RIDA GENE Helicobacter pylori PG2305

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1 RIDA GENE Helicobacter pylori PG2305 RBiopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, Darmstadt, Germany Phone: +49 (0) / Fax: +49 (0)

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3 Deutsch RIDA GENE Helicobacter pylori PG Zweckbestimmung Für die invitro Diagnostik. RIDA GENE Helicobacter pylori ist eine multiplex realtime PCR zum direkten qualitativen Nachweis von Helicobacter pylori 1 und einer ClarithromycinResistenz aus humanem nativem Biopsiematerial. Die RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR soll die Diagnose einer durch Helicobacter pylori verursachten Magenerkrankung unterstützen. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Helicobacter pylori ist ein gramnegatives Stäbchenbakterium, welches bei Infektion den menschlichen Magen besiedelt. Durch den von H. pylori ausgelösten Pathomechanismus erhöht sich die Magensäuresekretion und führt dadurch zu verschiedenen Magenerkrankungen, wie zum Beispiel Typ B Gastritis, Magengeschwüre und auch 12Fingerdarmgeschwüre. H. pylori hat weltweit eine Prävalenz von 50 %, wobei die Infektionsrate in Entwicklungsländern höher ist als in Industrieländern. In Deutschland sind ca. 33 Mio. Menschen mit H. pylori infiziert, wovon ungefähr % ein Geschwür entwickeln. Während dem H. pylori Stamm Typ 2 die Pathogenitätsfaktoren cag und das VacA Gen fehlen, führt eine Infektion mit dem H. pylori Stamm Typ 1 vermehrt zu gastroduodenalen Ulkuskrankheiten und erhöht bei einer chronischen Infektion das Risiko von Darmkrebs erheblich. Um sich selbst vor Magensäure zu schützen nistet sich H. pylori in die Magenschleimhautbarriere ein und spaltet Harnstoff durch das Enzym Urease um den phwert der direkten Umgebung des Erregers zu erhöhen. H. pylori wird heutzutage durch Mikroskopie oder den HelicobacterUrease Test aus einer Magenbiopsie nachgewiesen. Weitere Diagnosemöglichkeiten sind Antigenteste oder Atemteste. Nach einer Diagnose von H. pylori sind verschiedene Behandlungsmethoden möglich. Meist wird jedoch die Triple Therapie angewandt, welche aus einer Kombination von Amoxicillin, Clarythromycin und einem Protonenpumpenhemmer oder Metronidazol, Clarythromycin und einem Protonenpumpenhemmer besteht. 2 Ansteigende ClarythromycinResistenzen mindern die Erfolgsrate einer solchen Behandlung um bis zu 30 %. Auch weitere, immer mehr verbreitete Resistenzen gegen Antibiotika wie Metronidazol oder Levofloxacin (Fluoroquinolon) führen zu erhöhtem Misserfolg einer H. pylori Eradikationstherapie. 3 RIDA GENE Helicobacter pylori

4 3. Testprinzip RIDA GENE Helicobacter pylori ist eine multiplex realtime PCR zum direkten qualitativen Nachweis von Helicobacter pylori und einer ClarithromycinResistenz in humanem nativem Biopsiematerial. Nach der DNAIsolierung werden (falls vorhanden) die spezifischen Genfragemente für Helicobacter pylori (16S rrna) und einer vorliegenden ClarithromycinResistenz (23S rrna) amplifiziert. Die amplifizierten Zielsequenzen werden mit Hydrolyse Sonden, die an einem Ende mit dem Quencher und am anderen Ende mit einem ReporterFluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) markiert sind, nachgewiesen. In Gegenwart einer Zielsequenz hybridisieren die Sonden mit den Amplikons. Während der Extension trennt die TaqPolymerase den Reporter vom Quencher. Der Reporter emittiert ein Fluoreszenzsignal, das durch die optische Einheit eines realtime PCRGerätes detektiert wird. Das Fluoreszenzsignal steigt mit der Menge der gebildeten Amplikons an. Der RIDA GENE Helicobacter pylori Test enthält eine Internal Control DNA (ICD), um die Probenpräparation und/oder eine potentielle PCR Inhibition kontrollieren zu können. 4. Packungsinhalt Tab. 1: Packungsinhalt (Die Reagenzien einer Packung reichen für 100 Bestimmungen) Kit Code Reagenz Menge Deckelfarbe 1 Reaction Mix 2x 1050 µl gelb 2 TaqPolymerase 1x 80 µl rot D Internal Control DNA 2x 1700 µl orange N No Template Control 1x 450 µl weiß P Positive Control 1x 200 µl blau 5. Reagenzien und ihre Lagerung Alle Reagenzien müssen lichtgeschützt bei 20 C gelagert werden und können bis zum aufgedruckten Verfallsdatum verwendet werden. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Vor dem Gebrauch sollten die Reagenzien schonend aufgetaut werden (z.b. im Kühlschrank bei 2 8 C). Ein wiederholtes Einfrieren/Auftauen bis zu 20 Mal beeinträchtigt die Testeigenschaft nicht (ggf. Aliquots nach dem ersten Auftauen herstellen und die Reagenzien sofort wieder einfrieren). Alle Reagenzien während der PCRVorbereitung geeignet kühlen (2 8 C) RIDA GENE Helicobacter pylori

5 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör Der RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR Test ist geeignet für die Verwendung mit folgenden Extraktionsplattformen und realtime PCRGeräten: Tab.2: Benötigtes Zubehör Extraktionsplattformen RBiopharm Promega RIDA Xtract Maxwell RSC Roche MagNA Pure 96 Realtime PCRGeräte Roche Agilent Technologies LightCycler 480II Mx3005P Applied Biosystems ABI 7500 BioRad QIAGEN CFX96 RotorGene Q Hinweis: Bei Verwendung des RotorGene Q (QIAGEN) nur 0,1 ml Reaktionsgefäße verwenden Sollten Sie weitere Extraktionsverfahren oder realtime PCR Geräte verwenden wollen, kontaktieren Sie bitte RBiopharm zur Überprüfung der Kompatibilität unter mdx@rbiopharm.de. RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) bei Verwendung des LightCycler 480II Realtime PCR Verbrauchsmaterialien (Platten, Reaktionsgefäße, Folien) Zentrifuge mit Rotor für Reaktionsgefäße oder Platten Vortexer Pipetten (0,5 20 µl, µl, µl) Pipettenspitzen mit Filtern Puderfreie Einmalhandschuhe PCRWasser (BioScienceGrade, Nukleasefrei) RIDA GENE Helicobacter pylori

6 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die invitro Diagnostik. Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Während des Umgangs mit Reagenzien und Proben, persönliche Schutzausrüstung (geeignetes Handschuhmaterial, Kittel, Schutzbrille) tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In Bereichen, in denen mit Proben gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Eine räumliche Trennung von Extraktion, PCRAnsatz und PCR ist zu beachten, um Querkontaminationen zu vermeiden. Klinische Proben müssen als potentiell infektiös angesehen werden und müssen wie sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen entsprechend entsorgt werden. Testkit nach Erreichen des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Alle Reagenzien und Materialien müssen nach Gebrauch sachgerecht und eigenverantwortlich entsorgt werden. Bitte beachten Sie bei der Entsorgung die jeweils national geltenden Vorschriften. Weitere Details siehe Safety Data Sheets (SDS) unter 8. Sammlung und Lagerung der Proben 8.1 DNAPräparation aus Biopsiematerial Für die DNAPräparation aus Biopsat wird ein kommerziell erhältliches DNA Extraktionskit (z.b. RIDA Xtract (RBiopharm)) oder DNAExtraktionssystem (z.b. Maxwell RSC (Promega)) empfohlen. Die Angaben des Herstellers sind zu beachten. Es wird empfohlen das Biopsat vor der Extraktion über Nacht mit Proteinase K zu bei 55 C zu inkubieren. Aus dem Verdau das entsprechende Volumen für die Extraktion nach Angaben des Herstellers verwenden. Der RIDA GENE Helicobacter pylori Test enthält eine Internal Control DNA, die eine mögliche PCRInhibition anzeigt, die Integrität der Reagenzien überprüft und eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion bestätigt. Die Internal Control DNA kann entweder nur als Inhibitionskontrolle oder als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle verwendet werden. Wird die Internal Control DNA nur als Inhibitionskontrolle verwendet, muss 1 µl der Internal Control DNA dem MasterMix hinzugefügt werden (s. Tab. 4). Wird die Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle verwendet, müssen 20 µl der Internal Control DNA während RIDA GENE Helicobacter pylori

7 der Extraktion eingesetzt werden. Die Internal Control DNA soll dem Proben Lysispuffer Mix und nicht direkt dem Probenmaterial zugefügt werden. Wir empfehlen je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Negativkontrolle und der Positivkontrolle zu pipettieren. 9. Testdurchführung 9.1 Herstellung des MasterMix Die Gesamtzahl der für die PCR benötigten Reaktionen (Proben und Kontrollreaktionen) ist zu berechnen. Bei jedem Testlauf muss eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Es wird empfohlen den MasterMix mit 10 % zusätzlichem Volumen anzusetzen, um einen Pipettierverlust auszugleichen (s. Tab.3, Tab.4). Vor der Benutzung den Reaction Mix, die TaqPolymerase, die Positive Control, die No Template Control und die Internal Control DNA auftauen, durchmischen und kurz zentrifugieren. Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen 2 8 C). Tab. 3: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD als Extraktions und Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 1 Reaction Mix 19,3 µl 212,3 µl 2 TaqPolymerase 0,7 µl 7,7 µl Gesamt 20 µl 220 µl MasterMix mischen und anschließend kurz zentrifugieren. 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) Tab. 4: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD nur als Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 1 Reaction Mix 19,3 µl 212,3 µl 2 TaqPolymerase 0,7 µl 7,7 µl D Internal Control DNA 1,0 µl 11 µl Gesamt 21,0 µl 231,0 µl MasterMix mischen und anschließend kurz zentrifugieren 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) RIDA GENE Helicobacter pylori

8 9.2 Herstellung des PCRMix Je 20 µl des MasterMix in die jeweiligen Reaktionsgefäße (Gefäße/Platten) pipettieren. Negativkontrolle: Je 5 µl No Template Control zum vorgelegten Master Mix pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Negativkontrolle zu pipettieren. Proben: Positivkontrolle: Je 5 µl DNAExtrakt zum vorgelegten MasterMix pipettieren. Je 5 µl Positive Control zum vorgelegten MasterMix pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Positivkontrolle zu pipettieren. Reaktionsgefäße bzw. Platte verschließen, mit wenigen Umdrehungen pro Minute kurz zentrifugieren und in das realtime PCRGerät überführen. Die PCR entsprechend der Geräteeinstellung starten (s. Tab. 5, Tab. 6, Tab. 7, Tab. 8) RIDA GENE Helicobacter pylori

9 9.3 Geräteeinstellungen DNA realtime PCRProfil Tab. 5: DNA realtime PCRProfil für LightCycler Serie und RotorGene Q Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Tab. 6: DNA realtime PCRProfil für Mx3005P, ABI 7500, CFX96 Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. RIDA GENE Helicobacter pylori

10 9.3.2 Universal realtime PCRProfil Hinweis: Das Universal realtime PCRProfil für DNA Tests sollte nur verwendet werden, wenn RIDA GENE DNA und RIDA GENE RNA realtime PCR Tests in einem Lauf kombiniert werden. Tab. 7: Universal realtime PCRProfil für LightCycler Serie Reverse Transkription 10 min, 58 C Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Tab. 8: Universal realtime PCRProfil für Mx3005P, ABI 7500, CFX96 und Rotor Gene Q Reverse Transkription 10 min, 58 C Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt RIDA GENE Helicobacter pylori

11 9.4 Detektionskanaleinstellung Tab. 9: Auswahl der geeigneten Detektionskanäle Realtime PCRGerät Nachweis Detektionskanal Bemerkung Roche LightCycler 480II ABI 7500 Agilent Techn. Mx3005P Qiagen RotorGene Q BioRad CFX96 H. pylori 465/510 RIDA GENE Color ICD 533/580 Compensation Kit IV (PG0004) ClarithromycinResistenz 618/660 wird benötigt H. pylori FAM Stellen Sie den ICD VIC passiven Referenzfarbstoff ROX ClarithromycinResistenz Cy5 auf none H. pylori FAM ICD ClarithromycinResistenz HEX Cy5 Stellen Sie den Referenzfarbstoff auf none H. pylori Green Die GainEinstellungen müssen für alle Kanäle ICD Yellow auf 5 ClarithromycinResistenz Red (Werkseinstellung) eingestellt sein H. pylori FAM ICD ClarithromycinResistenz VIC Cy5 RIDA GENE Helicobacter pylori

12 10. Qualitätskontrolle Die Auswertung der Proben erfolgt über die AnalyseSoftware des jeweiligen realtime PCRGerätes nach den Angaben des Herstellers. Negativkontrolle und Positivkontrolle müssen die korrekten Ergebnisse zeigen (s. Tab. 10, Abb. 1, Abb. 2). Die Positive Control liegt in einer Konzentration von 10 3 Kopien/µl vor. Sie wird in einer Gesamtmenge von 5 x 10 3 Kopien in jedem PCRLauf eingesetzt. Tab. 10: Ein valider PCRLauf muss die folgenden Bedingungen erfüllen Probe Ergebnis ICD Ct Zielgen Ct Positivkontrolle Positiv NA * 1 Assurance Siehe Quality Certificate Negativkontrolle Negativ Ct > 20 0 * 1 Ein CtWert für die ICD ist nicht erforderlich um ein positives Ergebnis der Positivkontrolle zu erhalten. Wenn die Positivkontrolle in dem angegebenen CtBereich nicht positiv ist, die Negativkontrolle jedoch valide ist, müssen alle Reaktionen inklusive der Kontrollen neu angesetzt werden. Wenn die Negativkontrolle nicht negativ ist, die Positivkontrolle jedoch valide ist, müssen alle Reaktionen inklusive der Kontrollen neu angesetzt werden. Sollten die vorgegebenen Werte nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung Folgendes zu überprüfen: Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte Korrekte Testdurchführung RIDA GENE Helicobacter pylori

13 Abb. 1: Korrekter Verlauf der Positivkontrolle und Negativkontrolle (Helicobacter pylori) auf dem LightCycler 480II Abb. 2: Korrekter Verlauf der Positivkontrolle und Negativkontrolle (Clarithromycin Resistenz) auf dem LightCycler 480II RIDA GENE Helicobacter pylori

14 11. Interpretation der Ergebnisse Die Probenauswertung der Ergebnisse erfolgt nach Tabelle 11. Tab. 11: Interpretation der Ergebnisse Zielgene Helicobacter pylori Clarithromycin Resistenz ICD Ergebnis positiv negativ positiv/negativ H. pylori nachweisbar positiv positiv* positiv/negativ H. pylori und Clarithromycin Resistenz nachweisbar negativ positiv* positiv/negativ H. pylori nicht nachweisbar negativ negativ positiv Zielgen nicht nachweisbar negativ negativ negativ Ungültig *Hinweis: Die Fluoreszenzhöhe eines richtigpositiven Signals im ClarithromycinResistenz Kanal (Cy5) muss bei Nutzung des LightCycler 480II (Roche) und des CFX96 TM (Biorad) mindestens 20 % des Fluoreszenzsignals der Positivkontrolle betragen und bei Nutzung des Mx3005P (Agilent Technologies), des ABI 7500 (Applied Biosystems) sowie des RotorGene Q (Qiagen) mindestens 10 % des Fluoreszenzsignals der Positivkontrolle. Für eine eindeutigere Auswertung empfehlen wir den Threshold auf diesen Grenzwert (10 % bzw. 20 % des Fluoreszenzsignals der Positivkontrolle) zu legen. Eine Probe wird positiv bewertet, wenn die ProbenDNA und Internal Control DNA eine Amplifikation im Nachweissystem zeigen. Eine Probe wird ebenfalls positiv bewertet, wenn die ProbenDNA eine Amplifikation zeigt, für die Internal Control DNA jedoch keine Amplifikation im Nachweissystem zu sehen ist. Der Nachweis der Internal Control DNA ist in diesem Fall nicht notwendig, da hohe Konzentrationen des Amplikons zu einem schwachen oder fehlenden Signal der Internal Control DNA führen können. Eine Probe wird negativ bewertet, wenn die ProbenDNA keine Amplifikation zeigt, für die Internal Control DNA jedoch eine Amplifikation im Nachweissystem zu sehen ist. Eine Inhibierung der PCRReaktion kann durch die Detektion der Internal Control DNA ausgeschlossen werden. Eine Probe ist ungültig, wenn die ProbenDNA und die Internal Control DNA keine Amplifikation im Nachweissystem zeigen. In der Probe sind PCRInhibitoren RIDA GENE Helicobacter pylori

15 vorhanden bzw. es trat ein Fehler im Extraktionsverfahren auf. Die extrahierte Probe sollte 1:10 mit PCRWasser verdünnt und erneut amplifiziert werden oder es sollte die Isolierung und Reinigung der Probe verbessert werden. 12. Grenzen der Methode 1. Das Ergebnis der molekularbiologischen Untersuchung sollte nicht allein zur Diagnose führen, sondern immer im Zusammenhang mit der Anamnese und Symptomatik des Patienten betrachtet werden. 2. Dieser Test ist nur für Biopsat validiert. 3. Unsachgemäße Probenentnahme, transport, lagerung und handhabung oder eine Erregerlast unterhalb der analytischen Sensitivität des Tests können zu falsch negativen Ergebnissen führen. 4. Die Anwesenheit von PCRInhibitoren kann zu nicht auswertbaren Ergebnissen führen. 5. Mutationen oder Polymorphismen in den Primer oder Sondenbindungsregionen können den Nachweis neuer oder unbekannter Varianten beeinträchtigen und mit RIDA GENE Helicobacter pylori zu falsch negativen Ergebnissen führen. 6. Wie bei allen auf PCR basierenden invitrodiagnostischen Tests können äußerst niedrige Konzentrationen der Zielsequenzen, die unter dem Detektionslimit (LoD) liegen, nachgewiesen werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind nicht immer reproduzierbar. 7. Ein positives Testergebnis zeigt nicht notwendigerweise die Anwesenheit lebensfähiger Organismen an. Ein positives Ergebnis deutet darauf hin, dass die Zielgene (16S rrna, 23S rrna) vorhanden sind. 8. In Einzelfällen kann es zu einem positiven Signal im ClarithromycinKanal kommen, wenn Organismen vorliegen, die ebenfalls das ClarithromycinWildtyp Genom tragen, jedoch kein Helicobacter pylori sind. 9. In Einzelfällen kann es zu einem positiven Signal im H. pylorikanal kommen, wenn Helicobacter felis, jedoch kein H. pylori in der Probe vorliegt (Kreuzreaktivität). RIDA GENE Helicobacter pylori

16 13. Leistungsmerkmale 13.1 Klinische Leistungsmerkmale In einer retrospektiven klinischen Validierungsstudie wurden 225, bzw. 139 klinische Proben mit dem RIDA GENE Helicobacter pylori Test im Vergleich zur Kultur und einer anderen kommerziellen PCRMethode untersucht. Tab. 12: Korrelation der Helicobacter pylori und ClarithromycinResistenz Ergebnisse mit der RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR und der Referenzmethode. Helicobacter pylori: Goldstandard Positiv Negativ Insgesamt RIDA GENE Helicobacter pylori Positiv Sensitivität: 100 % Negativ Spezifität: 98 % Insgesamt ClarithromycinResistenz: Goldstandard Positiv Negativ Insgesamt RIDA GENE Helicobacter pylori Positiv Sensitivität: 96 % Negativ Spezifität: 97 % Insgesamt RIDA GENE Helicobacter pylori

17 13.2 Analytische Sensitivität Die RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR hat eine Nachweisgrenze von 10 DNAKopien/Reaktion. Die folgenden Abbildungen 3 und 4 zeigen Verdünnungsreihen von H. pylori und der ClarithromycinResistenz (jeweils DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II. Abb. 3: Verdünnungsreihe Helicobacter pylori ( DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II RIDA GENE Helicobacter pylori

18 Abb. 4: Verdünnungsreihe ClarithromycinResistenz ( DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II Die Nachweisgrenze des Gesamtverfahrens ist abhängig von der Probenmatrix, der DNAExtraktion und dem DNAGehalt RIDA GENE Helicobacter pylori

19 13.3 Analytische Spezifität Die RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR ist spezifisch für Helicobacter pylori aus humanem Biopsat. Es wurden keine Kreuzreaktivitäten zu den folgenden Spezies festgestellt (s. Tab. 13): Tab. 13: Kreuzreaktivitätstestung Adenovirus 40, human, strain Dugan Adenovirus 41, human, strain Tak Aeromonas hydrophila Arcobacter butzleri Astrovirus Bacillus cereus Bacteroides fragilis Campylobacter coli Campylobacter upsaliensis Candida albicans Citrobacter freundii Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium sordellii Cryptosporidium parvum E. coli (O157:H7) Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Giardia intestinalis Portland 1 Giardia intestinalis WB Clone C6 Klebsiella oxytoca Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Rotavirus Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium Serratia liquefaciens Shigella flexneri Norovirus GGI Staphylococcus aureus Norovirus GGII Vibrio parahaemolyticus Campylobacter jejuni Campylobacter lari subsp. lari E. coli (O26:H) Proteus vulgaris Yersinia enterocolitica E. coli (O6) RIDA GENE Helicobacter pylori

20 14. Versionsübersicht Versionsnummer Kapitel und Bezeichnung Generelle Überarbeitung 4. Packungsinhalt 5. Reagenzien und ihre Lagerung 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 8. Sammlung und Lagerung der Proben 9. Testdurchführung 10. Qualitätskontrolle 11. Interpretation der Ergebnisse 12. Grenzen der Methode 13. Leistungsmerkmale 14. Versionsübersicht 15. Symbolerklärung 15. Symbolerklärung Allgemeine Symbole InvitroDiagnostikum Gebrauchsanweisung beachten Chargennummer verwendbar bis Lagertemperatur Artikelnummer Anzahl Tests Herstelldatum Hersteller Testspezifische Symbole Nicht zutreffend RIDA GENE Helicobacter pylori

21 16. Literatur 1. Rimbara E. PCR Detection of Helicobacter pylori in clinical samples. Methods Mol. Biol. 2013, 943: Glocker E, et al. Quinolone resistance in Helicobacter pylori isolates in Germany. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51(1): O Connor A. Treatment of Helicobacter pylori infection in Helicobacter ISSN , Helicobacter 15 (Suppl. 1): 4652 RIDA GENE Helicobacter pylori

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23 English RIDA GENE Helicobacter pylori PG Intended use For in vitro diagnostic use. RIDA GENE Helicobacter pylori is a multiplex realtime PCR for the direct, qualitative detection of Helicobacter pylori 1 and its resistance to clarithromycin from human native tissue biopsy material. The RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR is intended for use as an aid in diagnosis of gastric infections caused by Helicobacter pylori. 2. Summary and explanation of the test Helicobacter pylori (H. pylori) is a gramnegative rodshaped bacterium which colonises the human gut. H. pylori increases the secretion of stomach acid and hence leads to different gastric infections such as Type B Gastritis, gastric ulcers or duodenal ulcers. Worldwide, H. pylori has a prevalence rate of 50 %, whereas the infection rate is higher in developing countries compared to developed countries. In Germany, about 33 million people are infected with H. pylori of which % develop ulcers. While the H. pylori strain type 2 lacks the pathogenicity factors cag and VacA, an infection with H. pylori strain type 1 leads to gastroduodenal ulcers and in case of a chronic infection, significantly increases the risk of gastric cancer. To protect itself from gastric acid, H. pylori settles inside the gastric mucosa. Here, H. pylori splits urea by the enzyme urease to increase the ph value in its close surroundings. Today, H. pylori is detected by microscopy or by using the helicobacterurease assay from gastric biopsies. Other detection methods are antigen testing or breath tests. After diagnosis of H. pylori, different treatment measures are possible. Often, the Triple Therapy is used which consists of a combination of Amoxicillin, Clarythromycin and a proton pump inhibitor or Metronidazol, Clarythromycin and a proton pump inhibitor. 2 However, increasing clarithromycin resistance lowers the success rate of such a treatment by 30 %. Also, other more and more often occurring resistances against antibiotics such as Metronidazol or Levofloxacin (Fluoroquinolon) lead to higher failure in H. pylori eradication therapies. 3 RIDA GENE Helicobacter pylori

24 3. Test principle The RIDA GENE Helicobacter pylori is a multiplex realtime PCR for the direct, qualitative detection of Helicobacter pylori from human biopsy samples. After DNAisolation, amplification of gene fragments (if present) specific for Helicobacter pylori (16S rrna) and a potential resistance to clarithromycin (23S rrna) occurs. The amplified targets are detected with hydrolysis probes, which are labeled at one end with a quencher and at the other end with a fluorescent reporter dye (fluorophore). In the presence of a target the probes hybridize to the amplicons. During the extension step the TaqPolymerase breaks the reporterquencher proximity. The reporter emits a fluorescent signal which is detected by the optical unit of a realtime PCR instrument. The fluorescence signal increases with the amount of formed amplicons. The RIDA GENE Helicobacter pylori assay contains an Internal Control DNA (ICD) as an internal control of sample preparation procedure and/or to determine possible PCR inhibition. 4. Reagents provided Tab. 1: Reagents provided (Reagents provided in the kit are sufficient for 100 determinations) Kit Code Reagent Amount Lid Color 1 Reaction Mix 2x 1050 µl yellow 2 TaqPolymerase 1x 80 µl red D Internal Control DNA 2x 1700 µl orange N No Template Control 1x 450 µl white P Positive Control 1x 200 µl blue 5. Storage instructions Protect all reagents from light and store at 20 C. All reagents can be used until the expiration date. After expiry the quality guarantee is no longer valid. Carefully thaw and fully defrost reagents before using (e.g. in a refrigerator at 2 8 C). Reagents can sustain up to 20 freeze/thaw cycles without influencing the assay performance (e.g. after the first thawing separate it in aliquots and freeze immediately). During PCR preparation all reagents should be stored cold in an appropriate way (2 8 C) RIDA GENE Helicobacter pylori

25 6. Additional necessary reagents and necessary equipment The RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR assay is suitable for use with following extraction platforms and realtime PCR instruments: Tab. 2 Necessary equipment Extraction platforms RBiopharm Promega RIDA Xtract Maxwell RSC Roche MagNA Pure 96 Realtime PCR instruments Roche Agilent Technologies LightCycler 480II Mx3005P Applied Biosystems ABI 7500 BioRad QIAGEN CFX96 RotorGene Q Note: Only use 0.1 ml tubes on the RotorGene Q (QIAGEN). If you want to use other extraction platforms or realtime PCR instruments please contact RBiopharm at mdx@rbiopharm.de. RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) for use with the LightCycler 480II Realtime PCR consumables (plates, tubes, foil) Centrifuge with a rotor for the reaction vials Vortexer Pipettes ( µl, µl, µl) Filter tips Powderfree disposal gloves PCR water (BioScience grade, nucleasefree) RIDA GENE Helicobacter pylori

26 7. Precautions for users For in vitro diagnostic use. This test must only be carried out by trained laboratory personnel. The guidelines for working in medical laboratories have to be followed. The instruction manual for the test procedure has to be followed. Do not pipet samples or reagents by mouth. Avoid contact with bruised skin or mucosal membranes. During handling reagents or samples, wear appropriate safety clothing (appropriate gloves, lab coat, safety goggles) and wash your hands after finishing the test procedure. Do not smoke, eat or drink in areas where samples or reagents are being used. Extraction, PCR preparation and the PCR run should be separated in different rooms to avoid crosscontaminations. Samples must be treated as potentially infectious as well as all reagents and materials being exposed to the samples and have to be handled according to the national safety regulations. Do not use the kit after the expiration date. All reagents and materials used have to be disposed properly after use. Please refer to the relevant national regulations for disposal. For more details see Safety Data Sheets (SDS) at 8. Collection and storage of samples 8.1 Sample preparation from biopsy material For DNA isolation of biopsy samples, use a commercially available DNA isolation kit (e.g. RIDA Xtract (RBiopharm)) or DNA extraction system (e.g. Maxwell RSC (Promega)). Extract DNA according to the manufacturer s instructions. We recommend to incubate the biopsy material over night at 55 C using Proteinase K before extraction. From this sample, use the appropriate volume for the extraction according to the manufacturer s instructions. The RIDA GENE Helicobacter pylori assay contains an Internal Control DNA that detects PCR inhibition, monitors reagent integrity and confirms that nucleic acid extraction was sufficient. The Internal Control DNA can either be used as PCR inhibition control or as extraction control for the sample preparation procedure and as PCR inhibition control. If the Internal Control DNA is used only as a PCR inhibition control, 1 µl of the Internal Control DNA should be added to the MasterMix (see Tab.4). If the Internal Control DNA is used as an extraction control for the sample preparation procedure and as PCR inhibition control, 20 µl of the Internal Control DNA has to be added during extraction procedure. The Internal Control DNA should always be added to the specimenlysis buffer mixture and must not be added directly to the specimen. We also recommend to add 1 µl of the Internal Control DNA to the negative control and positive control PCR Mix RIDA GENE Helicobacter pylori

27 9. Test procedure 9.1 MasterMix preparation Calculate the total number of PCR reactions (sample and control reactions) needed. One positive control and one negative control must be included in each assay run. We recommend calculating an additional volume of 10 % to compensate imprecise pipetting (see Tab. 3, Tab. 4). Thaw, mix gently and briefly centrifuge the Reaction Mix, the TaqPolymerase, the Positive Control, the No Template Control and the Internal Control DNA before using. Keep reagents appropriately cold during working step (2 8 C). Tab. 3: Calculation and pipetting example for 10 reactions of the MasterMix (ICD as extraction and PCR inhibition control) Kit code MasterMix components Volume per reaction 10 reactions (10 % extra) 1 Reaction Mix 19.3 µl µl 2 TaqPolymerase 0.7 µl 7.7 µl Total 20 µl 220 µl Mix the components of the MasterMix gently and briefly spin down. Tab. 4: Calculation and pipetting example for 10 reactions of the MasterMix (ICD only as PCR inhibition control) Kit code MasterMix components Volume per reaction 10 reactions (10 % extra) 1 Reaction Mix 19.3 µl µl 2 TaqPolymerase 0.7 µl 7.7 µl D Internal Control DNA 1.0 µl 11 µl Total 21.0 µl µl Mix the components of the MasterMix gently and briefly spin down. RIDA GENE Helicobacter pylori

28 9.2 Preparation of the PCRMix Pipette 20 µl of the MasterMix in each reaction vial (tube or plate). Negative control: Add 5 µl No Template Control to the prepipetted MasterMix. Note: If the Internal Control DNA is used as extraction control for the sample preparation procedure and as PCR inhibition control, we recommend to add 1 µl of the Internal Control DNA to the PCRMix of the negative control. Sample: Add 5 µl DNA extract to the prepipetted MasterMix. Positive control: Add 5 µl Positive Control to the prepipetted MasterMix. Note: If the Internal Control DNA is used as extraction control for the sample preparation procedure and as PCR inhibition control, we recommend to add 1 µl of the Internal Control DNA to the PCRMix of the positive control. Cover tubes or plate. Spin down and place in the realtime PCR instrument. The PCR reaction should be started according to the PCR instrument setup see (Tab. 5, Tab. 6, Tab.7, Tab. 8) RIDA GENE Helicobacter pylori

29 9.3 PCR instrument setup DNA realtime PCR profile Tab. 5: DNA realtime PCR profile for LightCycler series and RotorGene Q Initial Denaturation 1 min, 95 C Cycles PCR Denaturation Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Cycles 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Note: Annealing and Extension occur in the same step. Tab. 6: DNA realtime PCR profile for Mx3005P, ABI7500, CFX96 Initial Denaturation 1 min, 95 C Cycles PCR Denaturation Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Cycles 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Note: Annealing and Extension occur in the same step. RIDA GENE Helicobacter pylori

30 9.3.2 Universal realtime PCR profile Note: The universal realtime PCR profile should only be used for DNA assays when combining RIDA GENE DNA and RNA realtime PCR assays in one run. Tab. 7: Universal realtime PCR profile for LightCycler series Reverse Transcription 10 min, 58 C Initial Denaturation 1 min, 95 C Cycles PCR Denaturation Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Cycles 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Note: Annealing and Extension occur in the same step. Tab. 8: Universal realtime PCR profile for Mx3005P, ABI7500, CFX96 and Rotor Gene Q Reverse Transcription 10 min, 58 C Initial Denaturation 1 min, 95 C Cycles PCR Denaturation Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Cycles 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Note: Annealing and Extension occur in the same step RIDA GENE Helicobacter pylori

31 9.4 Detection channel setup Tab. 9: Selection of appropriate detection channels Realtime PCR instrument Detection Detection channel Note Roche LightCycler 480II ABI 7500 Agilent Techn. Mx3005P Qiagen Rotor Gene Q BioRad CFX96 H. pylori 465/510 ICD 533/580 Clarithromycin resistance 618/660 H. pylori FAM ICD VIC Clarithromycin resistance Cy5 H. pylori FAM ICD HEX Clarithromycin resistance Cy5 H. pylori Green ICD Yellow Clarithromycin resistance Red H. pylori FAM ICD VIC Clarithromycin resistance Cy5 RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) is required Check that passive reference option ROX is none Check that reference dye is none The gain settings have to be set to 5, according to the default settings RIDA GENE Helicobacter pylori

32 10. Quality control The analysis of the samples is done by the software of the used realtime PCR instrument according to the manufacturer s instructions. Positive control and negative control have to show correct results (see Table 10, Fig. 1, Fig. 2) in order to determine a valid run. The Positive Control has a concentration of 10 3 copies/µl. In each PCR run it is used in a total amount of 5 x 10 3 copies. Tab. 10: For a valid run, the following conditions must be met: Sample Assay result ICD Ct Target Ct Positive control Positive NA * 1 Assurance See Quality Certificate Negative control Negative Ct > 20 0 * 1 No Ct value is required for the ICD to make a positive call for the positive control. If the positive control is not positive within the specified Ct range but the negative control is valid, prepare all new reactions including the controls. If the negative control is not negative but the positive control is valid, prepare all new reactions including the controls. If the required criteria are not met, following items have to be checked before repeating the test: Expiry of the used reagents Functionality of the used instrumentation Correct performance of the test procedure RIDA GENE Helicobacter pylori

33 Fig. 1: Correct run of the positive and negative control (Helicobacter pylori) on the LightCycler 480II Fig. 2: Correct run of the positive and negative control (Clarithromycin resistance) on the LightCycler 480II RIDA GENE Helicobacter pylori

34 11. Result interpretation The result interpretation is done according to Table 11. Tab. 11: Sample interpretation Target genes Helicobacter pylori Clarithromycin resistance ICD Result positive negative positive/negative H. pylori detected positive positive* positive/negative H. pylori and Clarithromycin resistance detected negative positive* positive/negative H. pylori not detected negative negative positive Target genes not detected negative negative negative Invalid *Note: When using the LightCycler 480II (Roche) or the CFX96 TM (Biorad), the fluorescence signal of a true positive signal in the clarithromycin resistance channel (Cy5) has to be more than 20 % of the fluorescence signal of the positive control or when using the Mx3005P (Agilent Technologies), the ABI 7500 (Applied Biosystems) or the RotorGene Q (Qiagen), the fluorescence signal has to be more than 10 % of the fluorescence signal of the positive control. For a clearer evaluation, we recommend to set the threshold on this value (10 % or 20 % of the fluorescence signal of the positive control). A sample is evaluated negative, if the sample shows no amplification signal in the detection system, but the Internal Control DNA is positive. An inhibition of the PCR reaction or a failure in the extraction procedure can be excluded by the detection of the Internal Control DNA. A sample is evaluated positive, if both, the sample and the Internal Control DNA, show an amplification signal in the detection system. A sample is evaluated positive, if the sample shows an amplification signal in the detection system, but the Internal Control DNA is negative. The detection of the internal amplification control is not necessary, because high concentrations of the amplicon can cause a weak or absent signal of the internal amplification control. A sample is evaluated invalid, if both, the sample and the Internal Control DNA show no amplification signal in the detection system. The sample contained a PCR inhibitor or a failure occurred in the extraction procedure. The extracted sample needs to be further diluted with PCR water (1:10) and reamplified, or the isolation and purification of the sample has to be improved RIDA GENE Helicobacter pylori

35 12. Limitations of the method 1. The result of molecular analysis should not lead to the diagnosis, but always be considered in the context of medical history and symptoms of the patient. 2. This assay is only validated for biopsy material. 3. Inappropriate specimen collection, transport, storage and processing or a pathogen load in the specimen below the analytical sensitivity can result in false negative results. 4. The presence of PCR inhibitors may cause invalid results. 5. Mutations or polymorphisms in primer or probe binding regions may affect detection of new variants resulting in a false negative result with the RIDA GENE Helicobacter pylori assay. 6. As with all PCR based in vitro diagnostic tests, extremely low levels of target below the limit of detection (LoD) may be detected, but results may not be reproducible. 7. A positive test result does not necessarily indicate the presence of viable organisms. However, a positive result is indicative for the presence of the target genes (16S rrna, 23S rrna). 8. In individual cases, weak crossreactivity can occur in the Clarithromycin channel in presence of organisms that also carry the Clarithromycin wildtype genome but which are not Helicobacter pylori. 9. In individual cases, crossreactivity can occur in the H. pylori channel in presence of Helicobacter felis though H.pylori is not present in the sample (crossreactivity). RIDA GENE Helicobacter pylori

36 13. Performance characteristics Clinical performance In a retrospective clinical validation study we analyzed 225 and 139 human clinical specimens with the RIDA GENE Helicobacter pylori assay compared to culture and a second commercial PCR method in an institute in Germany. Tab. 12: Correlation of the Helicobacter pylori and Clarithromycin resistance results with the RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR and the reference method Helicobacter pylori: Gold Standard Positive Negative Total RIDA GENE Helicobacter pylori Positive Sensitivity: 100 % Negative Specificity: 98 % Total Clarithromycin resistance: Gold Standard Positive Negative Total RIDA GENE Helicobacter pylori Positive Sensitivity: 96 % Negative Specificity: 97 % Total RIDA GENE Helicobacter pylori

37 13.2 Analytical sensitivity The RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR has a detection limit of 10 DNA copies per reaction. The following figures 3 and 4 show a dilution series of Helicobacter pylori and the Clarithromycin resistance (each DNA copies per µl) on the LightCycler 480II. Fig. 3: Dilution series H. pylori ( DNA copies per µl) on the LightCycler 480II RIDA GENE Helicobacter pylori

38 Fig. 4: Dilution series Clarithromycin resistance ( DNA copies per µl) on the LightCycler 480II The detection limit of the whole procedure depends on the sample matrix, DNA extraction and DNA concentration RIDA GENE Helicobacter pylori

39 13.3 Analytical specificity The analytical specificity of the RIDA GENE Helicobacter pylori multiplex realtime PCR is specific for Helicobacter pylori from human biopsy samples. No crossreaction could be detected for the following species (see Tab. 13): Tab. 13: Crossreactivity testing Adenovirus 40, human, strain Dugan Adenovirus 41, human, strain Tak Aeromonas hydrophila Arcobacter butzleri Astrovirus Bacillus cereus Bacteroides fragilis Campylobacter coli Campylobacter upsaliensis Candida albicans Citrobacter freundii Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium sordellii Cryptosporidium parvum E. coli (O157:H7) Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Giardia intestinalis Portland 1 Giardia intestinalis WB Clone C6 Klebsiella oxytoca Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Rotavirus Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium Serratia liquefaciens Shigella flexneri Norovirus GGI Staphylococcus aureus Norovirus GGII Vibrio parahaemolyticus Campylobacter jejuni Campylobacter lari subsp. lari E. coli (O26:H) Proteus vulgaris Yersinia enterocolitica E. coli (O6) RIDA GENE Helicobacter pylori

40 14. Version history Version number Chapter and designation General revision 4. Reagents provided 5. Storage instructions 6. Additional necessary reagents and necessary equipment 8. Collection and storage of samples 9. Test procedure 10. Quality control 11. Result interpretation 12. Limitations of the method 13. Performance characteristics 14. Version history 15. Explanation of symbols 15. Explanation of symbols General symbols For in vitro diagnostic use Consult instructions for use Lot number Expiry Store at Article number Number of tests Date of manufacture Manufacturer Testspecific symbols Not applicable RIDA GENE Helicobacter pylori

41 16. Literature 1. Rimbara E. PCR Detection of Helicobacter pylori in clinical samples. Methods Mol. Biol. 2013, 943: Glocker E, et al. Quinolone resistance in Helicobacter pylori isolates in Germany. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51(1): O Connor A. Treatment of Helicobacter pylori infection in Helicobacter ISSN , Helicobacter 15 (Suppl. 1): 4652 RIDA GENE Helicobacter pylori

42 RIDA GENE Helicobacter pylori

43 Español RIDA GENE Helicobacter pylori PG Uso previsto Para el diagnóstico in vitro. RIDA GENE Helicobacter pylori es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real para la detección cualitativa directa de Helicobacter pylori 1 y su resistencia a la claritromicina en tejido humano de biopsia. El ensayo de PCR multiplex en tiempo real RIDA GENE Helicobacter pylori está concebido como una ayuda para el diagnóstico de infecciones gástricas causadas por Helicobacter pylori. 2. Resumen y descripción del ensayo Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria gramnegativa tipo bacilo que coloniza el tubo digestivo humano. H. pylori aumenta la secreción de ácido en el estómago y, en consecuencia, da lugar a diferentes infecciones gástricas, como gastritis tipo B, úlceras gástricas o úlceras duodenales. La prevalencia de H. pylori en todo el mundo es del 50 %, mientras que la tasa de infección es mayor en los países en desarrollo que en los desarrollados. En Alemania, cerca de 33 millones de personas están infectadas con H. pylori y el % de ellas presentan úlceras. Si bien la cepa tipo 2 de H. pylori carece de los factores patógenos cag y VacA, una infección con la cepa tipo 1 de H. pylori ocasiona úlceras gastroduodenales y, en caso de infección crónica, aumenta de forma significativa el riesgo de cáncer de estómago. Para protegerse de los ácidos gástricos, H. pylori se instala en el interior de la mucosa gástrica. Allí, H. pylori rompe la urea por la acción de la enzima ureasa para aumentar el valor de ph en sus proximidades. En la actualidad, H. pylori se detecta por microscopía o con el ensayo de ureasa de Helicobacter en biopsias gástricas. Otros métodos de detección son las pruebas de antígenos o de aliento. Tras el diagnóstico de H. pylori, hay diferentes estrategias de tratamiento posibles. Con frecuencia se utiliza el «tratamiento triple», que consiste en una combinación de amoxicilina, claritromicina y un inhibidor de la bomba de protones, o metronidazol, claritromicina y un inhibidor de la bomba de protones. 2 No obstante, el aumento en la resistencia a la claritromicina reduce la tasa de éxito de este tratamiento en un 30 %. Asimismo, otras resistencias cada vez más frecuentes a antibióticos como el metronidazol o el levofloxacino (fluoroquinolona) ocasionan un mayor fracaso de los tratamientos de erradicación de H. pylori. 3 RIDA GENE Helicobacter pylori

44 3. Principio del ensayo RIDA GENE Helicobacter pylori es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real para la detección cualitativa directa de Helicobacter pylori en muestras de biopsia humanas. Tras el aislamiento del ADN, se lleva a cabo la amplificación de los fragmentos génicos (si están presentes) específicos de Helicobacter pylori (ARNr 16S) y de la posible resistencia a la claritromicina (ARNr 23S). Las dianas amplificadas se detectan mediante sondas de hidrólisis, marcadas en un extremo con un extintor de fluorescencia y en el otro con un colorante fluorescente indicador (fluoróforo). En presencia de una diana, las sondas se hibridan a los amplicones. Durante el paso de extensión, la TaqPolymerase rompe la proximidad del indicadorextintor. El indicador emite una señal fluorescente que se detecta en la unidad óptica de un equipo de PCR en tiempo real. La señal fluorescente aumenta en función de la cantidad de amplicones formados. El ensayo RIDA GENE Helicobacter pylori contiene un Internal Control DNA (ICD) como control interno del procedimiento de preparación de la muestra o para determinar la posible inhibición de la PCR. 4. Reactivos suministrados Tabla 1: Reactivos suministrados (los reactivos del kit son suficientes para 100 determinaciones) Código del kit Reactivo Cantidad Color de la tapa 1 Reaction Mix 2x 1050 µl amarillo 2 TaqPolymerase 1x 80 µl rojo D Internal Control DNA 2x 1700 µl naranja N No Template Control 1x 450 µl blanco P Positive Control 1x 200 µl azul 5. Instrucciones de almacenamiento Todos los reactivos deben conservarse protegidos contra la luz y a una temperatura de 20 C. Todos los reactivos pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad. Después de la fecha de caducidad, la garantía de calidad ya no es válida. Descongele con cuidado y por completo los reactivos antes de utilizarlos (p. ej., en un refrigerador a 2 8 C) RIDA GENE Helicobacter pylori

45 Los reactivos admiten hasta 20 ciclos de congelación/descongelación sin que esto afecte la eficacia diagnóstica del ensayo (p. ej., tras la primera descongelación, es conveniente dividir en alícuotas y congelar de inmediato). Durante la preparación de la PCR, todos los reactivos deben conservarse en frío de forma adecuada (2 8 C). 6. Reactivos adicionales necesarios y equipo necesario El ensayo de PCR multiplex en tiempo real RIDA GENE Helicobacter pylori es adecuado para utilizarse con las siguientes plataformas de extracción y equipos de PCR en tiempo real: Tabla 2 Equipamiento necesario Plataformas de extracción RBiopharm Promega RIDA Xtract Maxwell RSC Roche MagNA Pure 96 Equipos de PCR en tiempo real Roche Agilent Technologies LightCycler 480II Mx3005P Applied Biosystems ABI 7500 BioRad QIAGEN CFX96 RotorGene Q Nota: Utilice únicamente tubos de 0,1 ml en el RotorGene Q (QIAGEN). Si desea utilizar otras plataformas de extracción o equipos de PCR en tiempo real, póngase en contacto con RBiopharm en mdx@rbiopharm.de. RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) para uso con el LightCycler 480II Consumibles para PCR en tiempo real (placas, tubos, papel aluminio) Centrífuga y rotor para los viales de reacción Agitador de vórtex Pipetas (0,5 20 µl, µl, µl) Puntas con filtro Guantes desechables sin talco Agua para PCR (agua de grado BioScience, sin nucleasas) RIDA GENE Helicobacter pylori

46 7. Precauciones para los usuarios Para el diagnóstico in vitro. Este ensayo solo debe llevarlo a cabo personal de laboratorio capacitado. Respete las directrices para el trabajo en laboratorios médicos. Siga las indicaciones del manual de instrucciones para la ejecución de la prueba. No pipetee muestras ni reactivos con la boca. Evite el contacto con piel herida o mucosas. Durante la manipulación de reactivos o muestras, lleve ropa de seguridad adecuada (guantes apropiados, bata de laboratorio, gafas protectoras) y lávese las manos al finalizar la ejecución de la prueba. No fume, coma ni beba en las zonas en las que se estén utilizando las muestras o los reactivos. La extracción, la preparación de la PCR y la PCR propiamente dicha deben llevarse a cabo en diferentes salas para evitar la contaminación cruzada. Las muestras deben tratarse como potencialmente infecciosas, al igual que todos los reactivos y materiales expuestos a las muestras, y deben manipularse según las normativas nacionales de seguridad. No utilice el kit después de la fecha de caducidad. Todos los reactivos y materiales usados se deben eliminar correctamente después del uso. Consulte las normas nacionales pertinentes para la eliminación. Para obtener más información, consulte la hoja de datos de seguridad (SDS) en 8. Obtención y almacenamiento de muestras 8.1 Preparación de las muestras a partir de material de biopsia Para el aislamiento del ADN a partir de muestras de biopsia, use un kit de aislamiento de ADN (p. ej. RIDA Xtract [RBiopharm]) o un sistema de extracción de ADN (p. ej., Maxwell RSC [Promega]) disponibles en el mercado. Extraiga el ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recomienda incubar el material de biopsia durante la noche a 55 C con proteinasa K antes de la extracción. Para esta muestra, use el volumen adecuado para la extracción, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo RIDA GENE Helicobacter pylori contiene un Internal Control DNA que detecta la inhibición de la PCR, monitorea la integridad de los reactivos y confirma que la extracción de ácidos nucleicos haya sido suficiente. El Internal Control DNA puede usarse como control de inhibición de la PCR, o como control de extracción para el procedimiento de preparación de las muestras y control de inhibición de la PCR. Si el Internal Control DNA se usa únicamente como control de inhibición de la PCR, se debe agregar 1 µl del Internal Control DNA a la mezcla maestra (consulte la tabla 4) RIDA GENE Helicobacter pylori