P R Ü F B E R I C H T / T E S T R E P O R T

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1 PRISMAN GmbH Werkstraße 23 D Viernheim P R Ü F B E R I C H T / T E S T R E P O R T Virucidal quantitative suspension test according EN / Quantitativer Suspensionsversuch Viruzidie gemäß EN Murine Norovirus / Murines Norovirus Clean conditions / geringe Belastung Lab.-No / Labor-Nr.: SN Test product / Prüfprodukt: Batch number / Chargen-Bez.: Manufacturer / Hersteller: A0183 PRISMAN GmbH Date of order / Auftragsdatum: Date of delivery / Materialeingang: Storage conditions / Lagerbedingungen: Properties of package / Verpackung: Active compound according the manufacturer/ Wirkstoffe laut Herstellerangabe: In the original package, at room temperature / In der Originalverpackung bei Raumtemperatur Plastic bottle / Plastikflasche 100g contain: / 100 g enthalten: Not listed / nicht angegeben The product was delivered 125% and tested 100%. Das Produkt wurde 125%ige geliefert und 100%ig geprüft. SN page 1 of 10

2 Appearance / Aussehen: Odour / Geruch: Clear colourless liquid / klare farblose Flüssigkeit alcoholic / alkoholisch ph-values / ph-werte 20 C 100 % 80% in WSH 1) 50% in WSH 1) 7,78 7,63 7,45 1) WSH Water of standardised hardness / Wasser standardisierter Härte Test method / Methodik: EN 14476: /A1: and pren 14476:2011*: Chemical disinfectants and antiseptics Virucidal quantitative suspension test for chemical disinfectants and antiseptics used in human medicine Test method and requirements (phase 2, step 1) EN 14476: /A1: und pren 14476:2011*:Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika - Quantitativer Suspensionsversuch Viruzidie für in der Humanmedizin verwendete chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika Prüfverfahren und Anforderungen (Phase2, Stufe 1) * For the evaluation of the virucidal activity according to EN suspensions of 8 parts by volume of the disinfectant solution (product test solution) were mixed with one volume of an interfering substance (0.3% in the test with dirty conditions and 0.03% for clean conditions) and one volume of virus suspension with a titer of at least 10 7 TC ID 50 / ml. After the contact time the disinfectant efficacy was stopped by diluting (or gel filtration). For the determination of residual virus content, a dilution series according to the progression of 1:10 / 1:100 / 1:1000 etc. was prepared. The titration was carried out in microtiter 96-well plates. In addition, the following controls were performed: virus control, cytotoxicity control, susceptibility control and a reference inactivation with 0.7% formaldehyde. The calculation of titer reductions is based on the method of Spearman and Kärber and is measured as the difference between the titer of the virus control and the titer of product test solution including a 95% confidence interval. * Für den Nachweis der viruziden Wirksamkeit nach EN werden Suspensionen von 8 Volumenteilen der Desinfektionsmittels (Produktprüflösung) mit einem Teil Belastungssubstanz (0,3% bei der Prüfung von dirty conditions bzw. 0,03% bei der Prüfung von clean conditions) und einem Volumenteil Virussuspension mit einem Titer von mindestens 10 7 TC ID 50 / ml inkubiert. Nach Ablauf der Einwirkungszeit wird die Wirkung der Desinfektionsmittels durch Verdünnen (bzw. Gel-Filtration) gestoppt und zur Ermittlung des Restvirusgehaltes eine Verdünnungsreihe entsprechend der Progression 1:10 /1:100 / 1:1000 u.s.w. angelegt. Die Titration erfolgt im Mikrotitersystem auf 96-well Platten. Darüber hinaus werden folgende Kontrollen durchgeführt: Viruskontrolle, Zytotoxizitätskontrolle, Suszeptibilitätskontrolle und Referenzinaktivierung mit 0,7% Formaldehyd. Die Kalkulation der Ergebnisse erfolgt nach Spearmann und Kärber und wird als Differenz zwischen dem Titer der Viruskontrolle und dem Titer der Produktprüflösung unter Einbeziehung eines 95%igen Konfidenzintervalles berechnet. SN page 2 of 10

3 Experimental conditions / Prüfbedingungen Period of testing / Testzeitraum: Contact time / Einwirkzeit: Interfering substance / Belastung Test temperature / Versuchstemperatur: Concentration of test product:/ Konzentration des Prüfproduktes: Product diluent / Verdünnungsmittel: 60 sec 0.3g BSA/l (clean conditions / geringe Belastung) 20 C ± 0.5 C 100% (V/V), 80% (V/V), 50% (V/V) Water of standardised hardness / Wasser standardisierter Härte Test virus / Prüfvirus: Murine Norovirus strain S99 Berlin / Murines Norovirus, Stamm S99 Berlin Cell line for replication / Zelllinie zur Vermehrung Method of titration / Titrationsverfahren: Procedure to stop action of product and elimination of cytotoxicity / Verfahren zur Beendigung der Wirkung des Produktes und Verringerung der Zytotoxizität Susceptibility test / Suszeptibilitätsprüfung Reference virus inactivation / Referenz Virusinaktivierung RAW cells / RAW-Zellen ATCC TIB-71 Virus titration on cells as monolayer in 96-well microtiter plates. 0.5ml product test solution were diluted with 4.5ml ice cold DMEM with 2% FBS up to a dilution of µl of each dilution were pipetted into 6 wells of the microtiter plate / Virustitration auf Zellen als Monolayer in 96-Well Mikrotiterplatten. 0,5ml Produktprüflösung werden mit 4,5ml eiskaltem DMEM + 2% FBS bis zu einer Verdünnung von 10-8 verdünnt. 100µl von jeder Verdünnung wurden in 6 wells der Mikrotiterplatte pipettiert. Gelfiltration with MicroSpin Columns and dilution up to 10-4 within 10 sec. with ice cold DMEM + 2% FBS / Gelfiltration mit MicroSpin Säulen und Verdünnung bis 10-4 innerhalb von 10 sec. mit eiskaltem DMEM + 2% FBS Comparative virus titrations were performed on cells, which had been treated with 0.1% solution of the product respectively PBS. / Vergleichende Virustitrationen wurden auf Zellen durchgeführt, welche mit 0,1% Produktlösung bzw. PBS behandelt wurden. 0.7% (V/V) Formaldehyde solution / 0,7% Formaldehydlösung Contact times / Einwirkzeiten: 30, 60 min SN page 3 of 10

4 Calculation of the virucidal activity TCID 50 was calculated according the method of Spearman and Kärber / Der TCID 50 wurde entsprechend der Methode von Spearman und Kärber berechnet. m = x k + d/2 d p i m = negative decadal logarithm of the titre based on the test volume / Negativer Logarithmus des Titers bezogen auf das Testvolumen x k = d = p i = logarithm of the lowest dilution level at which all test objects exhibit a positive reaction Logarithmus der kleinsten Verdünnungsstufe, bei der alle Testobjekte positiv reagieren logarithm of the dilution factor Logarithmus des Verdünnungsfaktors observed reaction rate / beobachtete Reaktionsrate Calculation of the Standard error / Berechnung der Standardabweichung S m = d = p i = n standard error of logarithmic titre / Standardabweichung des logarithmierten Titers logarithm of the dilution factor / Logarithmus des Verdünnungsfaktors observed reaction rate / beobachtete Reaktionsrate number of testobjects per dilution / Anzahl der Prüfungen pro Verdünnung Calculation of the reduction factor (RF) / Berechnung des Reduktionsfaktor (RF) RF = lg (virus control) lg (test product) RF = log (Viruskontrolle) log (Prüfprodukt) K RF = 95% Confidence interval of the reduction factor / 95% Konfidenzintervall des Reduktionsfaktors S m = standard deviation of the logarithmic titre / Standardabweichung des logarithmierten Titers A summary of the results of the quantitative suspension test according EN with and Murine Norovirus are shown in Table 1 and 2. In Table 3 the results of the controls are summarized. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse des quantitativen Suspensionstest entsprechend EN mit und Murinem Norovirus ist in Tabelle 1 und 2 dargestellt. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Kontrollen zusammengefasst. SN page 4 of 10

5 Test results Murine Norovirus / Ergebnisse Murines Norovirus Table 1: Summary of the results with and Murine Norovirus / Zusammenfassung der Ergebnisse von und Murinem Norovirus Product / Produkt Concentration Konzentration TCID 50 CD 50 n.a. n.d. BSA 100% 80% 50% Virus control 1ml Virus Interfering substance / Belastung CD50 lg-tcid 50 /0.1ml after sec log 10 -TCID 50 /0.1ml nach sec Murine Norovirus 60 4 lg reduction after sec Titerreduktion 4 log 10 nach sec 0.3g BSA/l 2,50 2,50 ± 0, g BSA/l 2,50 2,50 ± 0, g BSA/l 1,50 6,67 ± 0,33 0.3g BSA/l n.a. 7,50 ± 0,63 n.a. Tissue culture infectious dose cytotoxic dose / Zytotoxische Dosis not applicable / nicht anwendbar not done / nicht durchgeführt Bovine Serum Albumine / Rinderserumalbumin Table 2: Summary of the results with and Murine Norovirus showing the reduction factors / Zusammenfassung der Ergebnisse von und Murinem Norovirus anhand der Reduktionsfaktoren Product / Produkt Concentration Konzentration Interfering substance / Belastung CD50 Virus control Viruskontrolle [log 10 - TCID 50 /0.1ml] Reduction factor Reduktionsfaktor [log 10 -TCID 50 /0.1ml] Murine Norovirus 60 TCID 50 CD 50 n.a. n.d. BSA 100% 80% 50% 0.3g BSA/l 2,50 5,00 ± 0,63 0.3g BSA/l 2,50 7,50 ± 0,63 5,00 ± 0,63 0.3g BSA/l 1,50 0,83 ± 0,71 Tissue culture infectious dose cytotoxic dose / Zytotoxische Dosis not applicable / nicht anwendbar not done / nicht durchgeführt Bovine Serum Albumine / Rinderserumalbumin SN page 5 of 10

6 Test results Murine Norovirus / Ergebnisse Murines Norovirus Table 3: Virus controls and reference inactivation of Murine Norovirus / Viruskontrollen und Referenzinaktivierung mit Murinem Norovirus Product / Produkt Concentration Konzentration Interfering substance / Belastung CD50 lg-tcid 50 /0,1ml after min log 10 -TCID 50 /0,1ml nach min Murine Norovirus Formaldehyde 0.7% (V/V) PBS 3.5 n.d. 5,33 ± 0,62 4,00 ± 0,33 n.a. n.d. WSH PBS TCID 50 CD 50 Virus control 20 C 1ml Virus Susceptibility (PBS) 0.3g BSA/l n.a. 7,50 ± 0,63 n.d. n.d. 0.3g BSA/l n.a. n.d. n.d. 7,67 ± 0,68 Susceptibility 0.3g BSA/l n.a. n.d. n.d. 7,00 ± 0,70 (0.1%product) not applicable / nicht anwendbar not done / nicht durchgeführt water of standardised hardness / Wasser standardisierter Härte Phosphate buffered saline solution/ Phosphat gepufferte Salzlösung Tissue culture infectious dose cytotoxic dose / Zytotoxische Dosis SN page 6 of 10

7 Fig. 1 : Reference inactivation of Murine Norovirus by 0.7% Formaldehyde / Referenzinaktivierung von Murinem Norovirus durch 0,7% Formaldehyd Fig. 2 : Inactivation of Murine Norovirus by / Inaktivierung von Murinem Norovirus durch SN page 7 of 10

8 Verification of the methodology / Verifizierung des Verfahrens Cytotoxicity / Zytotoxizität After gelfiltration the 100% and 80% product showed no cytotoxic effect at a dilution of 10-2 (2,5 CD 50 ). Therefore this does not affect the dilutions needed to demonstrate the virucidal effect. Nach Gelfiltration zeigten das 100%ige und 80%ige Produkt bei einer Verdünnung von 10-2 (2,5 CD 50 ) keinen zytotoxischen Effekt. Dies stört folglich nicht die erforderlichen Verdünnungen zum Nachweis einer viruziden Wirkung. Viruscontrol / Viruskontrolle The virus titre for Murine Norovirus was 7.50 ± 0,63 TCID 50 /0,1ml and therefore 8.50 ± 0.63 TCID 50 /ml. The detectable titre reduction was 4.00 lg10. Der Virustiter für das Murine Norovirus betrug 7,50 ± 0,63 TCID 50 / 0,1ml und somit 8,50 ± 0,63 TCID 50 /ml. Die nachweisbare Titerreduktion betrug somit 4,00 lg10 Susceptibility / Suszeptibilität The comparative virus titration on pre-treated cells and not pre-treated cells showed a difference < 1.00 lg10 of the virus titre. Die vergleichende Virustitration auf vorbehandelten und nicht vorbehandelten Zellen zeigte einen Unterschied von < 1,00 log10 Stufen. Reference inactivation / Referenzinaktivierung The reduction factor of 0.7% formaldehyde was 2.17 lg10 after 30 min and 4.00 lg10 after 60 min contact time. Der Reduktionsfaktor von 0,7% Formaldehyd betrug nach 30 min Einwirkungszeit 2,17 log10 und nach 60 min Einwirkungszeit 4,00 log10. SN page 8 of 10

9 Results / Ergebnisse After an exposure time of 60 sec with 80% under clean conditions no replication of Murine Norovirus could be detected in cultures of RAW-cells. The required titre reduction of 4 lg10 could be demonstrated with an 80% application concentration already. Nach einer Einwirkzeit von 60 sec mit dem 80%igen bei geringer Belastung konnte keine Vermehrung von Murinem Norovirus in Kulturen von RAW-Zellen nachgewiesen werden. Die erforderliche Titerreduktion von 4 log10 Stufen konnte bereits für eine 80% Anwendungskonzentration nachgewiesen werden. Archive: Archivierung: The raw data with respect to this test and a copy of the report will be maintained by HygCen in the archive. Eine Ausfertigung des Berichtes wird zusammen mit den Rohdaten im Archiv des Auftragnehmers aufbewahrt. Information: The test results are valid for the named test subject only. Reproduction of any part of this report requires the written permission by HygCen Limited. Hinweis: Die Prüfergebnisse beziehen sich ausschließlich auf den genannten Prüfgegenstand. Auszugsweise Wiedergabe dieses Berichtes nur mit schriftlicher Genehmigung der HygCen GmbH. Prof. Dr. med. H.-P. Werner Manager of scientific-technicals affairs Dipl. Umweltwiss. J. Köhnlein Vice department manager SN page 9 of 10

10 Annex Raw data Virucidal quantitative suspension test (phase 2, step1) according EN with and Murine Norovirus / Rohdaten Quantitativer Suspensionsversuch Viruzidie (Phase 2, Stufe 1) mit Murinem Norovirus Product / Produkt Concentration Interfering substance / Belastung Exposure time / Einwirkzeit dilution / Verdünnung log10 Konzentration RSD % 0.3g BSA/l 60 sec CT RSD % 0.3g BSA/l 60 sec CT RSD % 0.3g BSA/l 60 sec RSD % 0.3g BSA/l n.a. CT n.a. n.a. n.a. Cytotoxicity/Zytotoxizität RSD % 0.3g BSA/l n.a. CT n.a. n.a. n.a. Cytotoxicity/Zytotoxizität RSD % 0.3g BSA/l n.a n.a. n.a. n.a. Cytotoxicity/Zytotoxizität Formaldehyde 0,7 % (m/v) PBS 30 min CT CT C min CT CT Formaldehyde 0,7 % (m/v) PBS n. a. CT CT Cytotoxicity/Zytotoxizität Susceptibility of TIB g BSA/l 60 min PBS Susceptibility of TIB g BSA/l 60 min Product / Produkt Virus Control 1ml virus 0.3g BSA/l 60 sec C WSH Control 0 min WSH Kontrolle to 4 virus detectable / Virus nachweisbar (1=25% CPE, 4=100% CPE) 0 no virus / no cytotoxicity / kein Virus / keine Zytotoxizität nachweisbar n.a. not applicable / nicht anwendbar n.d. not done / nicht durchgeführt CPE Cytopathogenic effect / Zytopathogener Effekt FBS Fetal Bovine Serum Albumine / Rinderserumalbumin CT Cytotoxicologic effect / Zytotoxischer Effek t SN page 10 of 10