Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Stefan A. Esenwein Dienstort: HELIOS Klinikum Schwelm Klinik für Unfallchirurgie und Orthopädische Chirurgie

Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Stefan A. Esenwein Dienstort: HELIOS Klinikum Schwelm Klinik für Unfallchirurgie und Orthopädische Chirurgie In vitro Untersuchung zur osteogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen sowie deren Expression von IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF unter niederenergetischer, gepulster Ultraschallanwendung Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Uta Maria Lindecken aus Bonn 2012

Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. K. Überla Prof. Dr. med. S. A. Esenwein Prof. Dr. med. R. Willburger Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2012

Die beste Arznei für den Menschen ist der Mensch. Der höchste Grund dieser Arznei ist die Liebe. Philippus Theophrastus Paracelsus Für meine Familie

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung... 3 1.1 Interleukine (IL-6, IL-8, IL-11)... 3 1.2 Vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF)... 3 1.3 Alkalische Phosphatase... 4 1.3.1 Periost, Knochen und Knochenmark... 4 1.4 Direkte und indirekte Frakturheilung... 6 1.4.1 Behandlung der Pseudarthrose... 8 1.5 Einflussfaktoren auf den Knochenstoffwechsel... 9 1.5.1 Medikamente und Noxen... 10 1.5.2 Stoffwechselstörungen... 12 1.6 Mechanische Reize... 13 1.6.1 Ultraschall... 14 1.6.2 Osteosynthetische Versorgung... 16 1.6.3 Dehnung und Scherkraft... 17 1.6.4 Druck und Kompression... 18 1.6.5 Wärmeapplikation und Lasertherapie... 18 1.6.6 Elektrostimulation... 19 1.6.7 Magnettherapie... 19 1.6.8 Elektromagnetische Felder... 20 1.6.9 Pulsierende Signaltherapie... 21 1.6.10 Stoßwellentherapie... 21 Ziel dieser Dissertation... 23 2 Material und Methoden... 24 2.1 Materialien... 24 2.2 Zellbiologische Methoden... 29 2.2.1 Zellkultur... 29 2.3 Ultraschall-Versuchsapparatur... 32 2.3.1 Das Ultraschallgerät... 32 2.3.2 Versuchsaufbau... 32 2.4 Stimulation der Zellkulturen... 33 2.4.1 Ultraschallbehandlung der Monolayer-Kulturen... 33 2.4.2 Zellkulturmedium der Monolayer-Kulturen... 34 2.5 Dreidimensionale Kultur im Fibrinclot... 34 2.5.1 Herstellung von Fibrinclots... 34 2.5.2 Ultraschallbehandlung der Fibrinclots... 35 2.5.3 Zellkulturmedium der Fibrinclots... 35 2.6 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)... 36 2.6.1 Prinzip der Sandwich-ELISA Technik... 36 2.6.2 Durchführung des Sandwich-ELISAs... 36 2.7 Mikroskopie... 38 2.7.1 Lichtmikroskopie mittels Phasenkontrast... 38 2.7.2 Fluoreszenzmikroskopie... 39 2.8 Färbemethoden... 39 2.8.1 Calcein-Propidiumjodid-Färbung... 39 2.8.2 Calcein-Propidiumjodid-Färbung der Fibrinclots... 40 2.8.3 Calcein-Propidiumjodid-Färbung der Monolayer-Kulturen... 41 2.8.4 Alizarin-Rot-Färbung... 41 1

2.8.5 Alizarin-Färbung der Monolayer-Kulturen... 42 2.8.6 AlamarBlue-Assay... 43 2.8.7 Atto-Phos-Assay... 44 2.9 ph-messung des Zellkulturmediums der Monolayer-Kulturen... 45 3 Ergebnisse... 46 3.1 Stimulation von Monolayer-Kulturen... 46 3.2 Dreidimensionale Zellkulturen... 47 3.2.1 Die Überlebensfähigkeit von hmscs im Fibrinclot... 47 3.2.2 Ultraschallstimulation von hmscs im Fibrinclot... 48 3.3 ph-wert Messung des Zellkulturmediums... 53 3.4 ELISA Einfluss von niederenergetischem, gepulstem Ultraschall auf die Freisetzung von IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF in vitro... 54 3.4.1 Untersuchung des Zellkulturmediums der Monolayer-Kulturen... 54 4 Diskussion... 58 4.1 Zellmaterial... 58 4.1.1 Humane mesenchymale Stammzellen (hmscs)... 58 4.2 Stammzellcharakteristika... 60 4.2.1 Humane Mesenchymale Stammzellen (hmscs)... 61 4.3 Vergleich zu transformierten Zellen... 62 4.4 Ultraschall... 63 4.5 Zelluläre Effekte durch Ultraschall... 64 4.6 Stammzelltherapie und Ultraschalltherapie zur Frakturheilung... 64 4.6.1 Molekulare Einflüsse durch niederenergetischen gepulsten Ultraschall... 67 4.7 Zellkulturen... 67 4.8 Ultraschallanwendung und Tissue engineering... 68 4.9 Diskussion der molekularbiologischen Methoden... 69 4.10 Zellzahl und Kalzifizierung... 70 4.11 Diskussion der Ergebnisse... 71 4.11.1 Kalzifizierung der Zellmatrix... 71 4.11.2 Zellviabilität und -vitalität... 71 4.11.3 Zytokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen... 72 4.11.4 IL-6... 73 4.11.5 IL-8... 75 4.11.6 IL-11... 75 4.11.7 ph-wert... 76 4.12 Statistische Auswertung... 76 5 Zusammenfassung... 77 6 Literaturverzeichnis... 79 7 Danksagung 8 Curriculum Vitae 2

1 Einleitung 1.1 Interleukine (IL-6, IL-8, IL-11) Die Funktionen der Interleukine unterscheiden sich erheblich. Sie dienen der Stimulation oder Hemmung von Zellreifung, Zellwachstum und Zellteilung. Interleukine sind zu den Zytokinen zählende Mediatoren. Es handelt sich um körpereigene Botenstoffe, die die Kommunikation zwischen Leukozyten, Monozyten, Makrophagen und Mastzellen steuern. Interleukine sind Glykoproteine, die z.b. von Lymphozyten, Makrophagen und Endothelzellen sowie hmscs synthetisiert werden. Zytokine werden entweder durch ihre biologischen Funktionen, nach ihrem Rezeptor oder ihrer Struktur eingeteilt IL-6 und IL-11 beeinflussen den Knochenstoffwechsel und regulieren die Funktion und Entwicklung von Osteoblasten und Osteoklasten (Manolagas et al., 1998). IL-8 stimuliert die Angiogenese und eine Beteiligung an Tumorneubildungen wird diskutiert (Oldham und Dillman, 2009). IL-6 wird von humanen mesenchymalen Stammzellen synthetisiert. Es wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Kalzifizierung der Zellmatrix und der Konzentration der Zytokine unter niederenergetischer, gepulster Ultraschallanwendung hergestellt werden kann. 1.2 Vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF) Mit Unterstützung von Proteasen ist das Angiogenese fördernde Protein VEGF für die Ausbildungen von Kapillarsprossen verantwortlich. Es handelt sich um Signalmoleküle, die in der Angiogenese und in der Vaskulogenese eine wichtige Funktion übernehmen. Endothel wird durch VEGF zu Wachstum und Neubildung stimuliert. Auch die Einwanderung von Makrophagen und Monozyten wird durch VEGF angeregt, indem es an Tyrosinkinase gebunden und eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang gesetzt wird. VEGF verbessert die Bone morphogenic protein-2-induzierte Knochenheilung und Knochenneubildung durch die Regulierung der Angiogenese (Peng et al., 2005). Eine Veränderung der Synthetisierung von VEGF bei osteogener Stimulation durch niederenergetische, gepulste Ultraschallanwendung wurde in der vorliegenden Studie untersucht. 3

1.3 Alkalische Phosphatase Der Gehalt der alkalischen Phosphatase wurde gemessen, weil dadurch eine Erhöhung des Osteoblastenanteils nachgewiesen werden kann. Die Expression der alkalischen Phosphatase durch Osteoblasten kann durch Ultraschallanwendung gesteigert werden (Takayama et al., 2007). Niederenergetischer, gepulster Ultraschall steigert die Aktivität der Alkalischen Phosphatase, die Sekretion von Osteokalzin, die Expression von osteoblastenspezifischen Genen und die Mineralisierung von Progenitorzellen (Hasewaga et al., 2009). Die Konzentration der alkalischen Phosphatase steigt bei einer gesteigerten Umstrukturierung von Knochen, aber auch bei der Degenerierung von Knochengewebe im Rahmen pathologischer Prozesse. Es gibt zahlreiche Ursachen, die eine veränderte Konzentration der Alkalischen Phosphatase im Blutserum bewirken können. Neben hepatischen (Zhou et al., 2009), renalen (Gal-Moscovici et al., 2007) und medikamentösen (Krishnamoorthy et al., 2009) Gründen ist dieses Enzym auch bei ossären Prozessen wie Knochenmetastasen (Casetta et al., 1995), Osteoporose (Majima et al., 2009) sowie während der Knochenaufbauphase (Seibel, 2005) in veränderter Konzentration vorhanden. Ein Aktivitätsanstieg der alkalischen Phosphatase ist ein deutlicher Hinweis für eine osteogene Differenzierung (Cheng et al., 1996). Der relative Anstieg der Stoffwechselaktivität der alkalischen Phosphatase ist dabei als Indikator für die osteogene Potenz von hmscs anzusehen (Mendes et al., 2004). 1.3.1 Periost, Knochen und Knochenmark Knochen sind bis zur Knorpelgrenze von Periost umgeben. Das Periost setzt sich aus zwei Schichten zusammen. Dabei gibt es eine knochenbildende Schicht (Stratum osteogenicum). Diese Schicht liegt dem Knochen unmittelbar an. Sie wird auch knochenbildende Schicht genannt, weil sie im juvenilen Zustand osteoblastenreich ist. Im zunehmenden Alter nimmt die Anzahl der Osteoblasten ab. Darin enthaltende Vorläuferzellen können sich aber stets zu Osteoblasten entwickeln, welches im Falle einer Fraktur geschieht. Das Stratum fibrosum stellt die äußere Schicht des Periosteums dar und wird auch als Faserschicht bezeichnet. Es zeichnet sich durch ein Geflecht zugfester Fasern aus und dient den Skelettmuskeln, Bändern und Sehnen als Ansatz und Ursprung. Die Knochenhäute sind stark durchblutet und durch 4

ihre Innervation sehr schmerzempfindlich. Das Periost ist durch gebündelte Fasern (Fibra perforans) mit dem Knochen verbunden. Diese Fasern sind auch nach ihrem Entdecker William Sharpey (1802 1880) benannt und als Sharpey-Fasern bekannt (Lippert, 2006). Die Kochen im menschlichen Körper stellen sich aus den Ossa longa, Ossa plana, Ossa brevia, Ossa sesamoidea, Ossa pneumatica und Ossa irregularia zusammen. Knochengewebe setzt sich aus organischen und anorganischen Substanzen zusammen. Dazu gehören Osteozyten, Mineralien und kollagene Fibrillen. Kalziumcarbonat, Magnesiumphosphat und Kalziumphosphat sind die bedeutendsten Mineralien des Knochens, wobei auch weitere Verbindungen von Fluor, Chlor, Kalium, Natrium und Kalzium eine Rolle spielen. Die Festigkeit und Stabilität eines Knochens ist unter anderem von seinem Salzgehalt abhängig. Während der Knochenalterung ändert sich das Verhältnis zwischen Mineralgehalt und kollagenen Fibrillen, welches ebenfalls die Elastizität des Knochens beeinflusst. Während ein Neugeborenes einen anorganischen Salzgehalt von etwa 50% aufweist, sind es im hohen Alter zirka 70%. Dadurch sinken Stoßfestigkeit und Biegsamkeit des Knochens (Platzer, 2003). Die Substantia compacta bildet die äußere Knochenschicht. Sie besteht aus Osteonen. Ein Osteon besteht aus einem zentralen Kanal, welcher von konzentrischen Knochenlamellen umgeben ist. Diese Knochenlamellen bestehen aus Osteozyten. Der Kanal des Osteons enthält zwei Blutgefäße, die sogenannten Havers-Gefäße. Knochen bestehen nach dem Leichtbauprinzip zum größeren Teil aus Knochenmark. Das Knochenmark befindet sich in den Röhrenknochen in der Cavitas medullaris. In den Epiphysen, platten und kurzen Knochen ist es zwischen den Knochenbälkchen anzutreffen (Lippert, 2006). Das Knochenmark ist ein komplexes Gewebe aus hämatopoetischen Zellen und nichthämatopoetischem Stroma, das sowohl die Differenzierung als auch die Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen unterstützt (Jaiswal et al., 1997). Im Stroma finden sich mesenchymale Zellen, z.b. Osteoblasten, Adipoblasten, Fibroblasten und mesenchymale Vorläuferzellen (Pittenger et al., 2000). Das rote Knochenmark übernimmt ab dem vierten Embryonalmonat neben Milz und Leber die wichtigste blutbildende Funktion. Das gelbe Knochenmark enthält Fett- und Retikulumzellen. Es ist vor allem in diaphysären Knochenabschnitten vorzufinden und kann in rotes Knochenmark redifferenzieren (Lippert, 2006). Das weiße Knochenmark ist eine Unterart des gelben Knochen- 5

marks. Es stellt eine degenerierte Form des gelben Knochenmarks dar. Anstelle der Fetteinschlüsse enthält es mehr Wasser. 1.4 Direkte und indirekte Frakturheilung Bereits in der Antike wurden Knochenbildungs- und Regenerationsvorgänge diskutiert. Die Selbstheilungsfähigkeit des Knochens war jedoch umstritten. So beschrieb Galen von Pergamon (ca. 129 200 n. Chr.) die Knochenheilung durch Nahrungssäfte, die die Bruchenden als Leim verbinden würden, ohne selbst Knochen zu sein oder zu werden. Diese Theorie überdauerte die Zeit der Renaissance und änderte sich erst im 17. Jhd. durch Antonius de Heide (1646 1693), der die Kallusbildung und die damit verbundene Frakturheilung durch organischen Knochenersatz experimentell nachweisen konnte. Henri Louis Duhamel du Monceau (1700 1782) unterstützte die Theorie der Knochenneubildung und schrieb insbesondere dem Periost eine osteogenetische Potenz zu. Zum Beweis seiner Theorie verfütterte er phasenweise die Wurzel der Pflanze Rubia tinctorum (Krapp) an seine Versuchstiere. Der enthaltene pflanzliche Farbstoff Alizarin färbte die Knochenlamellen der Tiere zu Lebzeiten rötlich. Bei deren Sektion zeigten sich abwechselnd rote und weiße Knochenlamellen als Zeichen des appositionellen Knochenwachstums. 1845 gelang es John G. Goodsir (1814 1867) eine knochenbildende spezifische Zelle, die er Osteoblast nannte, zu erkennen. Aus heutiger Sicht stellt vor allem das lokale Hämatom den Ursprung der Initialisierung der Knochenheilung dar (Bolander, 1992; Berchtold, 2006). Diese Vermutung wurde bereits 1905 geäußert und es wurde versucht, Frakturen durch die Injektion von Blut zu therapieren (Bier, 1905). Für die Frakturheilung sind die enchondrale Ossifikation und die Gewebedifferenzierung von besonderer Bedeutung (Isaksson et al., 2006). Dabei werden die beteiligten Zellen von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Zytokinen reguliert, worauf im weiteren Verlauf noch näher eingegangen wird. Knochengewebe verfügt über Regenerationsfähigkeiten. Man unterscheidet bei der Frakturheilung die direkte Form von der indirekten Form. Für die direkte Frakturheilung ist eine sogenannte absolute Stabilität erforderlich, die typischerweise durch die osteosynthetische Versorgung des Bruches gewährleistet wird. Die direkte Frakturheilung kommt physiologischerweise in der Natur nicht vor und ist ein Resultat der operativen Stabilisierung. Sie definiert sich durch eine direkte angiogene Knochen- 6

neubildung. Falls die Knochenfragmente auch mikroskopisch gesehen aufeinander treffen, kommt es zur Kontaktheilung und Osteone werden miteinander verankert. Während der Spaltheilung haben die Osteone keinen direkten Kontakt. Der Defekt wird mit Geflechtknochen gefüllt und mit Havers-Gefäßen ausgestattet. Spontane Bruchheilungen, dynamische osteosynthetische Verfahren wie Marknagelungen sowie konservativ und funktionell behandelte Frakturen sind durch die sekundäre Frakturheilung gekennzeichnet (Berchtold, 2006). Die indirekte Frakturheilung erfolgt in mehreren Schritten. Zunächst bildet sich nach einem Frakturereignis ein Hämatom. Anschließend folgt nach einigen Tagen die Entzündungsphase. Es kommt zur Ausbildung eines organisierten Hämatoms. Osteozyten gehen zu Grunde, während Fibroblasten in den Frakturspalt einwandern. Die Neovaskularisation beginnt. Während der reparativen Phase bildet sich weicher Kallus. Dieser Prozess ist auch als Granulationsphase bekannt. Osteoblasten bilden Geflechtknochen, der im Folgenden mineralisiert wird. Aus ihm entsteht anschließend der lamelläre Knochen. Osteoblasten und Osteoklasten zeigen noch eine starke Aktivität. Im Knocheninneren bildet sich das Gefäßsystem weiter aus. Undifferenzierte mesenchymale Zellen gelangen in den Frakturspalt. Diese sind proliferations- und differenzierungsfähig. Im Verlauf der Entzündungsphase werden Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Zytokine, extrazelluläre Matrixkomponenten und Hormone von verschiedenen Zellen sezerniert und regen vorhandene Zelllinien zur Proliferation und Differenzierung an (Weiss et al., 2008; Kwong und Harris, 2008). Die Bildung von bindegewebigem Granulationsgewebe ist die Folge. In diesem Granulationsgewebe entwickeln sich Zellen mit chondrogener und osteogener Potenz. Im periostalen Bereich und an der Knochenoberfläche differenzieren sich Osteoblasten, die für die desmale Osteogenese verantwortlich sind. Im enchondralen Bereich entsteht Knorpelgewebe, das rasch kalzifiziert und anschließend resorbiert wird. Es werden Knochenbälkchen, bestehend aus Faserknochen, eingelagert. Sie dienen der Überbrückung des Frakturspalts. Die Knochen- und Knorpelneubildung zeigen sich in Form von Kallusgewebe. Das Knorpelgewebe, im Sinne von Faserknorpel, wird zu Lamellenknochen umgewandelt (Einhorn, 1998). Die im Hämatom befindlichen Thrombozyten exprimieren bereits 24 Stunden nach dem Ereignis TGFß1 (Joyce et al., 1990). TGF-ß1 (Transforming Growth Factor-ß1) stimuliert die Zellproliferation und Genexpression im Kallusgewebe (Si et al., 1997). Proinflammatorische Zytokine sind an der Frakturheilung beteiligt (Cho et al., 2007). Eine weitere an 7

der Frakturheilung beteiligte Gruppe stellen die Bone morphogenetic Proteins (BMPs) dar. Sie sind Bestandteil des TGF-ß1 Signalsystems und sind auch als parakrine Signalmoleküle bekannt. Es wurde eine Korrelation zwischen der BMP-2- Konzentration und der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten und Chondrozyten beobachtet (Si et al., 1997). Die Verbesserung und Beschleunigung des Frakturheilungsprozesses durch die Zugabe von rekombinantem humanem BMP-2 wurde nachgewiesen (Govender et al., 2002). Außerdem ist der Insulin-like growth factor (IGF) am Knochenheilungsprozess beteiligt. Er wurde in hoher Konzentration in der Knochenmatrix nachgewiesen (Finkelmann et al., 1990). IGF-1 und IGF-2 werden durch Osteoblasten exprimiert und sind für die Freisetzung von Kollagen-Typ-1 verantwortlich (Lind, 1996). Während der Bildung des Granulationsgewebes konnten IGF-1, während der Knorpel- und Knochenneubildung IGF-1 und IGF-2 nachgewiesen werden (Andrew et al., 1993). Durch ein akutes Frakturereignis werden Prostaglandine der Gruppe E und F von Knochen- und Muskelgewebe freigesetzt. Dabei besitzt Prostaglandin- E 2 einen stimulierenden Effekt auf die Knochenneubildung (Chyun und Raisz, 1984). 1.4.1 Behandlung der Pseudarthrose Die Voraussetzungen für eine ungestörte Knochenheilung sind die Ruhigstellung der Fraktur, Infektionsschutz und eine ausreichende Vaskularisation. Bei Fehlen dieser Voraussetzungen können Frakturheilungsstörungen die Folge sein. 10 20% aller Knochenbrüche gehen mit Heilungskomplikationen einher (Haas, 2000). Von einer sogenannten Pseudarthrose spricht man, wenn die Heilung einer Fraktur nach 6 Monaten noch nicht geschehen oder die Heilungsprogression nach 3 Monaten noch nicht sichtbar ist (Wiss und Stetson, 1996). Die grundlegende Ursache von pseudarthrotischen Frakturheilungsstörungen ist das Trauma (80%), gefolgt von postoperativen Komplikationen (10 15%) und kongenitalen Ursachen (3%) (Pfeil et al., 1996). Pseudarthrosen werden in atrophe und hyperthrophe Formen unterteilt (Weber und Czech, 1973). Hypertrophe Pseudarthrosen werden bei Ausbleiben eines konservativen Heilungserfolges in der Regel osteosynthetisch versorgt und stabilisiert. Da sie über einen aktiven Knochenstoffwechsel verfügen, ist diese Form der Therapie, die die zuvor bestehende Instabilität beseitigt, meist ausreichend. Atrophe Pseudarthrosen definieren 8

sich durch areaktive Verhältnisse. Die Konzentration von Wachstumsfaktoren ist innerhalb atropher Pseudarthrosen vermindert (Niikura et al., 2006). Das Knochenwachstum bedarf hier einer Stimulation. Als Goldstandard ist an dieser Stelle die Spongiosaplastik zu nennen. Durch diesen operativen Eingriff mit autologem Knochenmaterial, in der Regel aus dem Beckenkamm, werden unter anderem mesenchymale Stammzellen, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie Knochenmatrix transplantiert (Khan et al., 2005). Die Heilungschancen werden somit erhöht. 1.5 Einflussfaktoren auf den Knochenstoffwechsel Im folgenden Kapitel werden vor allem pathologische Aspekte der Beeinflussung des Knochenstoffwechsels besprochen. Physiologische Knochenveränderungen werden neben dem Wachstum auch durch das Altern hervorgerufen. Es wurde an Mäusen beobachtet, dass die Osteoklastogenese im Alter signifikant durch Bindegewebszellen und Osteoblasten stimuliert wird (Cao et al., 2005). Durch die veränderte Endokrinologie im Alter wird im Hypophysenvorderlappen weniger Somatotropin (STH) produziert. Dadurch sinkt die Produktion von IGF-1, die Erniedrigungen der Hautdicke, Knochenmasse und Muskelmasse zur Folge hat. Durch die verminderte Sekretion des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH), steigt das Osteoporoserisiko (Silbernagl und Lang, 2005). Diese Veränderungen können als physiologische Veränderungen des alternden Menschen betrachtet werden. Außerdem wird die Belastbarkeit des Knochenskeletts durch muskuläre Beanspruchungen unterstützt (Karasik und Kiel, 2008). Niederenergetischer, gepulster Ultraschall verbessert die Stabilität osteoporotischer Knochen und beugt somit osteoporosebedingten Frakturen vor (Kim et al., Ko et al., 2009). Niederenergetischer, gepulster Ultraschall beeinflusst die Elastizität und Viskoelastizität am osteomalazischen Knochen (Ferreri et al., 2009). Malnutrition kann die Qualität des Skeletts beeinflussen. Kalzium, Proteine und Vitamin D sind unerlässliche Nährstoffe für ein physiologisches Knochenwachstum (Morgan, 2008). Die Substitution von Zink kann Frakturheilungsprozesse stimulieren (Sadighi et al., 2008). Während der Entwicklungsphase erhöht Proteinmangel das Risiko für Spontanfrakturen und Osteoporose (Bonjour et al., 2001). Die Knochen- 9

masse und die Knochenneubildung werden durch Hypovitaminosen, chronische Essstörungen wie Anorexie und diätetischem Gewichtsverlust reduziert (Seibel, 2002). Chronischer Alkoholmissbrauch reduziert die Knochenmasse, verzögert die Knochenbruchheilung und inhibiert die osteogene Differenzierung (Brown et al., 2002). 1.5.1 Medikamente und Noxen Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) sind in der traumatologischen und orthopädischen Therapie aufgrund ihrer antiphlogistischen, antipyretischen und analgetischen Wirkung sehr beliebt. Zudem hemmen sie die Bildung von heterotopen Ossifikationen nach endoprothetsicher Versorgung des Hüftgelenks. Allerdings verzögern NSAR die Knochenbruchheilung (Beck et al., 2005). In einer tierexperimentellen Studie an Ratten zeigte Diclofenac einen negativen Einfluss auf die Knochenheilung, indem die Anzahl von Osteoblasten vermindert wurde (Krischak et al., 2007). Die mechanische Belastbarkeit des Knochens unter Diclofenac-Therapie wurde untersucht und erwies sich als signifikant verringert (p = 0.006, p = 0,009). Computertomographische Untersuchungen, Dreipunktbiegeversuche und histologische Auswertungen belegen verzögerte Frakturheilungsprozesse unter Diclofenac-Therapie, die im Tierversuch an Ratten nachgewiesen werden konnten (Beck, et al., 2003). Auch Cyclooxygenase-2- Hemmer unterdrücken die Frakturheilung (Leonelli et al., 2006). Auch Glukokortikoide interagieren mit dem Knochenstoffwechsel. Die Synthese der Knochenmatrix wird herabgesetzt. Die Anzahl der Osteoblasten wird reduziert (Reid, 2000). Einige unerwünschte Nebenwirkungen sind auf veränderte Kationenaustauscher zurückzuführen (Ferrari, 2003). Glukokortikoide wirken katabol und verfügen über eine mineralokortikoide Wirkung. H + - und K + -Ionen werden verstärkt renal ausgeschieden. Die Reabsorption von Natrium an den Sammelrohren und im distalen Tubulussystem wird gesteigert. Vermutlich ist für diese Elektrolytverschiebungen eine verstärkte Transkription der Serum- und glukokorikoidinduzierten Kinase (SGK- Kinase) verantwortlich. Die SGK-Kinase ist für die Phosphorylierung und Aktivierung des amiloridsensitiven epithelialen Natriumkanals (ENaC) zuständig. Unter zusätzlichen Beeinträchtigungen der Na + -K + -ATPase und Untereinheiten der Natriumkanäle wird die Natriumretention gesteigert. Durch den osmotischen Gradienten strömt 10

Wasser in den Extrazellularraum. Durch den Na + -K + -Austausch folgen Hypokaliämie und eine metabolische Alkalose. Anders als die mineralokortikoide Wirkung zeigt sich die Wirkung über die Bindung von Glukokortikoiden an den Glukokortikoidrezeptor. Beispielsweise erhöht Kortisol die glomeruläre Filtration. Glukokortikoide hemmen die enterale Kalziumresorption und steigern die renale Phosphat- und Kalziumausscheidung (Aktories et al., 2005). Dies führt zu einer Kalksalzminderung des Knochens. Die regelmäßige Zufuhr von Glukokortikoiden steigert dadurch das Fraktur- und Osteoporoserisiko (Hubbard et al., 2006; Aktories et al., 2005). Unerwünschte Nebenwirkungen durch Glukokortikoidgaben könnten aus heutiger Sicht Veränderungen der Transaktivierung und Transrepression verschiedener Gene zur Ursache haben (Schäke et al., 2002). Eine hochdosierte Glukokortikoidtherapie suprimiert die endogene Steroidproduktion (Gupta und Bhatia, 2008). Glukokortikoide sind für die Hemmung von Interleukin 1, 6 und 8, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Phospholipase A 2, Cyclooxygenase-2 (COX-2), induzierbare NO-Synthase und Histamin verantwortlich. Außerdem induzieren sie die Bildung von Akut-Phase-Proteinen in der Leber. Die genetische Expression von IGF-1 durch Osteoblasten wird durch die Einnahme von Glukokortikoiden verändert. IGF-1, welches die genetische Expression von Kollagen- Typ1, RUNX2 und der Alkalischen Phosphatase in humanen mesenchymalen Stammzellen stimuliert, wird durch Glukokortikoide gehemmt (Delany et al., 1994). Tumorchemotherapien wirken sich auf den gesamten Organismus aus. Zytostatika schädigen nicht nur maligne veränderte Tumorzellen, sondern alle Körperzellen. Dabei sind vor allem Zelllinien mit einer hohen Proliferationsrate betroffen. Deshalb erleiden Haarfollikel, gastrointestinales Epithel und Knochenmark überdurchschnittliche Schädigungen mit den typischen unerwünschten Nebenwirkungen für die Patienten, wie Haarausfall, Mukositis, Stomatitis, Nausea und Knochenmarksuppression. Somit schädigen Zytostatika wie Methotrexat (MTX) das Skelettsystem (Nowinska et al., 2007). Nikotin ist ein Nerven- und Kreislaufgift. Es wirkt als N-Cholinozeptor-Agonist an den Ganglien des peripheren und zentralen Nervensystems. Die Ionenkanäle der nikotinischen Rezeptoren werden durch die Bindung geöffnet. Nikotin bewirkt an den vegetativen sympathischen und parasympathischen Ganglien und an den N-Acetylcholin- Rezeptoren (N-ACh-Rezeptoren) des Nebennierenmarks eine Depolarisierung. Durch diese Rezeptorbindungen wirkt Nikotin vasokonstriktiv, blutdrucksteigernd und positiv chronotrop. 11

Die Erregung sympathischer Ganglien hat Katecholaminfreisetzungen aus dem Nebennierenmark zur Folge. Die chronische Substitution mit Nikotin erzeugt Hypertriglyceridämien und Hypercholesterinämien sowie eine Sklerosierung und Obstruktion der Gefäße (Burgis, 2008). Die Wundheilung wird bei Nikotinaufnahme vor allem durch Arteriosklerose und Gefäßkonstriktionen erschwert. Die Knochenformation und die BMP-2 Expression der Osteoblasten werden durch Nikotin herabgesetzt (Zheng et al., 2008). 1.5.2 Stoffwechselstörungen Bei Patienten mit metabolischen und endokrinen Dysfunktionen wurden Knochenheilungsstörungen wie Pseudarthrosen in erhöhtem Maße diagnostiziert (Brinker et al., 2007). Phosphat trägt essentiell zur Skelettentwicklung und Knochenmineralisierung bei. Der Phosphathaushalt wird durch Parathyrin, Calcitriol und den Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) reguliert (Doyle et al., 2008). Dabei handelt es sich um ein komplexes Zusammenspiel der Signalwege, die nur bedingt einzeln zu betrachten sind. Parathyrin hemmt die renale Resorption von Phosphat und senkt somit den Plasmaphosphatspiegel. Phosphat wird aus dem Skelettsystem mobilisiert. Calcitriol erhöht die Phosphatabsorptionsrate in Darm und Nieren. Phosphatmangel und Phosphatüberschuss können Symptome verschiedener Erkrankungen sein. Vitamin-D-Mangel, Malabsorption, Hyperparathyreoidismus und das Fanconi-Syndrom können beispielsweise Hypophosphatämien auslösen. Die klinischen Folgen können sich auch in Form von Osteomalazien demaskieren. Hyperphosphatämien erzeugen durch die Ausfällungen von Kalziumphosphat Weichteilverkalkungen, Urolithiasis, Arthritiden und einen Kalziumabfall im Blutplasma. Durch den sinkenden Kalziumplasmaspiegel wird die Ausschüttung von Parathyrin stimuliert und somit die Entmineralisierung des Knochens verstärkt (Silbernagl und Lang, 2005). Knochengewebe kann durch verschiedenste pathophysiologische Einflüsse geschädigt werden. Dazu gehören Osteopenie, Osteoporose, Immobilisierung, Tumore und Osteomalazie. Immobilisierung verschlechtert die mechanische Funktion des Knochens und trägt zur Einbuße von Knochengewebe bei (Trebazc und Wójtowicz, 2008). Osteopenien, also Reduktionen der Skelettmasse, können auch durch fehler- 12

hafte Ernährung herbeigeführt werden. Das Auftreten von Osteoporose ist auch bei chronisch alkoholkranken Patienten ohne Leberzirrhose zu beobachten (Malik et al., 2008). Der Begriff der Osteomalazie beschreibt die gestörte Mineralisierung des Wachstumsknorpels beziehungsweise der Knochengrundsubstanz. Sollten die Epiphysenfugen im Wachstum noch nicht geschlossen sein, wird bei einer solchen Störung häufig der Krankheitsbegriff der Rachitis verwendet. Calcitriolmangel kann die Ursache für Rachitis und Osteomalazie sein und wird durch Vitamin-D-Mangel, zu geringe UVB-Bestrahlung, Niereninsuffizienz und Osteoporose hervorgerufen (Silbernagl und Lang, 2005). Knochentumore können Knochengewebe zerstören. Riesenzelltumore können destruktive Veränderungen der Knochenmatrix hervorrufen (Wülling, 2002). Bei Knochentumoren und Knochenmetastasen können spontane, pathologische Frakturen auftreten, weil die Mineralisierung und die Knochenneubildung gestört werden. In diesem Kontext spricht man von der tumorinduzierten Osteomalazie (TIO). Die tumorinduzierte Osteomalazie ist unter anderem auf den intraossären Phosphatverlust zurückzuführen und ist teilweise mit mesenchymalen Tumoren vergesellschaftet (Woznowski et al., 2008). Bei der onkogenen Osteomalazie werden sogenannte Phosphatonine überproduziert. Zu diesen zählen die Signalpeptide Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23), und secreted Frizzled Related Protein 4 (sfrp4) (Ebert, 2006). Weitere molekulare Grundlagen werden derzeit noch erforscht. 1.6 Mechanische Reize Der Einfluss der mechanischen Stabilität und der mechanischen Stimulation auf die Frakturheilung wurde bisher umfangreich in verschiedenen Tiermodellen untersucht (Jagodzinski und Krettek, 2007). Bereits 1892 postulierte Julius Wolff, dass sich die trabekuläre Knochenarchitektur körperlicher Belastung anpasst. Er nannte diese Hypothese das Gesetz der Transformation der Knochen (Wolff, 1892). Knochenregenerierende Osteoblasten und knochenresorbierende Osteoklasten sind für die Aufrechterhaltung und die Heilung von Knochengewebe entscheidend. Osteoblasten und Osteoklasten werden durch physische Energie beeinflusst. Mechanische Stimulationen steigern die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) in osteoblasten- und osteoklastenähnlichen Zelllinien (Kadow-Romacker et al., 2008). Es wurde gezeigt, dass sich mechanische Belastungen auf die Determination von Zellen auswirken. 13

Zellfunktionen und phenotypische Merkmale können sich verändern. Osteogene Zellen ändern ihre genetische Expression, wenn sie mechanischen Belastungen ausgesetzt sind (Kreja et al, 2008). Einen guten Zugangsweg, um mechanische Reize in den Knochen zu leiten, stellt der externe Fixateur dar. An dessen äußeren Stabilisationsgestell können Stimulationsgeräte befestigt werden. Die Kallusbildung kann durch kontrollierte, zyklische Mikrobewegungen über einen externen Fixateur stimuliert werden (Füchtmeier et al., 1998). 1.6.1 Ultraschall Die chirurgische Forschung hat unter anderem die Erforschung der Mechanismen zur Heilung kritischer Knochendefekte zum Ziel. Die Kombination von niederenergetischer, gepulster Ultraschallanwendung und Stammzellforschung stellt die Grundlage dieser Dissertation dar. Ultraschall beeinflusst positiv die Frakturheilung (Knoch, 1965; Duarte, 1983; Xavier und Duarte, 1983). Um niederenergetischen, gepulsten Ultraschall noch effektiver für die klinische Therapie einsetzen zu können, müssen molekularbiologische Grundlagen präziser verstanden werden. Als Ultraschall bezeichnet man Schallsignale zwischen 20 khz und 1 GHz, welche oberhalb der menschlichen Hörschwelle liegen. Festkörper, Gase und Flüssigkeiten dienen als Übertragungsmedium. Ultraschallwellen breiten sich in Flüssigkeiten und Festkörpern schneller aus als in der Luft. Die Ausbreitungsgeschwindigkeit ist im Knochen zirka 10-fach höher als in der Atmosphäre. Dabei spielen Volumenelastizität und Formelastizität eine Rolle. Durch die Formelastizität der Festkörper entstehen in diesem Transversal- und Longitudinalwellen. Mechanische Schwingungen sind also an ein elastisches Medium gebunden. Es besteht eine Abhängigkeit der auftretenden Wellenlängen zum Material in welchem sie sich ausbreiten. Die Ultraschallquelle regt die umgebenden Moleküle zu rhythmischen Pendelbewegungen an. Die Energie, die die Moleküle dann aufeinander ausüben, wird wiederum von der Elastizität des übertragenden Materials bestimmt. Der Energietransport findet im Weiteren über sich abwechselnde Zug- und Druckkräfte statt. Medizinische Ultraschallgeräte arbeiten in der Regel mit sogenannten piezoelektrischen Schallgebern. Der piezoelektrische Effekt wurde erstmals 1880 von Jaques und Pierre Curie beschrieben. Durch das Zusammenspiel von elektrischer Spannung und mechanischem Druck in Festkörpern entstehen elektrische Ladun- 14

gen. Hier spricht man von dem direkten piezoelektrischen Effekt. Das Prinzip besteht in der Verlagerung der positiven und negativen Ladungsschwerpunkte. Verformen sich Festkörper durch das Anlegen von elektrischen Impulsen, spricht man von einem inversen piezoelektrischen Effekt. Im Körper breiten sich die Ultraschallwellen aus und werden teils absorbiert. Die nichtabsorbierten Ultraschallwellen werden reflektiert und in optische Informationen umgewandelt. Auch Knochengewebe besitzt piezoelektrische Eigenschaften (Shamos und Lavine, 1967). Es ist bekannt, dass die Osteogenese durch die Therapie mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall positiv beeinflusst wird. Knochenzellen nehmen unter Ultraschalltherapie verstärkt Kalzium auf (Ryaby et al., 1989). Niederenergetischer, gepulster Ultraschall steigert die Konzentration des Insulin-Like Growth Faktor 1 (IGF-1) (Naruse et al., 2003). IGF-1 fördert die Proliferation und osteogene Differenzierung humaner Stammzellen (Yu et al., 2012). Die gepulste Ultraschallbehandlung von Osteoblasten verringert die Zellproliferation (Myrdycz et al., 2002). Das Knochenwachstum und die Zytokinproduktion von IL-6, TGFα und TGFβ1 wird durch gepulste Ultraschallstimulation verändert (Kap. 1.1). Es konnte in einer Studie gezeigt werden, dass das Osteoblastenwachstum stimuliert wird. IL-6 und TGFα wurden im Zellkulturmedium nach Ultraschallanwendung in einer geringeren Konzentration nachgewiesen. TGFβ1 war im Vergleich zur Kontrollgruppe verstärkt nachweisbar. Die Vorbeugung von Osteoporose und der Schutz vor Verlust von Knochenmaterial durch gepulste Ultraschalltherapie wird diskutiert (Li et al., 2003). Eine weitere Studie zeigte den Einfluss von Ultraschalltherapie auf verschiedene Zellarten. Das angiogenetische Zytokin IL-8 und der Wachstumsfaktor VEGF wurden durch Osteoblasten, die mit niederenergetischem, gepulsten Ultraschall behandelt wurden, signifikant verstärkt exprimiert. VEGF zeigte bei allen Zellarten (Osteoblasten, Fibroblasten, Monozyten) einen signifikanten Anstieg (Reher et al., 2008). In einer Studie von Aynaci et al. (2002) wurden an 20 New Zealand Kaninchen Wirbelsäulenarthrodesen und Knochentransplantationen durchgeführt. Eine Gruppe wurde postoperativ mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall behandelt. Die Knochentransplantate wurden aus der Crista iliaca entnommen und als gestielte Transplantate zwischen den Wirbelkörpern LWK5/LWK6 eingesetzt. Die Durchblutung wurde durch Gefäßanschlüsse an die Muskulatur gewährleistet. Die Kaninchen wurden 6 Wochen für täglich 20min einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Danach 15

zeigte sich makroskopisch und radiologisch, dass die Knochenfusion bei 11 Kaninchen der Kontrollgruppe (55%) stattgefunden hat. Im Vergleich dazu zeigte sich eine statistisch erhöhte Knochenfusionsrate bei 17 Kaninchen (85%) der Ultraschall- Gruppe (p < 0,05). Histologische Untersuchungen zeigten eine verstärkte Knochenformation bei der Ultraschallgruppe. Zusammenfassend konnte eine verbesserte Wirbelkörperfusion durch die Anwendung niederenergetischen, gepulsten Ultraschalls nachgewiesen werden. Stickstoffmonoxid (NO) und Prostaglandin E 2 (PEG 2 ) sind Marker für die mechanisch induzierte Knochenneubildung. Humane mandibuläre Osteoblastenkulturen und Osteoradionekrosen wurden mittels langwelligem, kontinuierlichem Ultraschall mit 45kHz in verschiedenen Intensitäten beschallt. Die Vergleichgruppe wurde mit einem kurzwelligen, gepulsten Ultraschallsignal von 1MHz in 4 verschiedenen Intensitäten behandelt. Beide Gruppen zeigten einen Anstieg der NO- und PGE 2- Synthese durch humane Osteoblasten in vitro (Reher et al., 2002). Eine weitere Studie ermittelte, dass eine 15min gepulste Ultraschallanwendung bei einer Intensität von 600 mw/cm 2 die Zellproliferation von Osteoblasten und deren PEG 2 Sekretion signifikant steigert (Li et al., 2002). Es konnten zytoskeletale Veränderungen und erhöhte Zellzahlen durch die Anwendung von niederenergetischem, gepulstem Ultraschall bei osteoblastenartigen SAOS-2 Zellen nachgewiesen werden (Hauser et al., 2009). Niederenergetischer, gepulster Ultraschall bewirkt Veränderungen in der Proteinexpression von osteoblastären Zelllinien in vitro (Esenwein et al., 2007; Lu et al., 2009). Ultraschall beeinflusst die Kollagenbiosynthese periodontaler Zellen. Das Glykoprotein Fibronektin ist an der Geweberegeneration beteiligt. Kollagen Typ1 ist ein strukturbildendes Protein und ein elementarer Bestandteil des Knochengewebes. Beide werden von periodontalen Zellen synthetisiert. Eine herabgesetzte Synthese durch eine Ultraschallanwendung in vitro konnte nachgewiesen werden (Harle et al., 2001). 1.6.2 Osteosynthetische Versorgung Die osteosynthetische Versorgung mit einem externen Fixateur lässt Mikrobewegungen durch Belastungen und Muskelkontraktionen zu. Jedoch können posttraumatische Osteopenien, Frakturheilungsstörungen und Implantatlockerungen durch fehlerhafte Fixateure hervorgerufen werden (Augat und Claes, 2008). Eine zusätzliche 16

mechanische Reizung über einen externen Fixateur ist aus klinischer Sicht vor allem bei immobilen Patienten sinnvoll, weil die Knochenneubildung bei diesen Patienten nur in geringem Maße durch Mikrobewegungen stimuliert wird. 1.6.3 Dehnung und Scherkraft Es ist möglich, Zelldifferenzierungen durch Dehnung und Scherkraft zu bewirken, um Knochengewebe zu produzieren (Griensven van et al., 2008). Bisher ist wenig über die Auswirkungen mechanischer Belastungen auf die Knochenresorption durch Osteoklasten bekannt. Die genetische Expression des Receptor Activator of NF-κB Ligand (RANKL) kann durch Dehnung der Zellen stimuliert werden. RANKL ist ein Protein, welches den Tumornekrosefaktoren (TNF) zugehörig und wesentlich an der Knochenresorption und dem Knochenremodelling beteiligt ist. Es wird vermutet, dass die verstärkte Expression von RANKL die Anzahl der Osteozyten erhöht. Dies könnte zu einer verstärkten Knochenresorption führen (Kreja et al., 2008). Mesenchymale Stammzellen der Ratte reagieren auf zyklische Dehnung, indem sie mehr Kollagen- Typ1 und Kollagen-Typ3 synthetisieren (Zhang et al., 2008). FosB ist ein Transkriptionsfaktor, welcher für die Regulation der osteogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen mitverantwortlich und an der Knochenbildung beteiligt ist. Die genetische Expression von FosB durch hmscs kann durch deren Dehnung gesteigert werden (Haasper et al., 2008). Der Zusammenhang zwischen Scherkraft und Knochenheilung wird kontrovers diskutiert (Epari et al., 2006). In der Zellbiologie wird Scherkraft als ein wichtiger Parameter in der Beeinflussung humaner mesenchymaler Stammzellen betrachtet (Zhao et al., 2007). Perfusionskulturen fördern die Ablagerung knochenähnlicher, extrazellulärer Matrix. Grundlegende Studien haben gezeigt, dass Perfusionsströme die Mechanotransduktion anregen können (Kreke et al., 2008, Young et al., 2011). Hydrodynamische Scherungsbewegungen stimulieren die osteoblastäre Reifung durch die verstärkte Freisetzung von Osteokalzin (Kreke und Goldstein, 2004). Scherkräfte inhibieren die TNF-α-induzierte Apoptose bei Osteoblasten (Pavalko et al., 2003). 17

1.6.4 Druck und Kompression Druck durch axiale Kompression stimuliert die Knochenheilung (Epari et al., 2006). Bei der Anwendung hydrostatischen Drucks wurden morphologische und proliferative Veränderungen an Knochenmarksplasmazellen nachgewiesen (Maul et al., 2007). Mesenchymale Stammzellen reagieren auf hydrostatischen Druck, indem sie ihre Morphologie verändern (Eguum und Hunter, 2008). Als Zwischenmedium kann auch Druck auf Fibringel erzeugt und indirekt auf humane mesenchymale Stammzellen übertragen werden. Die dadurch auf die Zellen ausgeübte zyklische Kompression bewirkt in hmscs eine chondrogene Differenzierung (Pelaez et al., 2008). Ähnliche Ergebnisse erzielte eine Studie, in welcher hmscs in ein zylinderähnliches Gefäß gefüllt und mechanisch komprimiert wurden. Dabei ergab sich eine verstärkte Expression der chondrogenen Marker Kollagen-Typ 3 und Aggrecan (Angele et al., 2004). 1.6.5 Wärmeapplikation und Lasertherapie In der Vergangenheit wurden neben mechanischen Stimulationsmethoden auch physikalische Einflüsse wie lokale Wäremapplikation und Lasertherapie auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde vermutet, dass die Applikation von Wärme einen regenerationsfördernden Einfluss auf frische und chronische Wunden hat (Xia et al., 2000). Für eine adäquate Wundheilung ist eine gute Oxygenierung des betroffenen Areals notwendig. Lokale Wärmeapplikation fördert durch die hervorgerufene Vasodilatation den Sauerstoffpartialdruck im Subkutangewebe (Ikeda et al., 1998). Da die Kollagensynthese und die Regeneration von Stützgewebe sauerstoffabhängig sind, wird eine Heilungsverbesserung durch die verstärkte Oxygenierung erzielt (Coerper, 2002). Die Biegebruchfestigkeit von Kollagen-Typ 1 wird durch Hitze erhöht (Hayashi et al., 2008). Niedrigdosierte Laserbestrahlungen begünstigen die Frakturheilung, die Proliferation von Osteoblasten, die Aktivität der Alkalischen Phosphatase und die Bildung von sogenannten Bone nodulen. Hochdosierte Laserbestrahlungen erhitzen schnell das Gewebe und begünstigen die Ausbildung von metaphysärem Knochengewebe (Ninomiya et al., 2003). Intermittierende Wärmeapplikation erhöht die Zellproliferation von humanen Fibroblasten (Xia et al., 2000). Eine 18

gesteigerte Proliferationsrate konnte auch an transformierten Zellen (MG-63) und humanen mesenchymalen Stammzellen nachgewiesen werden. Außerdem wurde durch Temperaturwechsel eine verstärkte Aktivität der Alkalischen Phosphatase und eine erhöhte Mineralisierung in MG-63-Zellen und hmscs nachgewiesen (Shui und Scutt, 2001). 1.6.6 Elektrostimulation Die Unterstützung der Knochenheilung mittels Elektrotherapie wurde erstmalig im 19. Jahrhundert beschrieben. Mechanische Reize bewirken zellphysiologisch die Entstehung elektrischer Impulse, welches als elektromechanische Kopplung verstanden wird. Durch diesen Effekt wird die Umbaufähigkeit des Knochens stimuliert (Hungerer et al., 2008). Elektrische Signale wirken antiinflammatorisch (Odell und Sorgnard, 2008). Im klinischen Gebrauch finden verschiedene Verfahren Anwendung. Besonders etabliert sind induktive Verfahren. Ein Beispiel dafür sind pulsierende elektromagnetische Felder. Desweiteren ist die direkte Stromapplikation mittels implantierter Elektroden möglich. Dieses Verfahren wird teilweise zur Therapie des Morbus Parkinson im Sinne der Tiefenhirnstimulation angewandt (Lozano und Snyder, 2008). Außerdem ist eine perkutane Elektrostimulation mittels Klebeelektroden möglich (Hungerer et al., 2008). Die Behandlung von hmscs mittels biphasischer Elektrostimulation erhöht deren Zellproliferationsrate sowie die osteogene Differenzierung (Kim et al., 2009). 1.6.7 Magnettherapie Magnetische Energie wurde bereits 600 v. Chr. zur Wundbehandlung eingesetzt. Während Hippokrates von Kos mittels magnetischer Energie versuchte Blutungen zu stillen, verwendete Plinius der Ältere (23 79 n. Chr.) Magnetpulver bei Verbrennungsverletzungen. Die therapeutische Anwendung elektromagnetischer Verfahren nahm in den letzten Jahrzehnten unserer Zeit bedeutend zu (Mur und Quittan, 2005). Der Begriff Magnetismus beschreibt die Eigenschaft verschiedener Substanzen, weiches Eisen anzuziehen. Entsteht eine solche Anziehungskraft, bilden sich um ein bewegtes magnetisches Feld elektrische Ströme. Ebenso ensteht ein Magnetfeld um 19

stromdurchflossene Leitmaterialien. Aus diesen Gründen können Magnetismus und Elektrizität nur schwierig isoliert voneinander betrachtet werden. Die elektromagnetische Theorie handelt von Vektorfeldern (Henke, 2007). Die Art der punktuellen Ausbreitung magnetischer und elektrischer Felder wird durch die Maxwell sche Theorie (Maxwell, J. C.; 1831 1879) beschrieben, welche als bahnbrechend bezeichnet wird (Thuile, 2005). Zahlreiche Studien beschäftigen sich mit dem Zusammenhang pathobiologischer Veränderungen durch die Auswirkungen extrem niederfrequenter elektromagnetischer Felder. Die Einflüsse auf den menschlichen Organismus werden in der Literatur kontrovers diskutiert. Eine Studie an kortikalen Neuronen der Ratte ergab eine Verbesserung der Zellviabilität und eine geringere Apoptoserate der expositionierten Zellen (Loreto di et al., 2008). Eine weitere Studie berichtet von der erhöhten endogenen Produktion freier Radikale durch die Exposition mit ELF-MF (Falone et al., 2008). Extrem niederfrequente elektromagnetische Felder verändern die DNS durch die erhöhte Anzahl freier Radikale und deren mutagenen Wirkung. Durch diese erhöhte Inzidenz von DNS-Veränderungen werden Tumorbildungsprozesse begünstigt (Simkó und Mattsson, 2004). 1.6.8 Elektromagnetische Felder Bereits in den 70er Jahren wurden pulsierende elektromagnetische Felder (PEMF) zur Frakturheilung eingsetzt (Basset et al., 1974). Frakturen, Frakturheilungsstörungen und rheumatische Erkrankungen stellen Indikationen zur PEMF-Therapie dar (Mur und Quittan, 2005). Die Histogenese wird stark durch äußere Kräfte beeinflusst. Humane Osteoblasten steigern ihre osteogene Differenzierung und ihre Proliferationsrate durch die Anwendung magnetischer Felder (Yuge et al., 2003; Icaro et al., 2006). Die Knochenmatrix wird stärker kalzifiziert (Icaro et al., 2006). Osteoblasten reagieren sensibel auf statische elektromagnetische Felder, indem sie mehr Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2) und Kollagen Typ-1 produzieren (Qiu et al., 2007). Magnetfeldtherapie kann die Knochenheilung positiv beeinflussen, indem die Knochenmatrix verstärkt aufgebaut und die Osteogenese erhöht wird (Singh et al., 2006). In Untersuchungen an humanen mesenchymalen Stammzellen konnte ebenfalls eine osteogene Differenzierung unter magnetfeldtherapeutischem Einfluss 20

nachgewiesen werden (Schwartz et al., 2008). Magnetfeldtherapie scheint während der Frakturheilungsphase des Remodellings nur einen schwachen Effekt zu bewirken (Kesemenli et al., 2003). Dennoch scheint PEMF eine vielversprechende Behandlungsmethode zu sein, um die Knochenheilung zu beschleunigen. Die Ossifikationsrate kann durch den Einsatz elektromagnetischer Felder gesteigert werden (Grana et al., 2008). 1.6.9 Pulsierende Signaltherapie Die pulsierende Signaltherapie (PST) ist ein Subtyp der Therapie mit pulsierenden elektromagnetischen Feldern. PST stellt ein nicht-invasives, physikalisches Therapieverfahren dar, welches sich auf die Behandlung von leichten und mittelgeradigen Arthrosen spezialisiert hat (Krüger et al., 2003). Die pulsierende Signaltherapie unterscheidet sich von der klassischen pulsierenden elektromagnetischen Therapie dadurch, dass rechteckige Impulse von unterschiedlicher Flussdichte und Frequenz auf das Gewebe einwirken (Fioravanti et al., 2002). Osteoarthritische Chondrozyten sind stoffwechselaktiv. Sie produzieren überdurchschnittlich viel Kollagen-Typ 2 (Grimmer et al., 2006). Die Kollagenbiosynthese osteoarthrotischer Chondrozyten wird durch den Einsatz der pulsierenden Signaltherapie gedrosselt (Krüger et al., 2003). PST bewirkt Erhöhungen in der Transkriptionsrate und Proteinbiosynthese humaner Chondro-zyten (Fioravanti et al., 2002). 1.6.10 Stoßwellentherapie Die extrakorporale Stoßwellentherapie ist ursprünglich eine Therapieform aus der Urologie. Seit 1980 wurde die ESWT als extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL) zur Zertrümmerung von Nieren- und Harnleitersteinen angewandt (Chaussy et al., 1980). Stoßwellen werden durch elektromagnetische, piezoelektrische und elektrohydraulische Verfahren erzeugt. Es sind akustische Wellen, welche einen raschen Druckanstieg im Gegensatz zum Umgebungsdruck erzeugen und sich durch hohe Druckamplituden kennzeichnen. Die Stoßwellenfelder werden über die Parameter Energie, Energieflussdichte und Druck charakterisiert. Die extrakorporale Stoßwellentherapie erzeugt Kavitationen im Gewebe und mechanische Kräfte, die sich 21

auf den Organismus auswirken. Dadurch können zerbrechliche Strukturen, z.b. Harnleitersteine, angegriffen und zerstört werden (Wess, 2004). Dieses Therapieverfahren wurde später auch zur Behandlung von Cholezystolithiasis (Sauerbruch und Paumgartner, 1986) verwendet. Durch diese Behandlungserfolge wurden auch die Auswirkungen auf Pankreasgangsteine untersucht. Bei einer 33-jährigen Frau, die an einer chronischen Pankreatitis litt, wurde ein Stein von 8 mm Durchmesser im Ductus pancreaticus festgestellt. Dieser konnte mittels ESWT zerkleinert und anschließend endoskopisch abgetragen werden (Sauerbruch et al., 1987). Seither wurden extrakorporale Stoßwellen zur Therapie unterschiedlicher Pathologien des muskuloskeletalen Systems angewandt (Seil et al., 2006). ESWT kann Kalzifizierungen der Rotatorenmanschette vermindern (Hsu et al., 2008). Es wurden Therapieerfolge in der Behandlung der Epicondylitis erzielt (Staples et al., 2008). ESWL scheint Heilungsprozesse zu initiieren (Bosch et al., 2007). 22

Ziel dieser Dissertation Seit den 1950er Jahren konnte die Stimulation der Knochenheilung durch Ultraschallanwendung belegt werden (Corradi et al., 1953). Es wurde eine zeitliche Verkürzung der Frakturheilung von 30 50% beschrieben und eine frühere Belastungsfähigkeit der Frakturregion geschildert (Klug und Knoch, 1987). In Bezug auf die Frakturheilung wird eine Stimulation der enchondralen Ossifikation vermutet (Yang et al., 1996). Auch die Implantation humaner mesenchymaler Stammzellen (hmscs) bei Knochendefekten kritischer Größe zeigte am Menschen Erfolge (Schildhauer und Köller, 2004). Die isolierte Betrachtung von hmscs und LIPUS wurde bisher nur in geringem Maße untersucht und die molekulare Basis für die therapeutische Anwendung niederenergertischen, gepulsten Ultraschalls ist in großen Teilen noch unverstanden. Das Ziel dieser Dissertation war die Aufarbeitung zweier Fragestellungen: Einerseits stellte sich die Frage, ob und in welchem Umfang LIPUS, ohne den Einsatz osteoinduktiver Medien, die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen beeinflussen kann. Andererseits sollte anhand von hmscs untersucht werden, ob sich die Produktion von IL-6, IL-8, IL-11, sowie des Wachstumsfaktors VEGF und der Alkalischen Phosphatase durch die Stimulation mit LIPUS verändert und ob es einen direkten Zusammenhang mit der osteogenen Differenzierung von hmscs gibt. 23

2 Material und Methoden 2.1 Materialien Tab.: 1 Chemikalien, Lösungen und Reagenzien Substanz AlamarBlue Alizarin Red AttoPhos-Assay kit Calcein-AM Dimethylsulfoxid (DMSO) Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium DMSO) fetales Kälberserum (FCS) Phosphatpuffer (PBS) Propidiumjodid Rinderserumalbumin (BSA) Phosphorsäure (1 M) RPMI1640 Zellkulturmedium StreptAvidin-Biotin-Meerrettich- Peroxidase- Komplex 3,3-5,5 -Tetramethyl-benzidin Hersteller/ Vertrieb Biosource, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Promega, Madison, USA Calbiochem, Schwalbach, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland GIBCO Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland GIBCO Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland 24

Trypsin/ EDTA (0,25% Trypsin; 0,1% EDTA) Türk sche Lösung Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Fluka BioChemika, Taufkirchen, Deutschland Tab. 2: Verbrauchsmaterial Produkt Ultraschallgel 15 ml Falcon-Röhrchen 50 ml Falcon-Röhrchen 75 cm² Zellkulturflaschen 6-Well Zellkulturplatte Dichtstreifen 96-Well-Mikrotiterplatte Citrat-Röhrchen, 9 ml Monovette Eppendorfreaktionsgefäße Kolbenhubpipetten und Spitzen Pipetten, CellStar Hersteller/ Vertrieb Exogen Smith & Nephew, Marl, Deutschland Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland MaxiSorp, Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Deutschland Finntip, Thermo Electron Corporation, Bremen, Deutschland Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Deutschland 25

Tab. 3: Geräte Gerät Hersteller/ Vertrieb Ultraschallgerät SAFHS Model 2A Exogen Smith & Nephew, Marl, Deutschland 96-Well-Mikrotiterplatten Reader, MRX Revelation DYNEX Technologies, Berlin, Deutschland Biofuge-Pico Eppendorf, Hamburg, Deutschland Brutschrank: HERAcell Heraeus/ Thermo Electron Corporation, Hanau, Deutschland Digitalcamera: Camedia C3030 Olympus, Hamburg, Deutschland Digitalcamera: Color View II Soft Imaging System, Münster, Deutschland Digitalcamera: F-View Soft Imaging System, Münster, Deutschland Fluoreszenzreader, FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland Inversionsmikroskop CK2 Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland Knick Digital-pH-Meter 646 Knick, Berlin, Deutschland Labortiefkühltruhe, - 80 C, Modell 6383 GFL, Burgwedel, Deutschland Labortiefkühltruhe, - 20 C, Economic froster Bosch, Stuttgart, Deutschland Makro-Fluoreszenzmikroskop MVX10 Olympus, Hamburg, Deutschland Fluoreszenzmikroskop BX61 Olympus, Hamburg, Deutschland Zentrifuge Megafuge 1.0R Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland Mikroplatten-Photometer (MRX Revelation) DYNEX Technologies, Denkendorf, Deutschland Mikroplatten-Washer AM-60 DYNEX Technologies, Denkendorf, Deutschland Neubauer-Zählkammer Assistent, Karl Hecht KG, Sondheim, Deutschland 26

Pipettierhilfe, Pipetus Akku Sicherheitswerkbank HeraSafe HS15 Schüttler IKA KS 260 basic Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Deutschland Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland IKA Werke, Staufen, Deutschland Tab. 4: Rekombinante Zytokine Zytokin IL-6 IL-8 IL-11 VEGF Hersteller/ Vertrieb R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland Tab.: 5 Anti-Zytokin-Antikörper Antikörper Konzentration Hersteller/ Vertrieb Maus-α-human IL-6 (monoclonal, capture) Ziege-α-human IL-6 (biotinyliert, polyclonal) detection) Maus-α-human IL-8 (monoclonal, capture) Ziege-α-human IL-8 (biotinyliert, polyclonal, detection) Mouse-α-human IL-11 (monoclonal, capture) 4 µg/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 25 ng/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 4 µg/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 25 ng/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 4 µg/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 27

Ziege-α-human IL-11 (biotinyliert, polyclonal, detection) Maus-α-human VEGF (monoclonal, capture) Ziege-α-human VEGF (biotinyliert, polyclonal, detection) 100 ng/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 6 µg/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland 25 ng/ ml R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland Tab. 6: Zellen Mesenchymale Stammzellen humane mesenchymale Stammzellen Hersteller/ Vertrieb Lonza, Verviers, Belgien 28

2.2 Zellbiologische Methoden 2.2.1 Zellkultur 2.2.1.1 Isolation und Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen Für alle Versuche werden aus dem Aspirat humane mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks verwendet und kommerziell von der Firma Lonza bezogen. Das werden während der operativen Eingriffe bei Spongiosaplastiken steril mit heparinisierten Monovetten entnommen und sofort aufgearbeitet. Die Zellaufarbeitung wurde wie in Abb. 1 schematisch dargestellt durchgeführt. Für die Zellaufarbeitung unter sterilen Bedingungen wurden zunächst 25 ml Histopaque 1077 in ein 50 ml Falcon-Röhrchen pipettiert. Daraufhin wurde das 1:1 mit 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnte Aspirat vorsichtig auf das Histopaque 1077 geschichtet und anschließend durch Zentrifugation bei 1800 UpM für 30 min ohne Bremse bei Raumtemperatur aufgetrennt. Nach der Zentrifugation befindet sich die Fraktion der mononukleären Zellen in der Plasma/Histopaque- Grenzfläche. Diese Zellfraktion wird abgesaugt und in 40 ml RPMI1640- Zellkulturmedium (10% FCS, 4 mm Glutamin) expandiert. Nach einer zwei- bis dreitägigen Inkubation wird das Medium ausgetauscht, um nichtadhärente Zellen zu entfernen. Danach werden die Zellen einmal wöchentlich mit frischem Zellkulturmedium versorgt. passagiert. Dazu wird unter sterilen Bedingungen das Zellkulturmedium ent- Knochenmarksaspirationsblut Histopaque 1077 1800 UpM Blutplasma mononukleäre Zellen Histopaque 1077 Granulozyten Erythrozyten Abb. 1: mononukleäre Zellen werden aus Knochenmarksaspirat durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Sobald die Zellkulturflasche subkonfluent bewachsen ist, werden die hmscs 29

fernt, der Zellrasen zweimal mit 10 ml PBS gewaschen und 6 ml Trypsin/EDTA zugegeben. Die Zellkulturflaschen werden im Anschluss 5 min im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 inkubiert. Die abgelösten Zellen werden nach der Inkubationszeit in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt und die enzymatische Reaktion durch Zugabe von RPMI1640/10%FCS gestoppt. Danach folgt die erste Zentrifugation von 5 Min bei 252 x g und 24 C. Der Überstand wird dekantiert und das Zellpellet resuspendiert. Nach Zugabe von 10 ml RPMI1640/10%FCS werden die Zellen erneut für 5 min bei 252 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Nach erneuter Resuspendierung werden die Zellen gleichmäßig auf zwei Zellkulturflaschen mit jeweils 15 ml RPMI/10%FCS aufgefüllt, aufgeteilt und die Inkubation unter Zellkulturbedingungen fortgesetzt. Für alle Versuche werden hmscs der Passage 1 bis 5 verwendet. 2.2.1.2 Passagieren von humanen mesenchymalen Stammzellen Sobald die Zellkulturflasche konfluent bewachsen sind, wird der Zellkulturüberstand abgenommen und der Zellrasen zweimal mit jeweils 10 ml PBS gewaschen. Somit können Reste des FCS entfernt werden, die das Enzym Trypsin inaktivieren würden. Nach der Zugabe von 6 ml Trypsin/EDTA und einer Inkubationszeit von 5 min im Brutschrank werden die Zellen durch leichtes Abklopfen von der Bodenfläche der Zellkulturflasche abgelöst. Anschließend wirde die resuspendierte Zellsuspension in ein 15 ml Falcon-Tube überführt und mit RPMI1640/10%FCS im Verhältnis 1:8 auf ein Volumen von 15 ml verdünnt. Nach der darauf folgenden fünfminütigen Zentrifugation bei 252 x g, die bei der verwendeten Zentrifuge 1100 UpM entspricht, wird der Überstand dekantiert und das Pellet erneut resuspendiert. Nach Zugabe von 10 ml RPMI1640/10%FCS werden die Zellen wiederholt für 5 min bei 1100 UpM unter Raumtemperatur zentrifugiert, wiederum der Überstand verworfen und das Pellet resuspendiert. Im Anschluss werden die Zellen auf sterile Zellkulturflaschen aufgeteilt. Nach der Zugabe von einer entsprechenden Menge Zellkulturmedium (15 ml pro 75 cm² Zellkulturflasche) wird die Inkubation im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 fortgesetzt. 30

2.2.1.3 Einfrieren von hmscs Die Zellen werden wie in Kapitel 2.2.1.2 beschrieben vom Boden der Zellkulturflasche gelöst und gewaschen. Anschließend wird das resuspendierte Zellpellet in 1 ml Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium DMSO, Invitrogen, Karlsruhe) aufgenommen. Die Zellen werden dann in ein thermostabiles 2 ml Kryogefäß (Nalgene/Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland) überführt und über 3 h auf -80 C heruntergekühlt. Die Lagerung erfolgt anschließend in Flüssigstickstoff bei -196 C. 2.2.1.4 Auftauen von hmscs Das thermostabile Kryogefäß wird im Wasserbad bei 37 C schnell erwärmt und vor dem vollständigen Auftauen entnommen. Es wird mit 70%igem Ethanol gereinigt und unter sterilen Bedingungen in ein 15 ml Falcon Tube überführt. Nach der Zugabe von 10 ml RPMI1640/10%FCS wird die Zellsuspension 5 min bei 1100 UpM und 24 C zentrifugiert. Die hmscs werden nach Dekantierung des Überstandes in 15 ml RPMI1640/10%FCS gelöst. Es folgt die Kultivierung im Brutschrank in einer 75 cm 2 Zellkulturflasche. 2.2.1.5 Zellaussaat, Bestimmung der Zellzahl und Zellkultivierung Die hmscs werden unter einer Sterilbank, wie in Kapitel 2.2.1.1 beschrieben, aus der Zellkulturflasche abgelöst und gewaschen. Das Zellpellet wird aufgeklopft und in 1 ml RPMI1640/10%FCS verdünnt. 10 µl der Zellsuspension werden in 190 µl Türk sche Lösung aufgenommen. Davon werden 7,5 µl zur lichtmikroskopischen Zellzahlbestimmung in eine Neubauer-Zählkammer (Assistent, Karl Hecht KG, Sondheim, Deutschland) gefüllt. Die Zellen werden anschließend in der gewünschten Menge RPMI1640/10%FCS verdünnt und in 5 ml Portionen mittels Pipette auf die 6-Loch-Platten verteilt. Vor Versuchsbeginn werden die 6-Loch-Platten für 24 h unter Zellkulturbedingungen inkubiert, damit die hmscs adhärieren können. Nach Erreichen eines subkonfluenten Zellra- 31

sens wird ein Mediumwechsel durchgeführt und mit der Ultraschallanwendung begonnen. 2.3 Ultraschall-Versuchsapparatur 2.3.1 Das Ultraschallgerät Bei dem verwendeten Ultraschallgerät handelt es sich um das Fabrikat SAFHS (Sonic accelerated fracture healing system) Modell 2A (Abb. 2-A/B) der Firma EXOGEN TM Smith & Nephew. Tab.: 7 technische Daten Gerät Energie Zentraleinheit 220 V Ultraschallfrequenz 1,5 MHz Signaldauer 200 µs Schallintensität 30 mw/ cm² Repititionsrate 1 khz 2.3.2 Versuchsaufbau Die Zentraleinheit (Abb. 2-A 1 ) ist über Kabel mit den Ultraschallköpfen verbunden (Abb. 2-A 4 ) und steuert die Beschallungszeit. Mit einem Kontrollgerät (Abb. 2-A 2 ), das die Schallaussendung erkennt, wird die sachgerechte Applikation des Ultraschalls zu Beginn der Versuche überprüft. Das Ultraschallsignal ist niederenergetisch, gepulst und von der Intensität des diagnostischen Ultraschalls. Die Ultraschallköpfe sind so auf der Platte befestigt, dass jeweils 1 Schallkopf in der Mitte eines Wells der 6-Loch-Platte positioniert ist (Abb. 2-B). Zur Übertragung des Ultraschalls auf die 6-Loch-Platte per Ultraschallgel (Exogen Smith & Nephew, Marl, Deutschland) an die Schallköpfe angekoppelt. Die Beschallungen der 6-Loch-Platten finden bei 37 C und 5% CO 2 im Brutschrank statt. 32

Abb. 2-A/B: Versuchsaufbau: Zentraleinheit (A 1 ), Kontrollgerät zur Schallaussendung (A 2 ), befüllte 6-Loch-Platte (A 3 ), sechsköpfige Ultraschallapplikationsplatte (A 4 ). Die Abbildungen zeigen den Versuchsaufbau der zu beschallenden 6-Loch-Platten. Die Versuchselemente A 3 und A 4 befanden sich während des Experimentes im Brutschrank. 2.4 Stimulation der Zellkulturen 2.4.1 Ultraschallbehandlung der Monolayer-Kulturen Für die Versuche werden hmscs der 2.-6. Passage verwendet. Bei den durchgeführten Versuchen werden jeweils eine 6-Loch-Platte unter Zellkulturbedingungen beschallt und eine weitere dient der Kontrolle. Diese Kontrollplatte wird ebenfalls im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 gelagert. Die hmscs werden für 5 Tage in Folge für 3 min, 6 min und 20 min beschallt. Anschließend inkubieren die 6-Loch-Platten 48 h. Am 7. Tag erfolgt die Abnahme des Zellkulturmediums. Tab.: 8 Versuchsmodelle Modell min/ Tag Tage in Folge Ruhezeit in Std. Abnahme/ Färbung A 3 x 3 5 48 nach 7 Tagen B 3 x 6 5 48 nach 7 Tagen C 3 x 20 5 48 nach 7 Tagen 33

2.4.2 Zellkulturmedium der Monolayer-Kulturen Das Zellkulturmedium der Monolayer-Kulturen wird ebenfalls untersucht. Aus jedem Well wurden 1000 µl in Eppendorfreaktionsgefäße (Greiner, bio-one GmbH, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert und für 2 min bei 6000 UpM und Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge (Biofuge-Pico, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Danach wird der Inhalt erneut in Eppendorfreaktiongefäße dekantiert, damit Zellen und Zelldebris die späteren ELISA- Messungen nicht beeinflussen. Die Proben werden anschließend bei -20 C eingefroren. 2.5 Dreidimensionale Kultur im Fibrinclot 2.5.1 Herstellung von Fibrinclots Die Fibrinclots werden wie in 2.5.1 schematisch dargestellt produziert. Für die Herstellung der Fibrinclots werden Citratblut, Calciumchlorid (10%ig), RPMI und hmscs einer subkonfluent bewachsenen Zellkulturflasche (75 cm 2 ) benötigt. Das Citratblut wird durch eine periphere Venenpunktion von freiwilligen, gesunden Spendern in jeweils vier Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) entnommen und anschließend 45 min bei 1800 UpM unter Raumtemperatur zentrifugiert (Abb.3-A). Die hmscs werden wie in Kapitel 2.2.1.2 beschrieben abgelöst. Das resuspendierte Zellpellet wird in ein definiertes Volumen RPMI1640 aufgenommen (Abb.3-B). Anschließend werden pro Fibrinclot auf 1,5 ml Blutplasma 1,5 ml Zell-RPMI-Suspension gegeben (Abb.3-C). Nach der Zugabe von 75 µl CaCl 2 (10%ig) pro 3 ml Plasma-RPMI-Zellsuspension (Abb.3- D), wird die Suspension in die Kavitäten einer 6-Loch-Platte pipettiert. Es dauert circa 20 min bis der Fibrinclot unter Zellkulturbedingungen koaguliert. Nachdem der Fibrinclot geronnen ist, werden 5 ml RPMI1640/10%FCS als Nährmedium auf jedes Well gegeben (Abb.3-E). 34

Abb.3: Herstellung von Fibrinclots. Blutplasmagewinnung durch Zentrifugation (A), Abnahme des Plasma in Tube (A), Vermischung des resuspendierten Zellpellet mit RPMI (B), Zusammenfügung von Produkt B und Plasma im Verhältnis 1:1 (C), Hinzufügen von CaCl 2 zur Gerinnungsaktivierung (D), Versorgung des fertigen Fibrinclots mit Zellkulturmedium (E). 2.5.2 Ultraschallbehandlung der Fibrinclots Die hergestellten Fibrinclots werden mit jeweils 5 ml Zellkulturmedium bedeckt und anschließend nd inkubiert. Am nächsten Tag wird zunächst ein Mediumdurchgeführt, um avitale Zellen und Zellfragmente zu entfernen. Es folgt die Behandlungsreihe mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall. Die wechsel 6-Loch-Platten werden auf die speziell angefertigte Ultraschallapplikationsplat- te, versehen mit Kontaktgel, aufgesetzt und dreimal täglich für jeweils 6 min beschallt. Zwischen den Ultraschallbehandlungen liegen jeweils 60 min. 2.5.3 Zellkulturmedium der Fibrinclots Mit dem Zellkulturmedium der dreidimensionalen Kulturen wird ebenso wie in Kap. 2.4.2 beschrieben verfahren. 35

2.6 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 2.6.1 Prinzip der Sandwich-ELISA Technik Das ELISA-Verfahren ist ein immunologisches Nachweisverfahren. Es können kleinste Mengen von Proteinen, Hormonen oder Viren mittels ELISA-Technik nachgewiesen werden. Spezifische Antikörper (Erst-, bzw. capture- und Zweit-, bzw. detection-antikörper) besitzen die Eigenschaft, an Epitope der Zielproteine zu binden. Zunächst bindet der immobilisierte monoklonale capture-antikörper das Zielprotein (Abb.4-A). Nachdem die anderen Proteine der Probe entfernt und unspezifische Bindungen blockiert wurden, bindet der polyklonale biotinylierte detection-antikörper an ein anderes Epitop desselben Proteins (Abb.4-B). Das Biotin stellt die Bindungsstelle für die StreptAvidin konjugierten Meerrettichperoxidasen dar. Es entsteht der Biotin-Meerrettich-Peroxidase- Komplex (Abb.4-E). Das blaue Produkt entsteht durch die Katalysierung des farblosen Substrates (Abb.4-F). Je mehr Zielprotein für die Protease vorhanden ist, desto intensiver wird die Färbung. Die Reaktion ist beweisend für das Vorhandensein des gesuchten Antigens. Die Reaktionen werden durch Phosphorsäure gestoppt. Basierend auf einer colorimetrischen Reaktion werden die Ergebnisse anhand einer Eich-Protein-Kurve ausgewertet. 2.6.2 Durchführung des Sandwich-ELISAs Mit Ausnahme des Blocking Puffers, von welchem 200 µl pro Kavität verwendet werden, werden jeweils 100 µl pro Well pipettiert. Um ein Antigen in einer Probe zu detektieren, wird eine 96-Well-Mikrotiterplatte (MaxiSorp TM, Nunc Roskilde, Dänemark) mit einem für dieses Antigen spezifischen capture-antikörper beschichtet (Abb.4-A). Der capture-antikörper wird entsprechend mit PBS verdünnt. Die beschichteten Platten werden mit Folie verschlossen und über 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag werden die Platten dreimal mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% Tween) gewaschen (AM-60 Platten Wascher, DYNEX Technologies, Denkendorf, Deutschland). Um eine unspezifische Bindung des zu untersuchenden Antigens an die Kunststofffläche der 96-Well- Mikrotiterplatte möglichst gering zu halten, erfolgt ein Blockierungsschritt mittels 36

Blocking-Puffer (PBS mit 1% Rinderserumalbumin, BSA, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) bevor die Proben aufgetragen werden (Abb.4-B). Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bei 200 UpM mittels Schüttler (IKA KS 260 basic, IKA Werke, Staufen, Deutschland) wird der Blocking-Puffer mittels dreimaligem Waschen entfernt und es folgt die Plattenbelegung mit Standards und Proben und anschließender Inkubation für 1 1/4 h bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 200 UpM (Abb.4-C). Nachdem die überschüssige, nicht gebundene Probenlösung durch dreimaliges Waschen entfernt wird, wird ein biotinylierter, ebenfalls für das Antigen spezifischer Detection-Antikörper aufgetragen (Abb.4-D). Dieser Detection-Antikörper ist über kovalente Bindung mit Biotin markiert. Nach einer Inkubationszeit von 1 1/4 h bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 200 UpM erfolgt ein dreimaliger Waschschritt. Anschließend wird der Streptavidin-Peroxidase-Komplex (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) in die Kavitäten gegeben (Abb.4-E) und 20 min unter Schütteln bei 200 UpM inkubiert. Nach dreimaligen Waschen wird das Substrat (3,3 ; 5,5 -Tetramethylbenzidin, TMB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) in alle Kavitäten pipettiert (Abb.4-F) und unter lichtgeschützten Bedingungen 20 min inkubiert. Die Enzymreaktion wird nach einer definierten Zeit durch Zugabe von Phosphorsäure 1 M (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) gestoppt und es kommt zu einem Farbwechsel von blau nach gelb. Die Farbentwicklung ist dabei proportional zur nachgewiesenen Antigenmenge. Per Fluoreszenzreader (DYNEX Technologies, Berlin, Deutschland) werden die Ergebnisse mit dem Programm MRX Revelation ausgewertet. Durch die Verwendung von Standards in bekannter Konzentration können die untersuchten Antigene quantitativ bestimmt werden. Mittels Sandwich -ELISA Technik werden die Konzentrationen der Zytokine IL-6, IL-8, IL-11 sowie des Wachstumsfaktors VEGF im Zellkulturüberstand der Monolayer-Kulturen und Fibrinclots bestimmt. 37

Abb.4: Schematische Darstellung der Sandwich-ELISA Technik 2.7 Mikroskopie 2.7.1 Lichtmikroskopie mittels Phasenkontrast Die mikroskopische Analyse der Zellen erfolgt mit einem Inversionsmikroskop (CK2, Olympus, Hamburg). Mittels der Phasenkontrasteinstellung werden die Zellen kontrastreich dargestellt. Die unterschiedlichen Lichtbrechungsindizes und die verschiedenen Durchmesser der Zellen sind hier entscheidend. Das Licht breitet sich in Objekten mit inkonstanten Lichtbrechungsindizes unterschiedlich schnell aus. Bei der Durchleuchtung der Zellen mit einer höheren optischen Dichte, also einem höheren Lichtbrechungsindex, ergibt sich dadurch ein Phasenunterschied gegenüber dem Hintergrundlicht. Der entstandene Phasenunterschied wird zur Erzeugung des Phasenkontrasts genutzt. Dabei soll das Auflösungsvermögen des Mikroskops nicht vermindert werden. Deshalb wird die Beleuchtung des Mikroskops nicht verringert. Im Gegensatz dazu wird die Phasenlage des Hintergrundlichts verschoben. Dies funktioniert mittels eines optisch dichten Elements, dem sogenannten Phasenring. Durch diesen Phasenring wird eine Überlagerung von Objektlicht und Hintergrundlicht erzeugt. Das Objektlicht wird reduziert und das Objekt erscheint vor hellem Hintergrund dunkel. 38

2.7.2 Fluoreszenzmikroskopie Abb.5-A/B: Fluoreszenzmikroskope. Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen erfolgen mit dem Makro- Fluoreszenzmikroskop MVX10 (Olympus, Hamburg, Deutschland) und dem Fluoreszenzmikroskop BX61 (Olympus). Das BX61-Mikroskop ist mit der Farbkamera Color view, das MVX10-Mikroskop mit der schwarz-weiß-kamera Fview ausgerüstet. Die Fluoreszenz wird durch spezifische Wellenlängen des einfallenden Lichts angeregt. Die Auswertung erfolgt mittels digitaler Bildanalyse unter Verwendung der Software Cell-P (Soft Imaging System, Münster, Deutschland). 2.8 Färbemethoden 2.8.1 Calcein-Propidiumjodid-Färbung Die Quantifizierung vitaler und avitaler Zellen erfolgt durch die fluoreszenzbasierte Calcein-Propidiumjodid-Färbung. Sie erlaubt den Nachweis der Zellvitalität sowie die Beurteilung des Proliferationsverhaltens und der Zelladhärenz. Das nicht fluoreszierende Calcein-AM (Calcein-acetoxymethyl Ester, C 46 H 46 N 2 O 23 ; Molekulargewicht = 994,9 g/mol), Calbiochem, Schwalbach, Deutschland) ist aufgrund seines Amoxymethylanteils fähig, Zellwände zu durchdringen (Abb. 6). Im Zytoplasma wird Calcein-AM durch eine intrazelluläre Esterase zu fluoreszierendem Calcein umgewandelt, das impermeabel ist und 39

die Zelle nicht mehr verlassen kann. Somit können vitale Zellen durch eine Anreicherung des grünen Fluoreszenzfarbstoffes fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden (Excitation: 494 nm; Emission: 517 nm). extrazellulär intrazellulär fluoreszierendes Calcein Abb. 6: Das Prinzip der Calcein-Färbung: Das nicht fluoreszierende Calcein-AM dringt durch die Zellmembran in den Intrazellulärraum ein und wird dort mittels intrazellulärer Esterasen zum fluoreszierenden Calcein hydrolysiert. Propidiumjodid (3,8-Diamino-5-(3-diethylaminopropyl)-6-phenylphenanthridiniumjodidmeththiodid; C 27 H 34 I 2 N 4 ; Molekulargewicht: 668,39 g/mol), Sigma- Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) kann nur in avitale Zellen eindringen. Der Farbstoff diffundiert in den Zellkern, interchaliert in Nukleinsäuren und fluoresziert dann rot. Durch die farblich unterschiedliche Markierung der Zellen, können vitale und avitale Zellen voneinander unterschieden werden (Excitation: 530 nm; Emission: 620 nm). 2.8.2 Calcein-Propidiumjodid-Färbung der Fibrinclots Es wird 1 mg Calcein-AM in 100 µl Dimethyl-Sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und 1100 µl FCS aufgenommen, in 40 µl Portionen aliquotiert und bei -80 C eingefroren. Die Oberfläche der Fibrinclots wird zweimal mit RPMI1640 (50 µg/ml) gewaschen. Anschließend wird jeweils 1 ml der Calceinlösung (14 µg/ml), 1:50 verdünnt mit RPMI1640 in die einzelnen Kavitäten der 6-Loch-Platte gegeben. Es folgt eine 30 min Inkubation im Brutschrank. Danach wird der Überstand entnommen und die Oberfläche des Fibrinclots 40

zweimal mit RPMI1640 1640 gewaschen. Zur Darstellung Darstellung der avitalen Zellen folgt das Auftragen von jeweils 1 ml Propidiumjodid, gelöst in RPMI1640 RPMI (50 µg/ml). Das Propidiumjodid wird 15 min unter lichtgeschützten Bedingungen und bei Raumtemperatur belassen und anschließend durch zweimaliges Waschen mit RPMI1640 640 entfernt. Die Fibrinclots werden werden zur mikroskopischen Beurteilung mit RPMI1640 1640 benetzt, um Austrocknung zu vermeiden. Nach vollständigem AbA saugen en des Mediums werden we die Fibrinclots zweimal mit RPMI1640 RPMI gewaschen und anschließend mit Calcein-AM Calcein (1 µm) 30 min unter Zellkulturbedingungen lichtgeschützt im Brutschrank inkubiert. Danach werden rden die Wells dreimal dr mit jeweils 2 ml RPMI1640 1640 gewaschen. Im nächsten Schritt werden rden die Fibrinclots 15 min mit 600 µl Propidiumjodid (50 µg/ml) pro Well benetzt, danach lichtgelichtg schützt bei Raumtemperatur inkubiert und wiederholt dreimal mit RPMI1640 gewaschen. Die Fluoreszenzmikroskopie erfolgt direkt im Anschluss unter lichtgeschützten Bedingungen. 2.8.3 Calcein-Propidiumjodid Propidiumjodid-Färbung der Monolayer-Kulturen Kulturen Die Calcein-Propidiumjodid Propidiumjodid-Färbung wird wie in Kapitel 2.8.2 beschrieben auch bei den Monolayer-Kulturen Kulturen vollzogen. vollzogen. Die fluoreszenzmikroskopische AuswerAuswe tung wurden im direkten Anschluss durchgeführt. 2.8.4 Alizarin-Rot-Färbung Färbung Abb. 7:: Die Abbildungen zeigen alizarinpositive bone-nodules nodules kalzifizierter hmscs. 41

Durch die Einfärbung kalziumreicher Matrix mit Alizarin ist die osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen nachweisbar. Die Zellen verändern sich phänotypisch. Diese Veränderung kann histochemisch nachgewiesen werden. Die stattgefundende Differenzierung ist mikroskopisch durch das Vor- handensein von Bone-Nodules sichtbar. Diese sind knotige Strukturen, welche kalziumreiche Matrix enthalten (Abb. 7). 2.8.5 Alizarin-Färbung der Monolayer-Kulturen Mittels Alizarin-Rot-Färbung kann die kalziumreiche Matrix der hmscs dargeder Kalziumgehalt in der stellt werden. Je stärker die Anfärbung, desto höher Matrix. Um die Färbung durchführen zu können wird zunächst das Zellkultur- medium abgenommen. Danach werden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgt eine 30 min Fixierung der Zellen mit 10%igem Paraformgegeben. Nach 30 min folgt aldehyd, gelöst in PBS. In jedes Well werden 1,5 ml eine dreimalige Waschung der Zellen mit Aquadest. Im nächsten Schritt werden die Zellen mit 1%igem Alizarin (in 2% Ethanol gelöst) gefärbt. Zu jedem Well wird 1 ml Färbelösung gegeben. Anschließend findet eine 5 min Inkubation bei Raumtemperatur statt. Danach werden die Zellen vorsichtig unter fließendem Leitungswasser abgespült. Nach Lufttrocknung können die Zellen unter einem Durchlichtmikroskop im Phasenkontrast fotografiert werden. Anhand der durch- geführten Phasenanalyse erfolgt eine prozentuale Quantifizierung der rot ge- färbten Zellbereiche. Von jedem Well werden 5 Fotos angefertigt und die jewei- ligen Werte gemittelt. Die 5 Ausschnitte werden bei den Kavitäten auf die gleiche Art und Weise standardisiert ausgewählt (Abb. 8). Abb. 8: Schematische Darstellung der Auswahl der Bildausschnitte. 42

2.8.5.1 Phasenanalyse der Alizarin-Rot gefärbten Zellen Die quantitative Analyse der kalzifizierten Matrix der hmscs wird im Anschluss an die Alizarin-Rot-Färbung mit Hilfe der Funktion Phasenanalyse des Programms Cell P (Olympus, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. 2.8.6 AlamarBlue-Assay Die AlamarBlue-Färbung dient der Analyse des Proliferationverhaltens und der Viabilität der Zellen. Die metabolische Aktivität der Zellen wird indirekt anhand einer colorimetrischen bzw. fluorimetrischen Reaktion quantifiziert. Durch Redoxreaktionen ändern sich Farbe und Fluoreszenzvermögen des Farbstoffes, der reduziert wird (Abb. 9). Das Fluoreszenzsignal ändert sich entsprechend der zellulären Stoffwechsellage. Je aktiver die Zellen, desto höher der farbliche Umsatz. Der oxidierte, nicht fluoreszierende, blaue Farbstoff wird dann zu rotem, fluorogenem Farbstoff reduziert (Excitation: 560 nm; Emission: 590 nm). 2.8.6.1 AlamarBlue-Assay der Monolayer-Kultur Die hmscs werden in Monolayer-Kultur in 6-Loch-Platten kulitiviert. Der Überstand wird abgenommen und der Zellrasen zweimal mit RPMI1640 gewaschen. Anschließend werden 100 µl AlamarBlue (Biosource/Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland), gelöst in 1000 µl RPMI1640, pro Kavität aufgetragen. Die 6- Loch-Platten werden dann 3 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgt die Messung des Substrats im Fluoreszenzreader (FLUOstar Optima, BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland). 43

Abb. 9: Die Fotografie zeigt eine 24-Loch-Platte mit 12 befüllten Kavitäten. Durch unterschiedlich hohe Stoffwechselleistungen der aufgetragenen Zellen, verfärbt sich das Substrat rot. 2.8.6.2 AlamarBlue-Assay der Fibrinclots Die hmscs werden in Fibrinclots wie in Kapitel 2.5.1 beschrieben kultiviert. Die Fibrinclots sind mit 5 ml Zellkulturmedium bedeckt. In die jeweiligen 5 ml Zellkulturmedium, werden jeweils 1000 µl AlamarBlue-Lösung gegeben. Danach werden die Fibrinclots 2,5 h unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Danach erfolgt die quantitative Analyse des Substrats im Fluoreszenzreader (FLUOstar Optima, BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland). Diese Analyse wirde nach 5 h wiederholt. 2.8.7 Atto-Phos-Assay Die Atto-Phos-Färbung dient dem Aktivitätsnachweis der alkalischen Phosphatase. Die alkalische Phosphatase hydrolysiert Phosphorsäureesther. Das Substrat BBTP (2 -[2-benzothiazoyl]-6 -hydroxybenzothiazol Phosphat;) wird zu anorganischem Phosphat und BBT (2 [-2-benzothiazoyl]-6 -hydroxybezothiazol hydrolysiert. BBT fluoresziert und wird mittels Fluoreszenzreader (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Deutschland) bei einer Excitation von 440 nm und einer Emission von 575 nm detektiert. Die Produktquantität verhält sich direkt proportional zur Enzymaktivität. 44

2.8.7.1 Atto-Phos-Assay der Monolayer-Kulturen Die Monolayer-Kulturen werden nach Erreichen eines subkonfluenten Zellrasens beschallt. Die Ultraschallbehandlung findet dreimal pro Tag für jeweils 6 min statt. Nachdem die Monolayer-Kulturen mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall behandelt und die Zellkulturmedien zur Interleukin- und Wachstumsfaktoranalyse abpipettiert werden, kann die AttoPhos-Färbung durchgeführt werden. Dazu werden jeweils 2000 µl AttoPhos-Substrat in die jeweiligen Kavitäten gefüllt. Die 6-Loch-Platten werden anschließend im Brutschrank bei 37 C und 5%igem CO 2 -Gehalt lichtgeschützt inkubiert. Die Ergebnisse werden nach 2,5 h per Fluoreszenzreader (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Deutschland) ausgewertet. 2.8.7.2 AttoPhos-Assay der Fibrinclots Die mit hmscs bestückten Fibrinclots werden 5 Tage mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall behandelt. Die Behandlungsdauer beträgt dreimal 6 min pro Tag. Danach wird das Zellkulturmedium abpipettiert, bei 6000 UpM für 2 min in einer Mikrozentrifuge (Biofuge-Pico, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert und bei -20 C eingefroren. Anschließend werden 2000 µl Atto-Phos-Substrat pro Well in die Kavitäten gefüllt. Nach 5 min Inkubationszeit wird das Reaktionsprodukt quantitativ mittels Fluoreszenzreader (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Deutschland) ermittelt. 2.9 ph-messung des Zellkulturmediums der Monolayer-Kulturen Um mögliche ph-veränderungen des Zellkulturmediums nachzuweisen, werden 60 Proben von insgesamt 5 verschiedenen Spendern untersucht. Es handelt sich um 30 beschallte Proben, welche dreimal täglich für 6 min behandelt werden, und 30 Kontrollproben. Nachdem die Monolayer-Kulturen 5 Tage mit niederenergetischem, gepulstem Ultraschall behandelt und weitere 2 Tage inkubiert werden, wird das Zellkulturmedium abpipettiert. Die Menge der Proben beträgt jeweils 1 ml. Das Zellkulturmedium wird in ein Eppendorfreaktionsgefäß pipettiert und direkt danach per Digital-pH-Meter gemessen. 45

3 Ergebnisse 3.1 Stimulation von Monolayer-Kulturen Um zu vergleichen, ob sich die zellulären und phänotypischen Parameter der Zellen unter Ultraschallbehandlung verändern, wurden die hmscs zunächst in 6-Loch- Platten ausgesät. Die Zellen adhärierten und proliferierten in jedem Versuch komplikationslos (Abb. 10). In den ersten Tagen nach Aussaat befanden sich im Zentrum der Wells mehr Zellen als in den Außenbezirken. Anschließend breiteten sie sich symmetrisch zum Rand hin aus. Die Versuche wurden unter subkonfluenten Bedingungen begonnen. Die Zellkulturen wurden täglich lichtmikroskopisch begutachtet, um den Zustand der Zellen auch vor Versuchsbeginn zu beurteilen. Das Proliferationsverhalten war unbeeinträchtigt. Das Ausmaß an avitalen Zellen war nur bedingt abschätzbar, weil diese Zellen bei den durchgeführten Medienwechseln entfernt wurden. Abb. 10: Die Abbildungen zeigen lichtmikroskopisch fotografierte humane mesenchymale Stammzellen, welche am Boden der Zellkulturflasche adhärieren. 46

3.2 Dreidimensionale Zellkulturen 3.2.1 Die Überlebensfähigkeit von hmscs im Fibrinclot Die hmscs wurden in Fibrinclots eingebettet, um die Gewebesituation für die Zellen zu imitieren. Die Herstellung der mit hmscs besiedelten Fibrinclots wurde wie in Kapitel 2.5.1 beschrieben durchgeführt. Es wurde zunächst getestet, ob die Zellen innerhalb eines Fibrinclots überlebensfähig sind. Das Zellkulturmedium diffundierte durch die fibrinöse Umgebung, sodass die hmscs mit Nährstoffen versorgt wurden. Der Verbrauch des Zellkulturmediums war durch den Farbumschlag sichtbar. Außerdem konnten sich die hmscs im Fibrinclot vermehren. Anhand einer Calcein- Propidiumjodid-Färbung wurde die Vitalität der Zellen nachgewiesen (Abb. 11). Abb. 11: Calcium-Propidiumiodid-Färbung humaner mesenchymaler Stammzellen, welche zuvor 7 Tage in einem Fibrinclot eingebettet kultiviert wurden. 47

3.2.2 Ultraschallstimulation von hmscs im Fibrinclot Um zu testen, ob hmscs die Ultraschallapplikation im Fibrinclot überleben und wie sie sich verhalten, wurden sie in Fibrinclots eingebettet eingebet und ab dem 2. Tag beschallt. Die Zellen erstreckten sich, bereits 2,5 2, Stunden nachdem hdem sie in die Fibrinclots eingeeing bettet wurden, mit pseudopodienartigen Ausläufern und proliferierten in den folgenfolge den Tagen gut in die Umgebung (Abb. ( 12). Abb. 12: Die lichtmikroskopischen Aufnahmen zeigen hmscs einbettet in Fibrinclots. A und C dienten der Kontrolle, B und D wurden beschallt. Das Fibringerüst stellt sich im Gegensatz zu den beschallten Fibrinclots bei den KonKo trollen intakter dar. 48

3.2.2.1 Alizarin-Rot-Färbung der Monolayer-Kulturen Um die osteogene Differenzierung der hmscs nachweisen zu können, wurden die behandelten Zellen und deren Kontrollen einer Alizarin-Rot-Färbung unterzogen. Es wurden von drei zeitlich unterschiedlich behandelten Versuchsmodellen jeweils 30 Aufnahmen erstellt. Die Aufnahmen zeigten alizarinange-reicherte Bezirke, im Sinne heranwachsender Bone-nodules. Teilweise war zu beobachten, dass diese Bereiche das Zentrum einer auf sie zuwachsenden Zellpopulation bildeten, welches ein typisches Zeichen für die Ossifikation von humanen mesenchymalen Stammzellen darstellt (Abb. 13). Abb. 13: Lichtmikroskopische Aufnahmen nach Alizarin-Rot-Färbung von hmscs nach fünftägiger niederenergetischer, gepulster Ultraschallbehandlung. Die hmscs wurden dreimal pro Tag mit Ultraschall behandelt. Kontrolle (A), 3-minütig (B), 6- minütig (C), 20-minütig (D) 49