oder schleust seine Erbinformation in die Zelle 3. Latenzphase - die Virus-DNA (RNA) übernimmt die genetische Kontrolle der Zelle, es werden Virus-Partikel produziert 4. Lytische Phase - fertige Viren verlassen die Zelle, die Zelle stirbt. Es kann jedoch vorkommen, dass das Virus nach der Injektion sich in das Wirtschromosom integriert (z.b. durch das virale Protein Integrase) und als Provirus (Prophage) ohne virulente Wirkung weiterexistiert. Bakterienzellen können sich teilen, die Virus-DNA wird mitrepliziert. Nach einer gewissen Zeit verlässt das Virus das Wirtschromosom (wiederum durch bestimmte virale Enzyme wie Integrase und Excisase vermittelt), übernimmt die Zellkontrolle und der lytische Zyklus beendet das Zellleben. Solche Phagen nennt man temperente oder lysogene Viren (Phagen). Ein Bakterium, das einen Prophagen trägt ist immun gegen eine Neuinfektion. Der am besten studierte temperente Phage ist der Lambda-Phage der E.Coli infiziert. Die Repressor-Proteine CI und Cro regulieren dort den lytischen und lysogenen Zyklus. Beim Menschen besteht 2% der DNA aus endogenen Retroviren, also in das Chromosom integrierte Virus-DNA. 13
Aufbau und Vermehrung des Grippe-Virus Grippe gehört wie Schnupfen zu den alltäglichen Erkältungskrankheiten, charakterisiert durch Fieber, Kopf- und Muskelschmerzen und Halsentzündungen. Auch Husten kann als Begleiterscheinung auftreten. Die Infektion kann leicht oder sehr stark ablaufen (1918 von den USA ausgehende Epidemie mit ca. 20 Millionen Toten weltweit). Sie geschieht per Aerosol (Tröpfcheninfektion) durch einen infizierten Mensch mit einer kurzen Inkubationszeit von 1-3 Tagen. Die Krankheit wird durch das Influenza- oder Grippe-Virus aus der Familie der Orthomyxoviren hervorgerufen. Begleiterscheinungen wie Lungenentzündung erfolgen durch das Virus selbst oder Adenoviren oder Bakterien wie Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae. Es gibt 3 Typen von Grippe-Viren: A, B und C. Influenza A kann Mensch und Tier infizieren, Influenza B und C nur Menschen. Die großen Epidemien werden nur vom A oder B-Typ hervorgerufen. Das Grippe-Virus ist rundlich bis oval und ca. 100 nm im Durchmesser. Die gesamte Hülle hat als Außenbelag eine Lipoid-Schicht aus der 2 Typen von Proteinmolekülen wie Spikes herausragen: ein Hämagglutinin (H) und eine Neuraminidase (N). Diese helfen dem Virus bei der Adsorption, (diese Proteine wirken als Antigen, das Immunsystem erkennt die Viren daran als körperfremd und bildet Antikörper). Darunter liegt eine Proteinschicht. Im Innern befinden sich 8 einsträngige RNA-Moleküle jeweils von Protein umhüllt genannt Nukleoprotein. Das Grippevirus vermehrt sich, wie das Schema zeigt, durch einen lytischen Zyklus. 14
Das Virus wird durch Endozytose in die Zelle aufgenommen. Dabei entsteht im Zytoplasma ein Endosom. Dieses verlässt das Virus unter Verlust seiner Proteinhülle. Die RNA-Moleküle wandern in den Zellkern und werden repliziert und transkribiert. Die entstehende mrna mit den viralen Genen wird durch Translation an den Ribosomen der Zelle in Virusproteine umgesetzt. Ein Teil bildet mit der replizierten Viren-RNA die Nukleoproteine. Der Rest wird nach Reifung am ER der Zelle mit dem Nukleoprotein zum Capsid zusammengebaut. Retroviren Die Retroviren stellen eine besondere Klasse der Viren dar, welche eukaryotische Zellen infizieren. Ein Retrovirus ist ein behülltes Einzel(+)-Strang-RNA-Virus, (ss(+)rna), dessen Erbinformation zwar als RNA vorliegt, aber als DNA fest in das Genom der Wirtszelle eingebaut wird. Zur Gruppe der Retroviren gehören die Onkoviren, z.b. HTLV-I, -II, die Lentiviren, darunter der bekannteste Vertreter HIV, sowie die Foamyviren (syn. Spumaviren), die in der Natur bei verschiedenen Tieren vorkommen und die keine Erkrankungen hervorrufen. Retroviren bestehen aus einer äußeren proteinhaltigen Lipid-Hüllmembran und einer inneren Proteinhülle, sowie einem Core aus weiteren Proteinen und einem Ribonuklein-Komplex. Die Retroviren sind die einzigen RNA-Viren, die diploid angelegt sind sie werden nur von den wirtseigenen Transkriptions-Enzymen übersetzt und neusynthetisiert benötigen eine spezifische zelluläre RNA (trna) sind die einzigen einsträngig-plusstrangorientierten RNA-Viren, bei denen das Genom nicht sofort als Matrize (mrna) bei der Infektion benutzt werden kann. Wenn das Virus diese RNA in die zu befallende Zelle eingebracht hat, muss die RNA in doppelsträngige DNA Desoxyribonukleinsäure (DNA), überführt werden. Dieser Vorgang wird reverse Transkription genannt. Dazu bringt das Virus das Enzym Reverse Transkriptase mit. Diese schreibt die RNA des Virus in DNA um, welche dann in das Genom der Wirtszelle integriert. Normalerweise verläuft die Transkription an der DNA als Matrize, wobei ein komplementärer RNA-Strang synthetisiert wird. Das Retro bezieht sich auf die Umkehrung dieses Grundsatzes. Deshalb verursachen Retroviren oft latente Infektionen. Man nimmt an, dass das menschliche Genom im Laufe der Evolution mit unzähligen Retroviren durchsetzt wurde, die größtenteils 15
längst nicht mehr infektiös sind. Sie erklären aber vielleicht die Existenz von springenden Genen. Da dieser Prozess durch die fehlende Korrekturlese-Fähigkeit der Reversen Transkriptase relativ ungenau ist, erfolgen häufige Mutationen des Virus. Diese ermöglichen eine schnelle Anpassung des Virus an antivirale Medikamente und damit eine Ausbildung von Resistenzen. Vermehrung Die Vermehrung der integrierten Virus-DNA, auch Pro-Virus genannt, erfolgt entweder bei der Zellteilung mit der Verdopplung der Wirts-DNA oder intrazellulär durch die so genannte Retrotransposition: Dabei wird der Pro-Virus aus der DNA wieder herausgeschnitten, vermehrt und an verschiedenen Stellen des Genoms wieder integriert. Genom eines Retrovirus Das Genom eines Retrovirus enthält in der Regel drei Gene und zwei LTRs (long terminal repeats), die sich am Anfang und am Ende befinden. Sie enthalten Steuersequenzen zur Genexpression. 5 -LTR -gag-pol-env- LTR-3 gag codiert die Proteine der inneren Kapsel pol codiert die reverse Transkriptase env codiert die Proteine der Hülle Das AIDS-Virus HTLV-III enthält noch 4 weitere Kontrollgene: tat, trs, sor, 3 orf Erfolgt die Integration eines Retrovirus in eine Keimzelle, wird das Pro-Virus zum endogenen Retrovirus (ERV), es wird an die nächste Generation weitergegeben. Im Genom der Primaten befinden sich die Genome von zwei Retro-Viren (HERV-H und HERV-K, wobei HERV für humanes endogenes Retrovirus steht), die zu unterschiedlichen Zeiten integriert und vermehrt wurden. Ihre Evolution lässt sich auf Grund der Unterschiede in der Basensequenz rekonstruieren. Eine besondere Bedeutung haben die LTR-Sequenzen der HERVs, die sich am Anfang und am Ende eines viralen Genoms befinden. Da die beiden LTR-Sequenzen miteinander rekombinieren können, ist im Laufe der Evolution ein Großteil der viralen Gensequenzen verloren gegangen. Übrig geblieben sind einzelne LTRs, die 8,5 % des Gesamtgenoms ausmachen. Vollständige virale Sequenzen machen nur 0,5 % aus. Mindestens 60 % dieser LTRs sind im menschlichen Genom noch aktiv und steuern Wirtsgene. 16
Plasmide Die Plasmide sind kleine, selbständige Einheiten genetischer Information, die unabhängig vom eigentlichen Genom in einer Bakterienzelle existieren können. Dazu bringen sie eine besonders wertvolle Eigenschaft mit, und zwar die, von Bakterienzellen auf die Nachkommen vererbt zu werden. Plasmide sind im Verhältnis zum Chromosom sehr kleine Moleküle (s.pfeil) Der Teilung einer Bakterienzelle geht die Verdopplung der genetischen Information voraus, damit beide Tochterzellen später auch wissen, was sie zu tun haben. Der bereits kurz erwähnte Mechanismus der DNA-Verdopplung wird von der Zelle dabei genauestens kontrolliert. Um diese Kontrolle zu ermöglichen gibt es auf der DNA nur wenige Stellen, von denen aus die Verdopplung starten kann. Das Vorhandensein mindestens eines solchen Startpunkts ist andererseits zwingend erforderlich, wenn die DNA verdoppelt werden soll. Für die Gentechniker gibt es daher zwei Möglichkeiten, wenn sie fremde DNA in einer Zelle und deren Nachkommen erhalten möchten. Entweder wird die fremde DNA mit der Gesamt- DNA der Wirtszelle verbunden und von dieser dann als Einheit behandelt und vererbt. Oder man plaziert die fremde DNA wie einen winzigen Satelliten neben das Genom der Wirtszelle. In diesem Fall muss dann aber dafür gesorgt sein, dass auch ein Startpunkt für die Verdopplung der fremden DNA vorhanden ist. Hier kommen die Plasmide ins Spiel. Plasmide verfügen oft nur über wenige Gene, beherrschen dafür aber die eigene Verdopplung besonders gut. Sie begnügen sich häufig nicht damit, so wie das bakterielle Genom in nur einer Ausfertigung in der Zelle vorzuliegen. Es können vielmehr bis zu mehreren Hundert solcher Moleküle in einer Zelle vorhanden sein. Bei der Teilung einer Bakterienzelle werden die Plasmide mehr oder weniger gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen verteilt. Wenn man es also schafft, die fremde DNA mit einem solchen Plasmid zu verbinden, dann hat man damit eine weitere Möglichkeit, die fremde DNA in einer Bakterienzelle und ihren Nachkommen zu erhalten. Wie das im einzelnen geschieht wird in der Abbildung genauer erläutert. Noch eine andere wichtige Eigenschaft bringen viele Plasmide mit. Sie tragen Resistenzgene, die dafür sorgen, dass ihre Wirtszellen gegen bestimmte Antibiotika unempfindlich werden. An dieser Eigenschaft kann man daher Bakterien leicht erkennen, die ein entsprechendes Plasmid beherbergen. Dies gibt den Wissenschaftlern die Auslese, die Selektion, von gezielt einzusetzen. Wird ein bestimmtes Antibiotikum dem Medium zugegeben, in dem die Bakterien wachsen, dann überleben nur die mit einem entsprechenden Plasmid und Resistenzgen. Plasmide bieten die Grundlage für das Klonieren, die Grundoperation der Gentechnik: Ein Plasmid wird mit einem Restriktionsenzym geöffnet und fremde DNA in die Schnittstelle eingepasst. Dann wird die rekombinierte DNA in Wirtszellen übertragen und von diesen vermehrt. 17