HER2 FISH pharmdx Kit Code K5331 7th edition/ 7 e édition/ 7. Auflage

Transkript

1 HER2 FISH pharmdx Kit Code K5331 7th edition/ 7 e édition/ 7. Auflage Direct fluorescence in situ hybridization assay for quantitative determination of HER2 gene amplification in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) breast cancer tissue and FFPE specimens from patients with adenocarcinoma of the stomach including gastro-esophageal junction. The assay is indicated in adjunction to HercepTest in the assessment of patients for whom Herceptin treatment is being considered. The kit contains reagents sufficient for 20 tests. Test d hybridation in situ à fluorescente directe pour la détermination quantitative de l amplification du gène HER2 dans des échantillons tissulaires de cancer du sein et des échantillons de patients atteints d adénocarcinome de l estomac, notamment à la jonction gastro-œsophagienne, tous fixés au formol et inclus en paraffine. Ce test est conçu en complément du test HercepTest dans le cadre de l évaluation des patients pour lesquels un traitement à l Herceptin est envisagé. Le kit contient assez de réactifs pour 20 tests. Ein In-situ-Hybridisierungsassay unter direkter Fluoreszenz für die quantitative Bestimmung der HER2-Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Mammakarzinom-Schnitten und FFPE-Proben von Patienten mit Magen- Adenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs. Der Assay ist als zusätzlich zu HercepTest für die Bewertung von Patientinnen indiziert, für die eine Behandlung mit Herceptin in Erwägung gezogen wird. Der Kitinhalt ist für 20 Tests ausreichend. ( ) K /EFG/ULH/ p. 1/148

2 Contents/ Sommaire/ Inhalt ENGLISH8 Page/ Page/ Seite Intended Use... 8 Summary and Explanation - Breast... 9 Principle of Procedure - Breast... 9 Reagents - Breast... 9 Materials provided... 9 Materials required but not provided Precautions - Breast Storage - Breast Specimen Preparation - Breast Paraffin-embedded sections INSTRUCTIONS FOR USE - Breast A. Reagent Preparation - Breast A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Ethanol series B. Staining Procedure - Breast B.1 Procedural notes B.2 Treatment of tissues prior to staining B.3 Staining protocol Quality Control - Breast Interpretation of Staining - Breast Limitations - Breast Performance Characteristics - Breast Hybridization efficacy Analytical sensitivity Analytical specificity Robustness studies Repeatability Reproducibility Assay portability Clinical utility Troubleshooting - Breast Appendix 1 - Breast Appendix 2 - Breast Appendix 3 - Breast Summary and Explanation - Gastric Principle of Procedure - Gastric Reagents - Gastric Materials provided ( ) K /EFG/ULH/ p. 2/148

3 Materials required but not provided Microscope equipment and accessories Precautions - Gastric Storage - Gastric Specimen Preparation - Gastric Paraffin-embedded sections INSTRUCTIONS FOR USE - Gastric A. Reagent Preparation - Gastric A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Ethanol series B. Staining Procedure - Gastric B.1 Procedural notes B.2 Treatment of tissues prior to staining B.3 Staining protocol Quality Control - Gastric Interpretation of Staining - Gastric Limitations - Gastric Performance Characteristics - Gastric Analytical sensitivity Analytical specificity Robustness studies Repeatability Reproducibility Hybridization efficacy Troubleshooting - Gastric Appendix 4 - Gastric Appendix 5 - Gastric Appendix 6 - Gastric Appendix 7 - Gastric References Explanation of symbols ( ) K /EFG/ULH/ p. 3/148

4 FRANÇAIS Intérêt Résumé et explication Sein Principe de la procédure Sein Réactifs Sein Matériel fourni Matériel requis mais non fourni Précautions - Sein Conservation Sein Préparation des échantillons Sein Coupes incluses en paraffine INSTRUCTIONS D UTILISATION Sein A. Préparation des réactifs Sein A.1 Solution de prétraitement A.2 Tampon de lavage stringent A.3 Tampon de lavage A.4 Série de bains d éthanol B. Procédure de coloration Sein B.1 Remarques sur la procédure B.2 Traitement des tissus avant coloration B.3 Protocole de coloration Contrôle de qualité Sein Interprétation de la coloration Sein Limites Sein Caractéristiques de performance Sein Efficacité de l hybridation Sensibilité analytique Spécificité analytique Études de robustesse Répétabilité Reproductibilité Transférabilité du test Utilité clinique Dépannage Sein Annexe 1 Sein Annexe 2 Sein Annexe 3 Sein Résumé et explication Estomac Principe de la procédure Estomac Réactifs Estomac Matériel fourni Matériel requis mais non fourni ( ) K /EFG/ULH/ p. 4/148

5 Précautions Estomac Conservation Estomac Préparation des échantillons Estomac Coupes incluses en paraffine INSTRUCTIONS D UTILISATION Estomac A. Préparation des réactifs Estomac A.1 Solution de prétraitement A.2 Tampon de lavage stringent A.3 Tampon de lavage A.4 Série de bains d éthanol B. Procédure de coloration Estomac B.1 Remarques sur la procédure B.2 Traitement des tissus avant coloration B.3 Protocole de coloration Contrôle de qualité Estomac Interprétation de la coloration Estomac Limites Estomac Caractéristiques de performance Estomac Sensibilité analytique Spécificité analytique Études de robustesse Répétabilité Reproductibilité Efficacité de l hybridation Dépannage Estomac Annexe 4 Estomac Annexe 5 Estomac Annexe 6 Estomac Annexe 7 Estomac Références Explication des symboles ( ) K /EFG/ULH/ p. 5/148

6 DEUTSCH Verwendungszweck Zusammenfassung und Erläuterung - Brustkrebs Prinzip des Testverfahrens - Brustkrebs Reagenzien - Brustkrebs Mitgelieferte Materialien Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Vorsichtsmaßnahmen - Brustkrebs Aufbewahrung - Brustkrebs Probenvorbereitung - Brustkrebs Paraffineingebettete Schnitte GEBRAUCHSANWEISUNG - Brustkrebs A. Vorbereitung der Reagenzien - Brustkrebs A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Ethanol-Reihe B. Färbeverfahren - Brustkrebs B.1 Verfahrenshinweise B.2 Behandlung der Gewebeproben vor dem Färben B.3 Färbeprotokoll Qualitätskontrolle - Brustkrebs Interpretation des Anfärbens - Brustkrebs Beschränkungen - Brustkrebs Leistungsmerkmale - Brustkrebs Hybridisierungseffizienz Analytische Empfindlichkeit Analytische Spezifizität Studien zur Robustheit Wiederholbarkeit Reproduzierbarkeit Portabilität des Assays Klinische Nützlichkeit Fehlersuche Brustkrebs Anhang 1 - Brustkrebs Anhang 2 - Brustkrebs Anhang 3 - Brustkrebs Zusammenfassung und Erläuterung - Magenkarzinom Prinzip des Testverfahrens - Magenkarzinom Reagenzien - Magenkarzinom Mitgelieferte Materialien ( ) K /EFG/ULH/ p. 6/148

7 Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Vorsichtsmaßnahmen - Magenkarzinom Aufbewahrung - Magenkarzinom Probenvorbereitung - Magenkarzinom Paraffineingebettete Schnitte GEBRAUCHSANWEISUNG - Magenkarzinom A. Vorbereitung der Reagenzien - Magenkarzinom A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Ethanol-Reihe B. Färbeverfahren - Magenkarzinom B.1 Verfahrenshinweise B.2 Behandlung der Gewebeproben vor dem Färben B.3 Färbeprotokoll Qualitätskontrolle - Magenkarzinom Interpretation des Anfärbens - Magenkarzinom Beschränkungen - Magenkarzinom Leistungsmerkmale - Magenkarzinom Analytische Empfindlichkeit Analytische Spezifizität Studien zur Robustheit Wiederholbarkeit Reproduzierbarkeit Hybridisierungseffizienz Fehlersuche - Magenkarzinom Anhang 4 - Magenkarzinom Anhang 5 - Magenkarzinom Anhang 6 - Magenkarzinom Anhang 7 - Magenkarzinom Literatur Erläuterung der Symbole ( ) K /EFG/ULH/ p. 7/148

8 ENGLISH Intended Use HER2 FISH pharmdx Kit is a direct fluorescence in situ hybridization (FISH) assay designed to quantitatively determine HER2 gene amplification in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) breast cancer tissue specimens and FFPE specimens from patients with adenocarcinoma of the stomach including gastro-esophageal junction. HER2 FISH pharmdx Kit is indicated in adjunction to HercepTest in the assessment of patients for whom Herceptin (trastuzumab) treatment is being considered (see Herceptin package insert). For breast cancer patients, results from the HER2 FISH pharmdx Kit are intended for use as an adjunct to the clinicopathologic information currently used for estimating prognosis in stage II, node-positive breast cancer patients. Adenocarcinoma of the stomach including gastro-esophageal junction is also referred to as gastric cancer in this document For breast cancer application, please refer to pages For gastric cancer application, please refer to pages Important: Please note differences for breast cancer tissue and gastric cancer tissue especially in the Interpretation of Staining Sections ( ) K /EFG/ULH/ p. 8/148

9 Breast Cancer Summary and Explanation - Breast The human HER2 gene (also known as ERBB2 or NEU) is located on chromosome 17 and encodes the HER2 protein or p185 HER2. The HER2 protein is a membrane receptor tyrosine kinase with homology to the epidermal growth factor receptor (EGFR or HER1) (1-2). The HER2 gene is present in 2 copies in all normal diploid cells. In a fraction of patients with breast cancer, the HER2 gene is amplified as part of the process of malignant transformation and tumor progression (3-8). HER2 gene amplification generally leads to overexpression of the HER2 protein on the surface of breast cancer cells (9). Amplification of the HER2 gene and/or overexpression of its protein have been demonstrated in 25-30% of breast cancers. This up-regulation is associated with poor prognosis, increased risk of recurrence, and shortened survival. Several studies have shown that HER2 status correlates with sensitivity or resistance to certain chemotherapy regimens (10). Demonstration of high HER2 protein overexpression or HER2 gene amplification is essential for initiating therapy with Herceptin, a monoclonal antibody to HER2 protein. Clinical studies have shown that patients whose tumors have high HER2 protein overexpression and/or amplification of the HER2 gene benefit most from Herceptin (11). Principle of Procedure - Breast HER2 FISH pharmdx Kit contains all reagents required to complete a FISH procedure for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue section specimens. After deparaffinization and rehydration, specimens are heated in Pre-Treatment Solution for 10 minutes. The next step involves a proteolytic digestion using ready-to-use Pepsin either at room temperature or at 37 C. Optimal Pepsin incubation time depends on the fixation history of the tissue and should be determined by the user but 10 minutes at room temperature or 3 minutes at 37 C will be suitable for most specimens. Following the heating and proteolytic pre-treatment steps, this kit employs a ready-to-use FISH Probe Mix based on a combination of PNA (peptide nucleic acid) (12) and DNA technology. This Probe Mix consists of a mixture of Texas Red-labelled DNA probes covering a 218 kb region including the HER2 gene on chromosome 17, and a mixture of fluorescein-labelled PNA probes targeted at the centromeric region of chromosome 17 (CEN-17). The specific hybridization to the two targets results in formation of a distinct red fluorescent signal at each HER2 gene locus and a distinct green fluorescent signal at each chromosome 17 centromere. To diminish background staining, the Probe Mix also contains unlabelled PNA blocking probes. After a stringent wash, the specimens are mounted with Fluorescence Mounting Medium containing DAPI and coverslipped. Using a fluorescence microscope equipped with appropriate filters (see Appendix 3), tumor cells are located, and enumeration of the red (HER2) and green (CEN-17) signals is conducted. Then the HER2/CEN-17 ratio is calculated. Normal cells in the analyzed tissue section will serve as an internal positive control of pre-treatment and hybridization efficiency. For details see the Interpretation of Staining section. For interactive e-learning please use the HER2 FISH pharmdx e-learning program designed to supply laboratory technicians, pathologists and scientists with an accurate and fast knowledge of how to achieve optimal results using HER2 FISH pharmdx Kit: Reagents - Breast Materials provided The materials listed below are sufficient for 20 tests (a test is defined as one 22 mm x 22 mm target area). The number of tests is based on the use of 5 8 drops (250 µl per slide of Vial 2, 10 µl per slide of Vial 3, and 15 µl per slide of Vial 5). The kit provides materials sufficient for 10 individual staining runs. ( ) K /EFG/ULH/ p. 9/148

10 Breast Cancer HER2 FISH pharmdx Kit is shipped on dry ice. To ensure that kit components have not been exposed to high temperatures during transport, dry ice should still be present upon receipt. Note that some kit components may remain unfrozen, this will not affect the performance of the HER2 FISH pharmdx Kit. Vial 1 Vial 2 Vial 3 Vial 4 Vial 5 Vial 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentrated 20x MES (2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid) buffer. Pepsin 7.5 ml, ready-to-use Pepsin solution, ph 2.0; contains stabilizer and an antimicrobial agent. HER2/CEN-17 Probe Mix 0.2 ml, ready-to-use Mix of Texas Red-labelled HER2 DNA probes and fluorescein-labelled CEN-17 PNA probes; supplied in hybridization buffer with 45% formamide, stabilizer, and unlabelled PNA blocking probes. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentrated 20x SSC (saline-sodium citrate) buffer with detergent. Fluorescence Mounting Medium 0.3 ml, ready-to-use Fluorescence mounting medium with 100 µg/l DAPI (4,6-diamidine-2-phenylindole). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentrated 20x Tris/HCl buffer. Coverslip Sealant 1 tube, ready-to-use Solution for removable sealing of coverslips. NOTE: All reagents, including Pre-Treatment Solution, Stringent Wash Buffer, and Fluorescence Mounting Medium, are formulated specifically for use with this kit. Materials required but not provided Laboratory reagents Distilled or deionized water Ethanol, 96% Xylene or xylene substitutes Laboratory equipment Absorbent wipes Adjustable pipettes ( ) K /EFG/ULH/ p. 10/148

11 Calibrated partial immersion thermometer (range C) Breast Cancer Calibrated surface thermometer (range C) Coverslips (22 mm x 22 mm) Forceps Fume hood Dako Hybridizer (Code S2450 or S2451)* Slides, Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-l-lysine-coated slides (see Specimen Preparation) Staining jars or baths Timer (capable of 2 15 minute intervals) Water bath with lid (capable of maintaining 65 C to 99 C) Microwave oven with sensing capability if pre-treatment is performed using microwave oven (see B3. Staining protocol. Step 1: Pre-treatment, Method B) * Heating block or hybridization oven for denaturation (82 (±2) C) and hybridization (45 (±2) C) together with a humid hybridization chamber can be used as an alternative to Dako Hybridizer. Microscope equipment and accessories Filters for fluorescence microscope: DAPI and FITC/Texas Red double filter, or FITC and Texas Red mono filters - see Appendix 3 for details Fluorescence microscope with a 100 watt mercury lamp is recommended Microscope slide folder (cardboard tray for 20 slides with hinged cover or similar) Precautions - Breast 1. For in vitro diagnostic use. 2. For professional users. 3. Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), contains 1-<20% 2-morpholinoethanesulphonic acid; Vial 2, Pepsin, contains 5 10% propan-2-ol; Vial 4, Stringent Wash Buffer (20x), contains 1-<5% octoxinol; and Vial 6, Wash Buffer (20x), contains 1-<20% trometamol. At product concentrations these substances do not require hazard labelling. Material Safety Data Sheets (MSDSs) are available for professional users on request. 4. Vial 2, Pepsin, contains pepsin A that may cause an allergic reaction. 5. Vial 3, HER2/CEN-17 Probe Mix contains 45% formamide and is labelled: Toxic. R61 May cause harm to the unborn child. S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show label where possible). S53 Avoid exposure obtain special instructions before use. S60 This material and/or its container must be disposed of as hazardous waste. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 6. Coverslip Sealant contains % naphtha (petroleum), hydrotreated light, and is labelled: Extremely flammable. Dangerous for the environment. R11 Highly flammable. R51/53 Toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. S9 Keep container in a well-ventilated place. S16 Keep away from sources of ignition No smoking. S35 This material and its container must be disposed of in a safe way. S57 Use appropriate container to avoid environmental contamination. ( ) K /EFG/ULH/ p. 11/148

12 Breast Cancer S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheets. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 7. Specimens, before and after fixation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection and should be disposed of with proper precautions (13). Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens. If reagents come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. 8. Minimize microbial contamination of reagents to avoid erroneous results. 9. Incubation times and temperatures, or methods other than those specified, may give erroneous results. 10. Tissue fixation methods and thickness of specimen other than those specified may affect tissue morphology and/or signal intensity. 11. Avoid evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization by ensuring sufficient humidity in the hybridization chamber. 12. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of performance. 13. Wear appropriate personal protective equipment to avoid contact with eyes and skin. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. Storage - Breast Store in the dark at 2 8 C. All reagents tolerate frozen storage. Freezing and thawing the reagents for each analysis does not affect performance. The Pepsin, HER2/CEN-17 Probe Mix, and Fluorescence Mounting Medium (Vials 2, 3 and 5) may be affected adversely if exposed to heat. Do not leave these components at room temperature. The HER2/CEN-17 Probe Mix and Fluorescence Mounting Medium (Vials 3 and 5) may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store these components or perform analysis in strong light, such as direct sunlight. Do not use the kit after the expiration date stamped on the kit box. If reagents are stored under conditions other than those specified in this package insert, the user must validate reagent performance (14). There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, it is important to evaluate normal cells in the analyzed tissue section. If an unexpected fluorescence pattern is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem with the HER2 FISH pharmdx Kit is suspected, contact our Technical Services. Specimen Preparation - Breast Specimens from biopsies, excisions or resections must be handled to preserve the tissue for FISH analysis. Standard methods of tissue processing for immunocytochemical staining should be used for all specimens (15). Paraffin-embedded sections Only tissue preserved in neutral buffered formalin and paraffin-embedded are suitable for use. Specimens should e.g. be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for hours in neutral buffered formalin. The tissues are then dehydrated in a graded series of ethanol and xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 C. Properly fixed and embedded tissues will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15-25 C) (15-16). Other fixatives are not suitable. Tissue specimens should be cut into sections of 4-6 µm. The slides required for HER2 gene amplification analysis and verification of tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 2 serial sections is recommended, 1 section for tumor presence stained with hematoxylin and eosin (H&E stain), and 1 section for HER2 gene amplification analysis. It is recommended that tissue sections are mounted on Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-l-lysine-coated slides. Specimens should be analyzed within 4-6 months of sectioning when stored at room temperature (20 25 C). ( ) K /EFG/ULH/ p. 12/148

13 Breast Cancer INSTRUCTIONS FOR USE - Breast A. Reagent Preparation - Breast It is convenient to prepare the following reagents prior to staining: A.1 Pre-Treatment Solution Crystals may occur in Vial 1, but they will dissolve at room temperature. Ensure that no crystals are present before preparation of reagent. Dilute a sufficient quantity of Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted solution may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted solution if cloudy in appearance. A.2 Stringent Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 4 (Stringent Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.3 Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 6 (Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.4 Ethanol series From a 96% ethanol solution, prepare 3 jars with 70%, 85%, and 96% ethanol, respectively. Store covered jars at room temperature or at 2 8 C, and use for a maximum of 200 slides. Discard solutions if cloudy in appearance. B. Staining Procedure - Breast B.1 Procedural notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components prior to use (see Precautions). If kit components are stored frozen, it is recommended to move the reagents to 2 8 C the day before performing the analysis to allow proper temperature equilibration. All reagents should be equilibrated to the relevant temperature prior to use as follows: Vial 1: The diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to C if water bath is used for pre-treatment (B3. Staining protocol, Step 1: Pre-Treatment Method A). If microwave oven with sensing capability is used for pre-treatment (B3. Staining protocol, Step 1: Pre- Treatment,Method B) the diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to room temperature C. Vial 2: Pepsin should be applied at 2 8 C and kept cold continuously. Vial 3: HER2/CEN-17 Probe Mix may be applied at any temperature from 2 25 C. Vial 4: The Diluted Stringent Wash Buffer; one jar should be equilibrated to room temperature, another jar to 65 C prior to use. Vial 5: Fluorescence Mounting Medium may be applied at any temperature from 2 25 C. Vial 6: The Diluted Wash Buffer should be equilibrated to room temperate C. The Coverslip Sealant may be applied at any temperature from 2 25 C. All steps must be performed at the outlined temperature. ( ) K /EFG/ULH/ p. 13/148

14 Breast Cancer The procedure includes a number of dehydrations followed by drying of the tissue sections. Ensure that tissue sections are completely dry before proceeding to the next step. Do not allow tissue sections to dry during the other procedural steps. If the staining procedure has to be interrupted, slides may be kept in Wash Buffer after the deparaffinization step for up to 1 hour at room temperature (20 25 C) without affecting the results. B.2 Treatment of tissues prior to staining Deparaffinization and rehydration: Prior to performing the analysis, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased non-specific staining. This step should be performed at room temperature (20 25 C). 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 2. Tap off excess liquid and place slides in 96% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 3. Tap off excess liquid and place slides in 70% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 4. Tap off excess liquid and place slides in diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for a minimum of 2 minutes. Commence staining procedure as outlined in Section B.3, Step 1, Pre-Treatment. Xylene and alcohol solutions should be changed after 200 slides or less. Xylene substitutes may be used. NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may invalidate the assay results. B.3 Staining protocol DAY 1 Step 1: Pre-Treatment Pre-treatment can be performed either by using water bath as described in method A) or, alternatively, by use of microwave oven with sensing capability as described in method B). Method A) Pre-treatment using water bath: Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Pre-Treatment Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing Pre-Treatment Solution in water bath. Heat water bath and the Pre-Treatment Solution to C. Measure temperature inside jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Cover jars with lids in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Immerse the room temperature deparaffinized sections into the preheated Pre-Treatment Solution in the staining jars. Re-check temperature and incubate for 10 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Remove lid and allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Method B) Pre-treatment using microwave oven with sensing capability: Fill a plastic jar with diluted room temperature (20 25 C) Pre-Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution, cover the jar with a punctured lid and place it in the microwave oven. Select the boiling sensor function and a program that runs for 10 minutes after boiling temperature has been reached*. ( ) K /EFG/ULH/ p. 14/148

15 Breast Cancer Following the 10 minutes incubation take the jar with slides out of the oven, remove the lid and cool for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer and soak for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. * The use of a microwave oven with a sensing capability means that the oven must include a sensor and programs which initially heat the Pre-Treatment Solution to the boiling point and subsequently maintain the required pretreatment temperature (above 95 ºC) while counting down the preset time (10 (±1) minutes). Some microwave oven models with sensing capability may not include the possibility to freely set a count-down time. If the model only includes pre-set programs, be sure to select a program which maintain the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) for at least 10 (±1) minutes and manually stop the program after 10 (±1) minutes. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use application only. Do not re-use. Step 2: Pepsin, ready-to-use Pepsin incubation can be performed either at room temperature (20 25 C) as described in method A) or, alternatively, at 37 C as described in method B). Tap off excess buffer. Using lintless tissue (such as an absorbent wipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area. Apply 5 8 drops (250 µl) of cold (2 8 C) Pepsin (Vial 2) to cover specimen. Always store Pepsin at 2 8 C. Method A) Incubation at room temperature; Incubate for 5-15 minutes at room temperature (20 25 C). An incubation time of 10 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Method B) Incubation at 37 C; Place specimen with Pepsin on a heating block at 37 C e.g. Dako Hybridizer and incubate for 3 minutes. An incubation time of 3 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and should be determined by the user. Tap off Pepsin and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to air dry completely. Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix, ready-to-use The following step should be performed in a fume hood. Apply 10 µl of HER2/CEN-17 Probe Mix (Vial 3) to the centre of the tissue section. Immediately place a 22 mm x 22 mm glass coverslip over the Probe Mix and allow it to spread evenly under the coverslip. Avoid air bubbles. If air bubbles are observed, gently tap them away from the tissue using forceps. Seal coverslip with Coverslip Sealant by ejecting the Sealant around the periphery of the coverslip. Allow the Coverslip Sealant to overlap the coverslip and the slide, thereby forming a seal around the coverslip. Make sure that the Coverslip Sealant covers the entire edge of the coverslip. Prepare Dako Hybridizer* (Code S2450 or S2451) for a hybridization run. Make sure that Humidity Control Strips (Code S2452) are saturated and optimal for use. Start the Hybridizer and choose a program that will denature at 82 C for 5 minutes and hybridize overnight (14 20 hours) at 45 C (please refer to Dako Hybridizer Instruction Manual for details). Place slides in the Hybridizer, make sure the lid is properly closed and start program. * Instrumentation that allows for conditions similar to the ones described above may be used for denaturation and hybridization: ( ) K /EFG/ULH/ p. 15/148

16 Breast Cancer Place slides on a flat metal or stone surface (heating block or on a block in a hybridization oven) preheated to 82 (±2) C. Denature for 5 minutes ensuring that the temperature of the block does not drop below 80 C at any time. Place slides in a preheated humidified hybridization chamber. Cover the chamber with a lid and incubate overnight (14 20 hours) at 45 (±2) C. Please note that a hybridization temperature of 37 C is not suitable for use with the probes contained within this kit. DAY 2 Step 4: Stringent Wash Fill two staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Stringent Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). A minimum volume of 100 ml or 15 ml per slide in each jar is recommended. Place one of the staining jars containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature in a fume hood and the other in a water bath. Heat water bath and the diluted Stringent Wash Buffer to 65 C. Ensure that the temperature has stabilized. Cover jar with lid in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Measure temperature inside the water bath jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. The Stringent Wash Buffer contains detergent and may become turbid at 65 C; this will not affect performance. Using forceps or gloves, take slides from the hybridization chamber and gently remove Coverslip Sealant as well as coverslip and place slides in the room temperature pre-wash jar, one at a time. As soon as all coverslips have been removed, transfer slides from the room temperature, prewash jar to the 65 C jar in the water bath. Perform stringent wash for exactly 10 minutes at 65 C. Remove slides from the diluted Stringent Wash Buffer, and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Change diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to dry completely. Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium containing DAPI (Vial 5) to the target area of the slide and apply a glass coverslip. NOTE: Slides may be read after 15 minutes or within 7 days after mounting. However, fading occurs if slides are exposed to light or high temperatures. To minimize fading, store slides in the dark at 2 8 C. ( ) K /EFG/ULH/ p. 16/148

17 Quality Control - Breast 1. Signals must be bright, distinct and easy to evaluate. 2. Normal cells allow for an internal control of the staining run. Breast Cancer Normal cells should have 1-2 clearly visible green signals indicating that the CEN-17 PNA Probe has successfully hybridized to the centromeric region of chromosome 17. Normal cells should also have 1-2 clearly visible red signals indicating that the HER2 DNA Probe has successfully hybridized to the HER2 amplicon. Due to tissue sectioning, some normal cells will have less than the expected 2 signals of each colour. Failure to detect signals in normal cells indicates assay failure, and results should be considered invalid. 3. Nuclear morphology must be intact when evaluated using a DAPI filter. Numerous ghost-like cells and a general poor nuclear morphology indicate over-digestion of the specimen, resulting in loss or fragmentation of signals. Such specimens should be considered invalid. 4. Differences in tissue fixation, processing, and embedding in the user s laboratory may produce variability in results, necessitating regular evaluation of in-house controls. Interpretation of Staining - Breast Assessable tissue Only specimens from patients with invasive carcinoma should be tested. In cases with carcinoma in situ and invasive carcinoma in the same specimen, only the invasive component should be scored. Avoid areas of necrosis and areas where the nuclear borders are ambiguous. Do not include nuclei that require subjective judgement. Skip nuclei with weak signal intensity and nonspecific or high background. Signal enumeration: Locate the tumor within the context of the H&E stained slide and evaluate the same area on the FISH stained slide. Scan several areas of tumor cells to account for possible heterogeneity. Select an area having good nuclei distribution. Begin analysis in the upper left quadrant of the selected area and, scanning from left to right, count the number of signals within the nuclear boundary of each evaluated nucleus according to the guidelines below (see also Appendix 3). - Focus up and down to find all of the signals in the individual nucleus. - Count two signals that are the same size and separated by a distance equal to or less than the diameter of the signal as only one signal. - In nuclei with high levels of HER2 gene amplification, the HER2 signals may be positioned very close to each other forming a cluster of signals. In these cases the number of HER2 signals cannot be counted, but must be estimated. Special attention must be paid to the green signals, as clusters of HER2 signals can cover the green signals making them impossible to see. In case of doubt, please check the green signals using a specific FITC filter. Do not score nuclei without signals or with signals of only one colour. Score only those nuclei with one or more FISH signals of each colour. ( ) K /EFG/ULH/ p. 17/148

18 Breast Cancer Signal counting guide 1 Do not count. Nuclei are overlapping, not all areas of nuclei are visible 2 Two green signals, do not score nuclei with signals of only one color 3 Count as 3 green and 12 red signals (cluster estimation) 4 Count as 1 green and 1 red signal. Two signals of the same size and separated by a distance equal to or less than the diameter of one signal are counted as one 5 Do not count (over- or underdigested nuclei). or Missing signals in the centre of nuclei (donut-shaped nuclei). 6 Count as 2 green and 3 red signals. Two signals of the same size and separated by a distance equal to or less than the diameter of one signal are counted as one 7 Count as 1 green and 5 red signals 8 Count as 3 green (1 green out of focus) and 3 red signals 9 Cluster of red signals hiding green signals, check the green signals with a specific FITC filter, or do not count Record counts in a table as shown in Appendix 2. Count 20 nuclei per tissue specimen, when possible from distinct tumor areas (17). Calculate the HER2/CEN-17 ratio by dividing the total number of red HER2 signals by the total number of green CEN-17 signals. Specimens with a HER2/CEN-17 ratio above or equal to 2 should be considered HER2 gene amplified (5, 17-19). Results at or near the cut-off ( ) should be interpreted with caution. If the ratio is borderline ( ), count an additional 20 nuclei and recalculate the ratio for the 40 nuclei. In case of doubt, the specimen slide should be re-scored. For borderline cases a consultation between the pathologist and the treating physician is warranted. ( ) K /EFG/ULH/ p. 18/148

19 Breast Cancer Limitations - Breast 1. FISH is a multi-step process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents, as well as in tissue selection, fixation, and processing, preparation of the FISH slide, and interpretation of the staining results. 2. FISH results are dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may influence on probe hybridization. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. 3. For optimal and reproducible results, the tissue slides must be deparaffinized completely. The paraffin removal needs to be completed at the beginning of the staining process. (See INSTRUCTIONS FOR USE, section B.2). 4. Only temperature-calibrated water bath, heating block, and hybridization oven should used. Use of other types of equipment may result in evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization and must be validated by user. Performance Characteristics - Breast Hybridization efficacy Hybridization efficacy of the HER2 FISH pharmdx Kit was investigated at a routine pathology laboratory. 126 formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections were tested using the recommended procedure. Out of the 126 specimens, 124 could be scored according to the product guidelines, while 2 specimens could not be scored owing to technical reasons. Thus, the hybridization efficacy was 124/126 = 98% (20). Analytical sensitivity The sensitivity of the HER2/CEN-17 Probe Mix was investigated using 1 cell line with and 2 cell lines without amplification of the HER2 gene. The ratio between the number of HER2 signals and CEN-17 signals was calculated based on a counting of 60 nuclei per cell line. The amplified cell line was scored as amplified with an average ratio of 3.21, while the 2 nonamplified cell lines were scored as non-amplified with average ratios of 0.96 and Furthermore, the HER2/CEN-17 ratios of 5 HER2 gene non-amplified tissue sections were determined with the HER2 FISH pharmdx Kit. Each tissue section was scored by 3 independent technicians. Results are presented in Table 1. Table 1. HER2/CEN-17 ratios in 5 non-amplified tissues scored by 3 independent technicians Tissue 1 Tissue 2 Tissue 3 Tissue 4 Tissue 5 Technician Technician Technician Mean ratio CV% CV: Coefficient of variation The study confirmed all 5 tissue sections to be non-amplified with a mean HER2/CEN-17 ratio close to 1.0. ( ) K /EFG/ULH/ p. 19/148

20 Breast Cancer Analytical specificity The HER2 DNA probes in the HER2/CEN-17 Probe Mix have been end-sequenced and mapped to confirm a total coverage of 218 kb including the HER2 gene. The CEN-17 PNA probes in the HER2/CEN-17 Probe Mix have been tested individually and in combination to confirm their specific hybridization to the centromeric region of chromosome 17. To exclude cross-hybridization to chromosomes other than chromosome 17, studies were performed on metaphase spreads according to standard Dako QC procedures. A total of 250 metaphase spreads were evaluated for specific hybridization of the HER2 DNA and CEN-17 PNA probe mixes. In all 250 cases the hybridization was specific for chromosome 17. No crosshybridization to loci on other chromosomes was observed in any of the 250 cases. Robustness studies The robustness of the HER2 FISH pharmdx assay was tested by varying pre-treatment time and temperature, pepsin incubation time, denaturation temperature, hybridization time and temperature, and stringent wash time and temperature. No significant difference in results was observed at the following experimental conditions: Pretreatment at 7, 10 and 13 minutes combined with each of the temperatures 89, 92 and C. Pepsin incubation times of 2, 5, 10, 15 and 18 minutes. Denaturation temperatures of 72, 77, 82, 87 and 92 C. Hybridization time of 17 hours combined with each of the temperatures 40, 45 and 50 C. Hybridization times of 10, 12 and 14 hours at a temperature of 45 C. The stringent wash was tested for 10 minutes at 60, 65 and 70 C. Additionally, the stringent wash was tested for 5, 10 and 15 minutes at 65 C. Stringent wash for 10 minutes at 70 C, and stringent wash for 15 minutes at 65 C resulted in loss of signals, whereas no significant difference in results was observed at the other time/temperature combinations. Repeatability The repeatability of the HER2/CEN-17 ratio was investigated with the HER2 FISH pharmdx Kit using consecutive sections of normal breast tissue and breast carcinoma. The coefficient of variation for normal breast tissue was found to be 6% and 4% for breast carcinoma. A total of 10 consecutive sections of breast cancer tissue with different thickness (duplicates of 3, 4, 5, 6, and 7 µl) were tested with the HER2 FISH pharmdx Kit. The coefficient of variation of the HER2/CEN-17 ratio in this study was found to be 12%, i.e. higher than for tissue sections of equal thickness. Reproducibility The HER2 FISH pharmdx Kit was tested for lot-to-lot, day-to-day and observer-to-observer reproducibility using 3 different formalin-fixed and paraffin-embedded cell lines (the non-amplified MDA-231 and MDA-175, and the HER2 gene amplified SKBR3). The greatest HER2/CEN-17 ratio variation (8%) was found in the observer-to-observer study on the amplified cell line. This might be expected and possibly reflects a certain subjectivity in signal interpretation and enumeration. Results expressed as mean ratio, standard deviation, and coefficient of variation are presented in Tables 2-4. ( ) K /EFG/ULH/ p. 20/148

21 Breast Cancer Table 2. Lot-to-lot reproducibility. HER2/CEN-17 ratio measured for 3 different lots of HER2 FISH pharmdx Kit Cell line HER2/CEN-17 ratio Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Total MDA-231 Mean SD CV% N MDA-175 Mean SD CV% N SKBR3 Mean SD CV% N SD: Standard deviation CV: Coefficient of variation N: number of slides Table 3. Day-to-day reproducibility. HER2/CEN-17 ratio measured on 4 different days Cell line HER2/CEN-17 ratio Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Total MDA-231 Mean SD CV% N MDA-175 Mean SD CV% N SKBR3 Mean SD CV% N SD: Standard deviation CV: Coefficient of variation N: Number of slides Table 4. Observer-to-observer reproducibility. HER2/CEN-17 ratio measured by 3 different observers Cell line HER2/CEN-17 ratio Obs. 1 Obs. 2 Obs. 3 Total MDA-231 Mean SD CV% N MDA-175 Mean SD CV% N SKBR3 Mean SD CV N SD: Standard Deviation CV: Coefficient of Variation N. Number of slides ( ) K /EFG/ULH/ p. 21/148

22 Breast Cancer Assay portability To assess interlaboratory reproducibility (assay portability) a blinded, randomized, comparative study of HER2/CEN-17 ratios measured in 4 formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer specimens was conducted involving 5 different study sites. The 4 specimens included in the study represented varying levels of HER2 gene amplification and were selected to reflect a natural range of amplification rates, including a non-amplified (measured ratio ), an altered but nonamplified (measured ratio ), a low-level amplified (measured ratio ), and a high level amplified (measured ratio ). Each site stained and interpreted the 4 specimens in 3 separate runs (total of 12 slides). A provided control was also included in each run. When stratifying results as either HER2 gene amplification positive or negative (cut-off ratio = 2.0), there was complete agreement between the 5 sites, please see Table 5. Table 5. Summary of portability results Specimen HER2 negative HER2 positive Non-amplified 15 0 Altered but non-amplified 15 0 Low-level amplification 0 15 High-level amplification 0 15 A day-to-day variation of 10% was found in the 5 laboratories for the HER2/CEN-17 ratio. A site-to-site variation for the HER2/CEN-17 ratio of approx % was observed for the non-amplified cases and the cases with ratios close to the cut off. This figure is consistent with findings reported in the literature. A higher variation (25%) was observed for the highly amplified specimen; also this is in concordance with the literature, and this variation is not considered clinically relevant (18). As the scoring of highly amplified cases where signals are clustered cannot be based on counting, but must be based on an estimation of the number of signals, a high variation for such cases can be expected. Clinical utility The clinical utility of the Dako HER2 FISH pharmdx Kit was investigated in a comparative study with the Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. The study included 150 archived specimens from patients that had either node-positive or node-negative, grade II-III breast cancer. The primary objective of the study was to investigate the degree of concordance between the HER2/chromosome 17 centromer ratios for the 150 specimens as tested with the Dako and Vysis kits, both regarding the general agreement of the ratios and the agreement of the dichotomized FISH results (+/- groups). A total of 145 specimens were successfully hybridized and scored, and were thereby eligible for statistical analysis. A 2 x 2 cross tabulation of the results is presented in Table 6. ( ) K /EFG/ULH/ p. 22/148

23 Breast Cancer Table 6. Dichotomized results from 145 breast cancer specimens tested with Dako HER2 FISH pharmdx Kit and Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. 60 nuclei in each specimen were scored with each of the two kits. Dako Kit (-) amplified Dako Kit (+) amplified Sum Vysis Kit (-) amplified Vysis Kit (+) amplified Sum The concordance between the Dako and Vysis tests was 95% with a confidence interval of 92-99%. The kappa value was McNemars test for systematic bias between the two tests was not significant (p=0.22). Figure 1 shows a scatter plot of the paired observations for the 145 specimens. Figure breast cancer specimens tested for HER2 gene amplification using Dako HER2 FISH pharmdx Kit and Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Results are expressed as HER2/chromosome 17 centromere ratios. 60 nuclei in each specimen were scored with each of the two kits. 12,00 Scatter Scatter plot plot of paired of paired observations DakoCytomation HER2 FISH HER2 pharmdx FISH pharmdx Kit Kit g 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Kit The general agreement between Dako HER2 FISH pharmdx and Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe tests was investigated using analysis of the difference between paired observations of log (ratio), and a linear regression analysis of log (ratio) of the two tests. It was concluded that ( ) K /EFG/ULH/ p. 23/148

24 Breast Cancer the difference between paired observations of log (ratio) is systematically increasing by the sum of the HER2/chromosome 17 centromere ratios, and that for higher ratios the measured ratio is higher in the Dako test than in the Vysis test. The higher HER2/chromosome 17 centromere ratio observed with the Dako HER2 FISH pharmdx Kit can be related to a true difference between the two tests, e.g. that a higher resolution of the Dako HER2 FISH pharmdx Kit, results in higher ratios for highly HER2 gene amplified cases. However, the testing of the kits was performed at 2 different sites and variation between laboratories is expected. Moreover, a higher variation for highly amplified cases has been reported in the literature, but it is considered not to be clinically relevant (18). The current study does not allow for investigation of a systematic difference between the two tests across multiple laboratories. It should be added that the observed variation between the two tests is of a similar size as the variation between sites observed in the Portability Study. The HER2 FISH method is relatively time consuming, primarily owing to the conventional counting of signals in a considerable number of tumor cells in each specimen. However subset analysis of data generated in the Comparative Study of the Dako HER2 pharmdx Kit and the Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit supports the use of simplified counting methods. Table 7 presents test results obtained when analyzing 145 breast cancer specimens using the Dako HER2 pharmdx Kit, and counting up to 10, 20, 30 and 60 events (signals) in a minimum of 6 cells in each specimen. In addition, Table 7 shows results of statistical analyses of these fixed events counting methods compared with the Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe test and the counting of signals in 60 cells. It should be noted that the counting of a fixed number of events implies that a relatively higher number of nuclei will be counted in specimens with HER2/chromosome 17 centromere ratios around the cut off, than in highly HER2 gene amplified - and thus unambiguously positive - specimens. Table 7. Concordance and kappa values when counting a fixed number of events (signals). Comparison between the counting of 10, 20, 30 and 60 events in the Dako HER2 FISH pharmdx test and the counting of signals in 60 nuclei in the Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe test. All of 145 breast cancer specimens were tested for HER2 gene amplification by all 5 methods. Dako kit ( ) amp. Counting up to 10 events Counting up to 20 events Counting up to 30 events Counting up to 60 events CI: Confidence interval Vysis kit ( ) amplified (N=97) (+) amp. Vysis kit (+) amplified (N=48) ( ) amp. (+) amp. Concordance 95% CI Kappa value McNemar s test (p-value) N: number of specimens Compared to the counting of signals in 60 nuclei, the concordance and kappa values remained unchanged, i.e. with overlapping CI, for all of the 4 investigated fixed-events counting methods. The number of nuclei counted by each fixed-events counting method was investigated. A summary of the results is shown in Table 8. ( ) K /EFG/ULH/ p. 24/148

25 Breast Cancer Table 8. Number of nuclei counted in the 4 fixed-events counting methods Counting method Median number of nuclei Range number of nuclei 90%-fractile number of nuclei Counting up to 10 events Counting up to 20 events Counting up to 30 events Counting up to 60 events The possibility of counting signals in fewer than 60 nuclei was also investigated. The result of this analysis is presented in Table 9. Table 9. Concordance and kappa values when counting a fixed number of cells. Comparison between the counting of signals in 10, 20 and 30 nuclei in the Dako HER2 FISH pharmdx test and the counting of signals in 60 nuclei in the Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe test. All of the 145 breast cancer specimens were tested for HER2 gene amplification by all 4 methods. Vysis kit (-) amplified (N=97) Vysis kit (+) amplified (N=48) Concordance 95% CI Kappa value McNemar s test (p-value) Dako kit (-) amp. (+) amp. (-) amp. (+) amp. Counting 10 nuclei Counting 20 nuclei Counting 30 nuclei CI: Confidence interval N: number of specimens Compared to the counting of signals in 60 nuclei, the concordance and kappa values remained unchanged, i.e. with overlapping CI, for all of the 3 investigated methods counting 10, 20 and 30 nuclei. Thus, the statistical analysis supports scoring of specimens based on counting of signals in 10 nuclei. ( ) K /EFG/ULH/ p. 25/148

26 Troubleshooting - Breast Problem Probable Cause Suggested Action 1. No signals or weak signals 1a. Kit has been exposed to high temperatures during transport or storage 1b. Microscope not functioning properly - Inappropriate filter set - Improper lamp - Mercury lamp too old - Dirty and/or cracked collector lenses - Unsuitable immersion oil 1c. Faded signals 1d. Pre-treatment conditions incorrect 1e. Evaporation of Probe Mix during hybridization 2. No green signals 2a. Stringent wash conditions incorrect 3. No red signals 3a. Pre-treatment conditions incorrect 4. Areas without signal 4a. Probe volume too small 4b. Air bubbles caught during Probe Mix application or mounting Breast Cancer 1a. Check storage conditions. Ensure that dry ice was present when the consignment was received. Ensure that vials 2, 3 and 5 have been stored at maximum 2 8 C, and that vials 3 and 5 have been stored in the dark. 1b. Check the microscope and ensure that the used filters are suitable for use with the kit fluorochromes, and that the mercury lamp is correct and has not been used beyond expected lifetime. (see Appendix 3). In case of doubt, please contact your local microscope vendor. 1c. Avoid long microscopic examination and minimize exposure to strong light sources. 1d. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 1e. Ensure sufficient humidity in the hybridization chamber 2a. Ensure that the recommended stringent wash temperature and time are used, and that coverslips are removed before performing stringent wash 3a. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 4a. Ensure that the probe volume is large enough to cover the area under the coverslip 4b. Avoid air bubbles. If observed, gently tap them away using forceps ( ) K /EFG/ULH/ p. 26/148

27 Problem Probable Cause Suggested Action 5. Excessive background staining 6. Poor tissue morphology 5a. Inappropriate tissue fixation 5b. Paraffin incompletely removed 5c. Stringent wash temperature too low 5d. Prolonged exposure of hybridized section to strong light 6a. Incorrect Pepsin treatment 6b. Incorrect pre-treatment conditions may result in unclear or cloudy appearance 6c. Too long Pepsin treatment or very thin section thickness may cause ghost cells or donut cells to appear. Breast Cancer 5a Ensure that only formalinfixed, paraffin-embedded tissue sections are used 5b. Follow the deparaffinization and rehydration procedures outlined in Section B.2 5c. Ensure that the stringent wash temperature is 65 (±2) C 5d. Avoid long microscopic examination and minimize exposure to strong light 6a. Adhere to recommended Pepsin incubation times. See section B.3, step 2. Ensure that the Pepsin is handled at the correct temperature. See Section B.1 6b. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 6c. Shorten the Pepsin incubation time. See section B.3, step 2. Ensure that the section thickness is 4-6 µm. NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call our Technical Services for further assistance. ( ) K /EFG/ULH/ p. 27/148

28 Breast Cancer Appendix 1 - Breast HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Protocol Checklist Date (Day 1) of the run: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Specimen ID: Equipment ID: Staining Run Log ID: Date of dilution/expiration of the 1 x Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20): / Tissue fixed in neutral buffered formalin Yes No DAY 1 Step 1: Pre-Treatment Date of dilution/expiration of the Pre-Treatment Solution (Vial 1 diluted 1:20) / Measured temperature of Pre-Treatment Solution (95 99 C) if water bath is used for heating Pre-treatment (10 minutes), and cooling (15 minutes) Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Step 2: Pepsin Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at 37 C or Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at room temperature Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Dehydrate slides (3 x 2 minutes) in graded series of ethanol and air dry Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix Apply Probe Mix (Vial 3), coverslip and seal with Coverslip Sealant Measured denaturation temperature (82 ± 2 C) C Denaturation for 5 minutes Measured hybridization temperature (45 ± 2 C) C Hybridization overnight (protect from light) DAY 2 Step 4: Stringent Wash Date of dilution/expiration of the Stringent Wash Buffer (Vial 4 diluted 1:20) / Measured temperature of Stringent Wash Buffer (65 C) C Stringent wash (10 minutes) after removing the coverslips Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Dehydrate slides (3 x 2 minutes) in graded series of ethanol and air dry Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium (Vial 5) and coverslip Comments: C Minutes Minutes Date and signature, Technician: ( ) K /EFG/ULH/ p. 28/148

29 Breast Cancer Appendix 2 - Breast HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Scoring Scheme Date (Day 1) of the run: HER2 FISH pharmdx TM Kit, K5331 Lot: Staining Run Log ID: Specimen ID: Nucleus No. HER2 score (red) Count signals in 20 nuclei CEN-17 score (green) Nucleus No Total (1-10) Total (11-20) HER2 score (red) CEN-17 score (green) For determination of the HER2/CEN-17 ratio, count the number of HER2 signals and the number of CEN-17 signals in the same 20 nuclei and divide the total number of HER2 signals by the total number of CEN-17 signals. If the HER2/CEN-17 ratio is borderline ( ), count an additional 20 nuclei and recalculate the ratio. A ratio at or near the cut-off ( ) should be interpreted with caution (see counting guide). Total score (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 ratio Ratio < 2: HER2 gene amplification was not observed Ratio 2: HER2 gene amplification was observed Date and signature, Technician: Date and signature, Pathologist: For scoring guidelines: see Interpretation of Staining. ( ) K /EFG/ULH/ p. 29/148

30 Breast Cancer Appendix 3 - Breast HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Fluorescence Microscope Specifications Dako recommends the following equipment for use with the HER2 FISH pharmdx Kit, K5331: 1. Microscope type Epifluorescence microscope. 2. Lamp 100 watt mercury lamp (keep record of burning time). 3. Objectives For screening of the tissue, fluorescence dry 10X or fluorescence oil immersion 16X objectives are applicable. For high power magnification and scoring of signals, only fluorescence oil immersion objectives, e.g. 100X are recommended. 4. Filters Filters are individually designed for specific fluorochromes and must be chosen accordingly. Dako recommends the use of a specific DAPI filter in combination with a high quality Texas Red/FITC double filter. DAPI filter, e.g. Chroma filter # Texas Red/FITC double filter, e.g. Chroma filter # Texas Red and FITC single filters can be used for confirmation. Fluorochrome Excitation Wavelength Emission Wavelength FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filters are specific to each microscope type and the use of appropriate filters is crucial for the interpretation. If you want detailed information, please contact your microscope provider or your Dako representative. 5. Oil Non-fluorescing oil. Precautions A 50 watt mercury lamp is not recommended. Rhodamine filters cannot be used. Triple filters are not recommended. A non-optimized microscope may cause problems when reading the fluorescent signals. It is important that the light source has not expired and that it is properly aligned and focused. Customers should monitor and follow the manufacturer s recommendations for the mercury lamp. The microscope should be maintained and the mercury lamp should be in alignment prior to interpreting results. An effort should be made to expose the sample to as little of the excitation light as possible in order to minimize fading of the fluorescence. We recommend that you discuss the set-up of your particular microscope with the manufacturer before starting the fluorescence in situ hybridization, or refer to the literature. ( ) K /EFG/ULH/ p. 30/148

31 Gastric Cancer Summary and Explanation - Gastric The human HER2 gene (also known as ERBB2 or NEU) is located on chromosome 17 and encodes the HER2 protein or p185 HER2. The HER2 protein is a membrane receptor tyrosine kinase with homology to the epidermal growth factor receptor (EGFR or HER1) (1-2). The HER2 gene is present in 2 copies in all normal diploid cells. Overexpression of the HER2 protein and amplification of the HER2 gene in gastric cancer have been shown in a large number of studies (reviewed in (21)). HER2 positivity can be detected in approximately 20 % of the patients by either IHC or FISH (21). Preclinical in vitro and in vivo studies have demonstrated that trastuzumab (Herceptin ) is effective in different gastric cancer models thus leading to the initiation of several clinical studies (21-25). In a phase III study BO18255, the ToGA trial, HER2-positive patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastro-esophageal junction were randomized to receive 5-FU or capecitabine and cisplatin either alone or in combination with trastuzumab. A statistically significant gain in overall survival (OS) was seen in the patients that received the combined treatment of trastuzumab and chemotherapy (26). Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody that binds with high affinity to the HER2 protein and has been shown to inhibit the proliferation of human tumor cells that overexpress HER2 protein in vitro and in vivo (22-25). Principle of Procedure - Gastric HER2 FISH pharmdx Kit contains all reagents required to complete a FISH procedure for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue section specimens. After deparaffinization and rehydration, specimens are heated in Pre-Treatment Solution for 10 minutes. The next step involves a proteolytic digestion using ready-to-use Pepsin either at room temperature or at 37 C. Optimal Pepsin incubation time depends on the fixation history of the tissue and should be determined by the user but 10 minutes at room temperature or 3 minutes at 37 C will be suitable for most specimens. Following the heating and proteolytic pre-treatment steps, this kit employs a ready-to-use FISH Probe Mix based on a combination of PNA (peptide nucleic acid) (12) and DNA technology. This Probe Mix consists of a mixture of Texas Red-labelled DNA probes covering a 218 kb region including the HER2 gene on chromosome 17, and a mixture of fluorescein-labelled PNA probes targeted at the centromeric region of chromosome 17 (CEN-17). The specific hybridization to the two targets results in formation of a distinct red fluorescent signal at each HER2 gene locus and a distinct green fluorescent signal at each chromosome 17 centromere. To diminish background staining, the Probe Mix also contains unlabelled PNA blocking probes. After a stringent wash, the specimens are mounted with Fluorescence Mounting Medium containing DAPI and coverslipped. Using a fluorescence microscope equipped with appropriate filters (see Appendix 3), tumor cells are located, and enumeration of the red (HER2) and green (CEN-17) signals is conducted. Then the HER2/CEN-17 ratio is calculated. Normal cells in the analyzed tissue section will serve as an internal positive control of pre-treatment and hybridization efficiency. For details see the Interpretation of Staining section. For interactive e-learning please use the HER2 FISH pharmdx e-learning program designed to supply laboratory technicians, pathologists and scientists with an accurate and fast knowledge of how to achieve optimal results using HER2 FISH pharmdx Kit: Reagents - Gastric Materials provided The materials listed below are sufficient for 20 tests (a test is defined as one 22 mm x 22 mm target area). The number of tests is based on the use of 5 8 drops (250 µl per slide of Vial 2, 10 µl per slide of Vial 3, and 15 µl per slide of Vial 5). The kit provides materials sufficient for 10 individual staining runs. ( ) K /EFG/ULH/ p. 31/148

32 Gastric Cancer HER2 FISH pharmdx Kit is shipped on dry ice. To ensure that kit components have not been exposed to high temperatures during transport, dry ice should still be present upon receipt. Note that some kit components may remain unfrozen, this will not affect the performance of the HER2 FISH pharmdx Kit. Vial 1 Vial 2 Vial 3 Vial 4 Vial 5 Vial 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentrated 20x MES (2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid) buffer. Pepsin 7.5 ml, ready-to-use Pepsin solution, ph 2.0; contains stabilizer and an antimicrobial agent. HER2/CEN-17 Probe Mix 0.2 ml, ready-to-use Mix of Texas Red-labelled HER2 DNA probes and fluorescein-labelled CEN-17 PNA probes; supplied in hybridization buffer with 45% formamide, stabilizer, and unlabelled PNA blocking probes. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentrated 20x SSC (saline-sodium citrate) buffer with detergent. Fluorescence Mounting Medium 0.3 ml, ready-to-use Fluorescence mounting medium with 100 µg/l DAPI (4,6-diamidine-2-phenylindole). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentrated 20x Tris/HCl buffer. Coverslip Sealant 1 tube, ready-to-use Solution for removable sealing of coverslips. NOTE: All reagents, including Pre-Treatment Solution, Stringent Wash Buffer, and Fluorescence Mounting Medium, are formulated specifically for use with this kit. Materials required but not provided Laboratory reagents Distilled or deionized water Ethanol, 96% Xylene or xylene substitutes Laboratory equipment Absorbent wipes ( ) K /EFG/ULH/ p. 32/148

33 Adjustable pipettes Calibrated partial immersion thermometer (range C) Gastric Cancer Calibrated surface thermometer (range C) Coverslips (22 mm x 22 mm) Forceps Fume hood Dako Hybridizer (Code S2450 or S2451)* Slides, Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-l-lysine-coated slides (see Specimen Preparation) Staining jars or baths Timer (capable of 2 15 minute intervals) Water bath with lid (capable of maintaining 65 C to 99 C) Microwave oven with sensing capability if pre-treatment is performed using microwave oven (see B3. Staining protocol. Step 1: Pre-treatment, Method B) * Heating block or hybridization oven for denaturation (82 (±2) C) and hybridization (45 (±2) C) together with a humid hybridization chamber can be used as an alternative to Dako Hybridizer. Microscope equipment and accessories Filters for fluorescence microscope: DAPI and FITC/Texas Red double filter, or FITC and Texas Red mono filters - see Appendix 3 for details Fluorescence microscope with a 100 watt mercury lamp is recommended Microscope slide folder (cardboard tray for 20 slides with hinged cover or similar) Precautions - Gastric 1. For in vitro diagnostic use. 2. For professional users. 3. Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), contains 1-<20% 2-morpholinoethanesulphonic acid; Vial 2, Pepsin, contains 5 10% propan-2-ol; Vial 4, Stringent Wash Buffer (20x), contains 1-<5% octoxinol; and Vial 6, Wash Buffer (20x), contains 1-<20% trometamol. At product concentrations these substances do not require hazard labelling. Material Safety Data Sheets (MSDSs) are available for professional users on request. 4. Vial 2, Pepsin, contains pepsin A that may cause an allergic reaction. 5. Vial 3, HER2/CEN-17 Probe Mix contains 45% formamide and is labelled: Toxic. R61 May cause harm to the unborn child. S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show label where possible). S53 Avoid exposure obtain special instructions before use. S60 This material and/or its container must be disposed of as hazardous waste. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 6. Coverslip Sealant contains % naphtha (petroleum), hydrotreated light, and is labelled: Extremely flammable. Dangerous for the environment. R11 Highly flammable. R51/53 Toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. S9 Keep container in a well-ventilated place. S16 Keep away from sources of ignition No smoking. ( ) K /EFG/ULH/ p. 33/148

34 Gastric Cancer S35 This material and its container must be disposed of in a safe way. S57 Use appropriate container to avoid environmental contamination. S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheets. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 7. Specimens, before and after fixation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection and should be disposed of with proper precautions (16). Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens. If reagents come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. 8. Minimize microbial contamination of reagents to avoid erroneous results. 9. Incubation times and temperatures, or methods other than those specified, may give erroneous results. 10. Tissue fixation methods and thickness of specimen other than those specified may affect tissue morphology and/or signal intensity. 11. Avoid evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization by ensuring sufficient humidity in the hybridization chamber. 12. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of performance. 13. Wear appropriate personal protective equipment to avoid contact with eyes and skin. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 14. Due to the heterogeneous nature of gastric cancer specimens it is important to perform a thorough scanning of the entire specimen to evaluate signal distribution before selecting the area for signal enumeration. 15. It is not recommended to evaluate very small specimens (i.e. specimens must have intact morphology and sufficient nuclei for enumeration). 16. If HER2 FISH analysis is performed on a biopsy specimen, multiple (7-8) evaluable biopsies from different regions of the tumor should be analyzed to ensure reliable determination of HER2 status. 17. For identification of all tissue cores in a biopsy sample it is important to inspect the H&E stained slide. Storage - Gastric Store in the dark at 2 8 C. All reagents tolerate frozen storage. Freezing and thawing the reagents for each analysis does not affect performance. The Pepsin, HER2/CEN-17 Probe Mix, and Fluorescence Mounting Medium (Vials 2, 3 and 5) may be affected adversely if exposed to heat. Do not leave these components at room temperature. The HER2/CEN-17 Probe Mix and Fluorescence Mounting Medium (Vials 3 and 5) may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store these components or perform analysis in strong light, such as direct sunlight. Do not use the kit after the expiration date stamped on the kit box. If reagents are stored under conditions other than those specified in this package insert, the user must validate reagent performance (13). There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, it is important to evaluate normal cells in the analyzed tissue section. If an unexpected fluorescence pattern is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem with the HER2 FISH pharmdx Kit is suspected, contact our Technical Services. Specimen Preparation - Gastric Adenocarcinoma specimens of the stomach including gastro-esophageal junction from biopsies, excisions or resections must be handled to preserve the tissue for FISH analysis. Standard methods of tissue processing for immunocytochemical staining should be used for all specimens (14). When testing small biopsy specimens, ascertain of intact tumor morphology and the ( ) K /EFG/ULH/ p. 34/148

35 Gastric Cancer presence of sufficient nuclei for signal enumeration. If HER2 FISH analysis is performed on a biopsy specimen, multiple (7-8) evaluable biopsies from different regions of the tumor should be analyzed to ensure reliable determination of HER2 status. Paraffin-embedded sections Only tissue preserved in neutral buffered formalin and paraffin-embedded are suitable for use. Specimens should e.g. be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for hours in neutral buffered formalin. Biopsy specimens were fixed 6-8 hours in the ToGA trial (for study reference, refer to (26)). The tissues are then dehydrated in a graded series of ethanol and xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 C. Properly fixed and embedded tissues will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15-25 C) (14, 15). Other fixatives are not suitable. Tissue specimens should be cut into sections of 3-6 µm. The slides required for HER2 gene amplification analysis and verification of tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 2 serial sections is recommended, 1 section for tumor presence stained with hematoxylin and eosin (H&E stain), and 1 section for HER2 gene amplification analysis. It is recommended that tissue sections are mounted on Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-l-lysine-coated slides. Specimens should be analyzed within 4-6 months of sectioning when stored at room temperature (20 25 C). INSTRUCTIONS FOR USE - Gastric A. Reagent Preparation - Gastric It is convenient to prepare the following reagents prior to staining: A.1 Pre-Treatment Solution Crystals may occur in Vial 1, but they will dissolve at room temperature. Ensure that no crystals are present before preparation of reagent. Dilute a sufficient quantity of Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted solution may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted solution if cloudy in appearance. A.2 Stringent Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 4 (Stringent Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.3 Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 6 (Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2 8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.4 Ethanol series From a 96% ethanol solution, prepare 3 jars with 70%, 85%, and 96% ethanol, respectively. Store covered jars at room temperature or at 2 8 C, and use for a maximum of 200 slides. Discard solutions if cloudy in appearance. B. Staining Procedure - Gastric B.1 Procedural notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components prior to use (see Precautions). ( ) K /EFG/ULH/ p. 35/148

36 Gastric Cancer If kit components are stored frozen, it is recommended to move the reagents to 2 8 C the day before performing the analysis to allow proper temperature equilibration. All reagents should be equilibrated to the relevant temperature prior to use as follows: Vial 1: The diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to C if water bath is used for pre-treatment (B3. Staining protocol, Step 1: Pre-Treatment Method A). If microwave oven with sensing capability is used for pre-treatment (B3. Staining protocol, Step 1: Pre- Treatment,Method B) the diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to room temperature C. Vial 2: Pepsin should be applied at 2 8 C and kept cold continuously. Vial 3: HER2/CEN-17 Probe Mix may be applied at any temperature from 2 25 C. Vial 4: The Diluted Stringent Wash Buffer; one jar should be equilibrated to room temperature, another jar to 65 C prior to use. Vial 5: Fluorescence Mounting Medium may be applied at any temperature from 2 25 C. Vial 6: The Diluted Wash Buffer should be equilibrated to room temperate C. The Coverslip Sealant may be applied at any temperature from 2 25 C. All steps must be performed at the outlined temperature. The procedure includes a number of dehydrations followed by drying of the tissue sections. Ensure that tissue sections are completely dry before proceeding to the next step. Do not allow tissue sections to dry during the other procedural steps. If the staining procedure has to be interrupted, slides may be kept in Wash Buffer after the deparaffinization step for up to 1 hour at room temperature (20 25 C) without affecting the results. B.2 Treatment of tissues prior to staining Deparaffinization and rehydration: Prior to performing the analysis, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased non-specific staining. This step should be performed at room temperature (20 25 C). 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 2. Tap off excess liquid and place slides in 96% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 3. Tap off excess liquid and place slides in 70% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 4. Tap off excess liquid and place slides in diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for a minimum of 2 minutes. Commence staining procedure as outlined in Section B.3, Step 1, Pre-Treatment. Xylene and alcohol solutions should be changed after 200 slides or less. Xylene substitutes may be used. NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may invalidate the assay results. B.3 Staining protocol DAY 1 Step 1: Pre-Treatment Pre-treatment can be performed either by using water bath as described in method A) or, alternatively, by use of microwave oven with sensing capability as described in method B). Method A) Pre-treatment using water bath: ( ) K /EFG/ULH/ p. 36/148

37 Gastric Cancer Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Pre-Treatment Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing Pre-Treatment Solution in water bath. Heat water bath and the Pre-Treatment Solution to C. Measure temperature inside jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Cover jars with lids in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Immerse the room temperature deparaffinized sections into the preheated Pre-Treatment Solution in the staining jars. Re-check temperature and incubate for 10 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Remove lid and allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Method B) Pre-treatment using microwave oven with sensing capability: Fill a plastic jar with diluted room temperature (20 25 C) Pre-Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution, cover the jar with a punctured lid and place it in the microwave oven. Select the boiling sensor function and a program that runs for 10 minutes after boiling temperature has been reached*. Following the 10 minutes incubation take the jar with slides out of the oven, remove the lid and cool for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer and soak for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. * The use of a microwave oven with a sensing capability means that the oven must include a sensor and programs which initially heat the Pre-Treatment Solution to the boiling point and subsequently maintain the required pretreatment temperature (above 95 ºC) while counting down the preset time (10 (±1) minutes). Some microwave oven models with sensing capability may not include the possibility to freely set a count-down time. If the model only includes pre-set programs, be sure to select a program which maintain the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) for at least 10 (±1) minutes and manually stop the program after 10 (±1) minutes. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use application only. Do not re-use. Step 2: Pepsin, ready-to-use Pepsin incubation can be performed either at room temperature (20 25 C) as described in method A) or, alternatively, at 37 C as described in method B). Tap off excess buffer. Using lintless tissue (such as an absorbent wipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area. Apply 5 8 drops (250 µl) of cold (2 8 C) Pepsin (Vial 2) to cover specimen. Always store Pepsin at 2 8 C. Method A) Incubation at room temperature; Incubate for 5-15 minutes at room temperature (20 25 C). An incubation time of 10 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Method B) Incubation at 37 C; Place specimen with Pepsin on a heating block at 37 C e.g. Dako Hybridizer and incubate for 3 minutes. An incubation time of 3 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off Pepsin and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). ( ) K /EFG/ULH/ p. 37/148

38 Gastric Cancer Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to air dry completely. Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix, ready-to-use The following step should be performed in a fume hood. Apply 10 µl of HER2/CEN-17 Probe Mix (Vial 3) to the centre of the tissue section. Immediately place a 22 mm x 22 mm glass coverslip over the Probe Mix and allow it to spread evenly under the coverslip. Avoid air bubbles. If air bubbles are observed, gently tap them away from the tissue using forceps. Seal coverslip with Coverslip Sealant by ejecting the Sealant around the periphery of the coverslip. Allow the Coverslip Sealant to overlap the coverslip and the slide, thereby forming a seal around the coverslip. Make sure that the Coverslip Sealant covers the entire edge of the coverslip. Prepare Dako Hybridizer* (Code S2450 or S2451) for a hybridization run. Make sure that Humidity Control Strips (Code S2452) are saturated and optimal for use. Start the Hybridizer and choose a program that will denature at 82 C for 5 minutes and hybridize overnight (14 20 hours) at 45 C (please refer to Dako Hybridizer Instruction Manual for details). Place slides in the Hybridizer, make sure the lid is properly closed and start program. * Instrumentation that allows for conditions similar to the ones described above may be used for denaturation and hybridization: Place slides on a flat metal or stone surface (heating block or on a block in a hybridization oven) preheated to 82 (±2) C. Denature for 5 minutes ensuring that the temperature of the block does not drop below 80 C at any time. Place slides in a preheated humidified hybridization chamber. Cover the chamber with a lid and incubate overnight (14 20 hours) at 45 (±2) C. Please note that a hybridization temperature of 37 C is not suitable for use with the probes contained within this kit. DAY 2 Step 4: Stringent Wash Fill two staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Stringent Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). A minimum volume of 100 ml or 15 ml per slide in each jar is recommended. Place one of the staining jars containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature in a fume hood and the other in a water bath. Heat water bath and the diluted Stringent Wash Buffer to 65 C. Ensure that the temperature has stabilized. Cover jar with lid in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Measure temperature inside the water bath jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. The Stringent Wash Buffer contains detergent and may become turbid at 65 C; this will not affect performance. Using forceps or gloves, take slides from the hybridization chamber and gently remove Coverslip Sealant as well as coverslip and place slides in the room temperature pre-wash jar, one at a time. As soon as all coverslips have been removed, transfer slides from the room temperature, prewash jar to the 65 C jar in the water bath. Perform stringent wash for exactly 10 minutes at 65 C. Remove slides from the diluted Stringent Wash Buffer, and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Change diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to dry completely. ( ) K /EFG/ULH/ p. 38/148

39 Gastric Cancer Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium containing DAPI (Vial 5) to the target area of the slide and apply a glass coverslip. NOTE: Slides may be read after 15 minutes or within 7 days after mounting. However, fading occurs if slides are exposed to light or high temperatures. To minimize fading, store slides in the dark at 2 8 C. Quality Control - Gastric 1. Signals must be bright, distinct and easy to evaluate. 2. Normal cells allow for an internal control of the staining run. Normal cells should have 1-2 clearly visible green signals indicating that the CEN-17 PNA Probe has successfully hybridized to the centromeric region of chromosome 17. Normal cells should also have 1-2 clearly visible red signals indicating that the HER2 DNA Probe has successfully hybridized to the HER2 amplicon. Due to tissue sectioning, some normal cells will have less than the expected 2 signals of each colour. Failure to detect signals in normal cells indicates assay failure, and results should be considered invalid. 3. Nuclear morphology must be intact when evaluated using a DAPI filter. Numerous ghost-like cells and a general poor nuclear morphology indicate over-digestion of the specimen, resulting in loss or fragmentation of signals. Such specimens should be considered invalid. 4. The minimum number of assessable tumor cells is Differences in tissue fixation, processing, and embedding in the user s laboratory may produce variability in results, necessitating regular evaluation of in-house controls. Interpretation of Staining - Gastric Assessable tissue Locate the tumor within the context of the HE stained slide and evaluate the same area on the FISH stained slide (in the DAPI filter). Only specimens from patients with adenocarcinoma of the stomach including gastro-esophageal junction should be analyzed. In cases with intestinal metaplasia and adenocarcinoma in the same specimen, only the carcinoma component should be scored. Avoid areas of heavy inflammation, necrosis and areas where the nuclear borders are ambiguous. Do not include nuclei that require subjective judgment. Do not include nuclei with weak signal intensity and non-specific or high background. Begin with microscope evaluation of the complete FISH stained section and the area assigned on the H&E section, respectively. Before enumeration of the FISH stained slide, note the overall signal distribution (homogenous or heterogeneous) on the signal enumeration sheet. In case of heterogeneous distribution, note whether focal amplification or single cell amplification (mosaic) is present. 1) Homogenous signal distribution In case the signal distribution is homogenous, enumerate the number of chromosome centromers (green signals) and the number of HER2 genes (red signals) respectively, from 20 cells in 1-2 representative tumor areas. 2) Heterogeneous signal distribution In case the signal distribution is heterogeneous, enumerate a total of 20 cells from selected areas as specified below: A) If focal amplification exists, areas with amplified cells should be selected. B) If mosaic distribution or amplified, polysomal and disomal cells are present, count in areas with amplified cells. Within these areas, not only the amplified cells but also the adjacent non-amplified cells should be counted for a total of 20 cells. If possible, do not select overlapping areas. ( ) K /EFG/ULH/ p. 39/148

40 Gastric Cancer Disregard staining of bacterial DNA A number of specialized cells (mast cells and macrophages), present interspersed in the gastric tissue, exhibit a high level of staining by the HER2 probe due to presence of bacterial DNA. This results in highly red fluorescent cells that are clearly distinct from tumor cells with high HER2 gene amplification. Signal enumeration When an area has been selected for signal evaluation, begin analysis in one of the 20 adjacent chosen nuclei and then count in a cell-by-cell fashion only leaving out nuclei that do not meet the quality criteria. Count the number of signals within the nuclear boundary of each evaluated nucleus according to the guidelines below (see also Appendix 7). - Focus up and down to find all of the signals in the individual nucleus. - Count two signals that are the same size and separated by a distance (equal to or) less than the diameter of the signal as only one signal. The distance has to be at least equal to the diameter of one normal-sized signal in order to count two individual signals. When the distance between two signals is less than the diameter of a signal it has to be counted as one. - In nuclei with high levels of HER2 gene amplification, the HER2 signals may be positioned very close to each other forming a cluster of signals. In these cases the number of HER2 signals cannot be counted, but must be estimated. Special attention must be paid to the green signals, as clusters of red HER2 signals can cover the green signals making them impossible to see. In case of doubt, please check the green signals using a specific FITC filter. Do not score nuclei without signals or with signals of only one color. Score only those nuclei with one or more FISH signals of each color. Signal counting guide 1 Do not count. Nuclei are overlapping, not all areas of nuclei are visible 2 Two green signals, do not score nuclei with signals of only one color 3 Count as 3 green and 12 red signals (cluster estimation) 4 Count as 1 green and 1 red signal. Two signals of the same size and separated by a distance equal to or less than the diameter of one signal are counted as one 5 Do not count (over- or underdigested nuclei). or Missing signals in the centre of nuclei (donut-shaped nuclei). 6 Count as 2 green and 3 red signals. Two signals of the same size and separated by a distance equal to or less than the diameter of one signal are counted as one 7 Count as 1 green and 5 red signals 8 Count as 3 green (1 green out of focus) and 3 red signals 9 Cluster of red signals hiding green signals, check the green signals with a specific FITC filter, or do not count ( ) K /EFG/ULH/ p. 40/148

41 Gastric Cancer Record counts in a table as shown in Appendix 5 and 6. Count 20 nuclei per tissue specimen, when possible from distinct tumor areas. Calculate the HER2/CEN-17 ratio by dividing the total number of red HER2 signals by the total number of green CEN-17 signals. Specimens with a HER2/CEN-17 ratio above or equal to 2 should be considered HER2 gene amplified (27). Results at or near the cut-off ( ) should be interpreted with caution. If the ratio is borderline ( ), count an additional 40 nuclei and calculate the ratio for the 40 nuclei. If the enumeration continues to be borderline, the result of the second evaluation is valid. If available, an immunohistochemical staining of HER2 should be included for better orientation during the second enumeration. In case of doubt, the specimen slide should be re-scored. For borderline cases a consultation between the pathologist and the treating physician is warranted. Limitations - Gastric 1. FISH is a multi-step process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents, as well as in tissue selection, fixation, and processing, preparation of the FISH slide, and interpretation of the staining results. 2. FISH results are dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may influence on probe hybridization. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. 3. For optimal and reproducible results, the tissue slides must be deparaffinized completely. The paraffin removal needs to be completed at the beginning of the staining process. (See INSTRUCTIONS FOR USE, section B.2). 4. Only temperature-calibrated water bath, heating block, and hybridization oven should used. Use of other types of equipment may result in evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization and must be validated by user. Performance Characteristics - Gastric Background The safety and efficacy of trastuzumab (Herceptin ) has been demonstrated in a clinical study (the ToGA trial) (26). The study was designed as an open labeled, randomized, multicenter phase III study in HER2-positive patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastro-esophageal junction. In ToGA trial the HER2 positivity was defined as being either IHC-positive (3+) (HercepTest, Dako) and/or positive by HER2 FISH (HER2/CEN )(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). After inclusion in the study the patients were randomized to receive chemotherapy (5-FU or capecitabine and cisplatin) or chemotherapy plus trastuzumab. The primary endpoint in the study was overall survival (OS). In the study a total 594 patients were randomized and 584 patients received the study medication and were included in the full analyses set (FAS). For the primary endpoint the combination of chemotherapy plus trastuzumab was shown to be statistically superior to chemotherapy alone. The median OS increased from 11.1 to 13.8 months (p=0.0046) with a hazard ratio of 0.74 (95 % CI: ). The Kaplan-Meier curves for OS are shown in Figure 2. ( ) K /EFG/ULH/ p. 41/148

42 Gastric Cancer Probability of Survival Log-Rank Test P = Time (months) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Treatment Group Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 2. Kaplan-Meier curve of OS (n=584). Pre-specified exploratory subgroup analyses by HER2 status were performed once the data were available, and in addition two new HER2 subgroups were defined post hoc based on IHC scoring: Group 1 ( low HER2 expressing group ): IHC 0/FISH+ and IHC 1+/FISH+ (n=131) Group 2 ( high HER2 expressing group ): IHC 2+/FISH+ and IHC 3+ (FISH+ orfish - or FISH no result)(n=446) When the primary analysis on OS was repeated post hoc for the high HER2 expressing group (n=446) the benefit in favor of the combined treatment was even greater. The median OS for the group of patients who had received chemotherapy plus trastuzumab increased to 16.0 months compared to 11.8 months for the patients on chemotherapy alone. The hazard ratio for this analysis decreased to 0.65 (95 % CI: ). The Kaplan-Meier curves for OS for the high HER2 expressing group is shown in Figure 3. ( ) K /EFG/ULH/ p. 42/148

43 Gastric Cancer Probability of Survival Time (months) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Treatment Group Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 3. Kaplan-Meier curve of OS for the high HER2 expressing group (n=446). The BO18255 study demonstrated the clinical utility of both HercepTest and HER2 FISH pharmdx Kit for the assessment of HER2 status in patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastro-esophageal junction. Analytical sensitivity The analytical sensitivity of the HER2/CEN-17 Probe Mix was investigated using 18 gastric cancer adenocarcinoma specimens. The ratio between the number of HER2 signals and CEN-17 signals was calculated based on a counting of 20 nuclei from normal cells surrounding the tumor. The HER2/CEN-17 ratio was scored between 0.91 and 1.09 which was within the pre-set acceptance criteria. Analytical specificity The HER2 DNA probes in the HER2/CEN-17 Probe Mix have been end-sequenced and mapped to confirm a total coverage of 218 kb including the HER2 gene. The CEN-17 PNA probes in the HER2/CEN-17 Probe Mix have been tested individually and in combination to confirm their specific hybridization to the centromeric region of chromosome 17. To exclude cross-hybridization to chromosomes other than chromosome 17, studies were performed on metaphase spreads. A total of 250 metaphase spreads were evaluated for specific hybridization of the HER2 DNA and CEN-17 PNA probe mixes. In all 250 cases the hybridization was specific for chromosome 17. No cross-hybridization to loci on other chromosomes was observed in any of the 250 cases. Robustness studies The robustness of the HER2 FISH pharmdx assay was tested by varying pre-treatment time and temperature, pepsin incubation time, denaturation temperature, hybridization time and temperature, and stringent wash time, temperature and buffer concentration. No significant difference in results was observed at the following experimental conditions: Pre-treatment for 7, 9, 10, 11, and 13 minutes at ºC Pre-treatment at 89, 92 and ºC for 10 minutes. Pepsin incubation times of 2, 2½, 3 and 4 minutes at 37 ºC. Denaturation temperatures of 72, 77, 82, 87 and 92 ºC for 5 minutes. Hybridization times 10, 12 and 14 hours. ( ) K /EFG/ULH/ p. 43/148

44 Gastric Cancer Hybridization temperatures at 40, 45 and 50 ºC. Stringency wash for 5, 10 and 15 minutes at 65 ºC Stringency wash at 60, 65 and 70 ºC for 10 minutes. Stringency wash buffer concentration at 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 and 1:40 Note: For the robustness tests only one parameter in the staining procedure was changed at a time while all other parameters were kept constant. It is recommended to adhere to the time and temperatures indicated in the staining procedure. Repeatability The repeatability of the HER2/CEN-17 ratio was investigated with the HER2 FISH pharmdx TM Kit using 3 consecutive sections from 9 different gastric cancer adenocarcinoma specimens. The coefficient of variance was found to be 1 5% within the pre-set acceptance criteria. Repeatability on consecutive sections of gastric adenocarcinoma specimens (IHC HER2 2+) with different thickness (2 7 µm) was tested with the HER2 FISH pharmdx TM Kit. The coefficient of variance of the HER2/CEN-17 ratio in this study was found to be 2 6% i.e. in the same range as for tissue of equal thickness and within the pre-set acceptance criteria. Reproducibility The day-to-day, site-to-site and observer-to-observer reproducibility was tested using HER2 FISH pharmdx Kit. Sections from 24 different gastric cancer specimens obtained from stomach (75%) or gastroesophageal junction (25%) were stained and analyzed on five non-consecutive days by two observers at three sites. This resulted in a total of 720 signal enumerations of the HER2/CEN-17 ratio (see Table 10). The specimens represented surgical resections (70%) and biopsies (30%) with an equal number of non-amplified, IHC 2+ (determined by HercepTest ), and amplified specimens. Table 10. HER2/CEN-17 ratio determinations from 720 signal enumerations Site One Observers Site Two Observers Site Three Observers A B C D E F Total Day Day Day Day Day Total The average CV (Standard Deviation / Mean x 100) for the HER2/CEN-17 ratio determined for each observer from the eight specimens in each category (five observations per block) is seen in Table 11. The overall average CVs for each observer were 5.4%, 3.8%, 12.0%, 11.9%, 4.7% and 24.4%, respectively (Table 11). The average CVs determined in each category for all combined observations (days, sites, observers) were 22.8%, 16.5% and 25.2% in the nonamplified, IHC 2+, and amplified category, respectively. ( ) K /EFG/ULH/ p. 44/148

45 Gastric Cancer Table 11. The average day-to-day CV (%) for each observer and the average CV (%) for all enumerations in the three categories. Average CVs (%) Site One Observers Site Two Observers Site Three Observers A B C D E F All Sites All Observers Non IHC Amplified All Table 11 shows the average CV (%) for each observer at the three sites (day-to-day variation) for determinations of the HER2/CEN-17 ratios. In the last column the average CV (%) is given for all determinations made for each specimen in the three categories. Using statistical variance component models it was found that the variation associated with the specimen itself contributed to the vast majority of the day-to-day, site-to-site and observer-to-observer variation. Hybridization efficacy Hybridization efficiency of HER2 FISH pharmdx Kit was investigated as part of the reproducibility study. From the total 360 formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections tested at the three study sites 358 could be enumerated in accordance with product guidelines. Thus, the hybridization efficiency was 99.4%. ( ) K /EFG/ULH/ p. 45/148

46 Troubleshooting - Gastric Problem Probable Cause Suggested Action 1. No signals or weak signals 1a. Kit has been exposed to high temperatures during transport or storage 1b. Microscope not functioning properly - Inappropriate filter set - Improper lamp - Mercury lamp too old - Dirty and/or cracked collector lenses - Unsuitable immersion oil 1c. Faded signals 1d. Pre-treatment conditions incorrect 1e. Evaporation of Probe Mix during hybridization 2. No green signals 2a. Stringent wash conditions incorrect 3. No red signals 3a. Pre-treatment conditions incorrect 4. Areas without signal 5. Excessive background staining 4a. Probe volume too small 4b. Air bubbles caught during Probe Mix application or mounting 5a. Inappropriate tissue fixation 5b. Paraffin incompletely removed Gastric Cancer 1a. Check storage conditions. Ensure that dry ice was present when the consignment was received. Ensure that vials 2, 3 and 5 have been stored at maximum 2 8 C, and that vials 3 and 5 have been stored in the dark. 1b. Check the microscope and ensure that the used filters are suitable for use with the kit fluorochromes, and that the mercury lamp is correct and has not been used beyond expected lifetime. (see Appendix 7). In case of doubt, please contact your local microscope vendor. 1c. Avoid long microscopic examination and minimize exposure to strong light sources. 1d. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 1e. Ensure sufficient humidity in the hybridization chamber 2a. Ensure that the recommended stringent wash temperature and time are used, and that coverslips are removed before performing stringent wash 3a. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 4a. Ensure that the probe volume is large enough to cover the area under the coverslip 4b. Avoid air bubbles. If observed, gently tap them away using forceps 5a Ensure that only formalinfixed, paraffin-embedded tissue sections are used 5b. Follow the deparaffinization and rehydration procedures ( ) K /EFG/ULH/ p. 46/148

47 Problem Probable Cause Suggested Action 6. Poor tissue morphology 5c. Stringent wash temperature too low 5d. Prolonged exposure of hybridized section to strong light 6a. Incorrect Pepsin treatment 6b. Incorrect pre-treatment conditions may result in unclear or cloudy appearance 6c. Too long Pepsin treatment or very thin section thickness may cause ghost cells or donut cells to appear. Gastric Cancer outlined in Section B.2 5c. Ensure that the stringent wash temperature is 65 (±2) C 5d. Avoid long microscopic examination and minimize exposure to strong light 6a. Adhere to recommended Pepsin incubation times. See section B.3, step 2. Ensure that the Pepsin is handled at the correct temperature. See Section B.1 6b. Ensure that the recommended pretreatment temperature and time are used 6c. Shorten the Pepsin incubation time. See section B.3, step 2. Ensure that the section thickness is 3-6 µm. NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call our Technical Services for further assistance. ( ) K /EFG/ULH/ p. 47/148

48 Gastric Cancer Appendix 4 - Gastric HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Protocol Checklist Date (Day 1) of the run: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Specimen ID: Equipment ID: Staining Run Log ID: Date of dilution/expiration of the 1 x Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20): / Tissue fixed in neutral buffered formalin Yes No DAY 1 Step 1: Pre-Treatment Date of dilution/expiration of the Pre-Treatment Solution (Vial 1 diluted 1:20) / Measured temperature of Pre-Treatment Solution (95 99 C) if water bath is used for heating Pre-treatment (10 minutes), and cooling (15 minutes) Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Step 2: Pepsin Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at 37 C or Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at room temperature Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Dehydrate slides (3 x 2 minutes) in graded series of ethanol and air dry Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix Apply Probe Mix (Vial 3), coverslip and seal with Coverslip Sealant Measured denaturation temperature (82 ± 2 C) C Denaturation for 5 minutes Measured hybridization temperature (45 ± 2 C) C Hybridization overnight (protect from light) DAY 2 Step 4: Stringent Wash Date of dilution/expiration of the Stringent Wash Buffer (Vial 4 diluted 1:20) / Measured temperature of Stringent Wash Buffer (65 C) C Stringent wash (10 minutes) after removing the coverslips Wash in Wash Buffer (Vial 6 diluted 1:20) (2 x 3 minutes) Dehydrate slides (3 x 2 minutes) in graded series of ethanol and air dry Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium (Vial 5) and coverslip Comments: C Minutes Minutes Hours Date and signature, Technician: ( ) K /EFG/ULH/ p. 48/148

49 Gastric Cancer Appendix 5 - Gastric HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Scoring Scheme HER2 FISH pharmdx TM Kit, K5331 lot: Date (Day 1) of the run: Staining Run Log ID: Specimen ID: Characterization of signal distribution in tissue: Homogeneous: Heterogeneous Focal: or Heterogeneous Mosaic: Count signals in 20 nuclei Nuclei no. Red (HER2) Green (CEN-17) Nuclei no. Red (HER2) Green (CEN-17) Total 1-10 Total For determination of the HER2/CEN-17 ratio, count the number of HER2 signals and the number of CEN-17 signals in the same 20 nuclei and divide the total number of HER2 signals by the total number of CEN-17 signals. If the HER2/CEN-17 ratio is borderline ( ), count an additional 40 nuclei and recalculate the ratio (refer to recount scoring scheme). HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 ratio TOTAL SCORE (1-20) Ratio < 2: HER2 gene amplification was not observed Ratio 2: HER2 gene amplification was observed Date and signature, Technician: Date and signature, Pathologist: For scoring guidelines: see Interpretation of Staining. ( ) K /EFG/ULH/ p. 49/148

50 Appendix 6 - Gastric Gastric Cancer HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Recount Scoring Scheme HER2 FISH pharmdx TM Kit, K5331 lot: Date (Day 1) of the run: Staining Run Log ID: Specimen ID: Signals in additional 40 nuclei (1-40) Nuclei no. Red HER2 Green CEN-17 Nuclei no. Red HER2 Green CEN-17 Nuclei no. Red HER2 Green CEN-17 Nuclei no Red HER2 Green CEN-17 Total Total Total Total For determination of the HER2/CEN-17 ratio, count the number of HER2 signals and the number of CEN- 17 signals in the same 40 nuclei and divide the total number of HER2 signals by the total number of CEN- 17 signals. Report Total Score from the 1-40 nuclei in the table below. HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 ratio TOTAL SCORE (1-40) Ratio < 2: HER2 gene amplification was not observed Ratio 2: HER2 gene amplification was observed Date and signature, Technician: Date and signature, Pathologist: For scoring guidelines: see Interpretation of Staining. ( ) K /EFG/ULH/ p. 50/148

51 Gastric Cancer Appendix 7 - Gastric HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Fluorescence Microscope Specifications Dako recommends the following equipment for use with the HER2 FISH pharmdx Kit, K5331: 1. Microscope type Epifluorescence microscope. 2. Lamp 100 watt mercury lamp (keep record of burning time). 3. Objectives For screening of the tissue, fluorescence dry 10X or fluorescence oil immersion 16X objectives are applicable. For high power magnification and scoring of signals, only fluorescence oil immersion objectives, e.g. 100X are recommended. 4. Filters Filters are individually designed for specific fluorochromes and must be chosen accordingly. Dako recommends the use of a specific DAPI filter in combination with a high quality Texas Red/FITC double filter. DAPI filter, e.g. Chroma filter # Texas Red/FITC double filter, e.g. Chroma filter # Texas Red and FITC single filters can be used for confirmation. Fluorochrome Excitation Wavelength Emission Wavelength FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filters are specific to each microscope type and the use of appropriate filters is crucial for the interpretation. If you want detailed information, please contact your microscope provider or your Dako representative. 5. Oil Non-fluorescing oil. Precautions A 50 watt mercury lamp is not recommended. Rhodamine filters cannot be used. Triple filters are not recommended. A non-optimized microscope may cause problems when reading the fluorescent signals. It is important that the light source has not expired and that it is properly aligned and focused. Customers should monitor and follow the manufacturer s recommendations for the mercury lamp. The microscope should be maintained and the mercury lamp should be in alignment prior to interpreting results. An effort should be made to expose the sample to as little of the excitation light as possible in order to minimize fading of the fluorescence. We recommend that you discuss the set-up of your particular microscope with the manufacturer before starting the fluorescence in situ hybridization, or refer to the literature. ( ) K /EFG/ULH/ p. 51/148

52 FRANÇAIS Intérêt Le kit HER2 FISH pharmdx est un test d hybridation in situ à fluorescente directe (FISH) conçu pour la détermination quantitative de l amplification du gène HER2 dans des échantillons tissulaires de cancers du sein et d échantillons de patients atteints d adénocarcinome de l estomac, notamment à la jonction gastro-œsophagienne, tous fixés au formol et inclus en paraffine. L utilisation du kit HER2 FISH pharmdx est indiquée, en plus du test HercepTest, pour l évaluation des patients chez lesquels un traitement par Herceptin (trastuzumab) est envisagé (voir la notice de l Herceptin ). Dans le cas de patientes atteintes de cancer du sein, les résultats obtenus avec le kit HER2 FISH pharmdx sont à utiliser conjointement aux informations pathologiques cliniques permettant actuellement d évaluer le pronostic des patientes atteintes d un cancer du sein de stade II, à ganglions positifs. Dans ce document, les termes «cancer gastrique» ou «cancer de l estomac» sont également utilisés en référence à l adénocarcinome de l estomac, y compris de la jonction gastroœsophagienne. Pour l application au cancer du sein, consulter les pages 53 à 75. Pour l application au cancer gastrique, consulter les pages 76 à 97. Important : noter les différences qu il existe entre le tissu d un cancer du sein et celui d un cancer de l estomac, en particulier aux sections Interprétation de la coloration ( ) K /EFG/ULH/ p. 52/148

53 Cancer du sein Résumé et explication Sein Le gène humain HER2 (également connu sous le nom de ERBB2 ou NEU) se trouve sur le chromosome 17 et code la protéine HER2 ou p185 HER2. La protéine HER2 est une tyrosine kinase des récepteurs membranaires présentant une homologie avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (RFCE ou HER1) (1, 2). Le gène HER2 est présent en 2 copies dans toutes les cellules diploïdes normales. Chez certaines patientes atteintes d un cancer du sein, la protéine HER2 est surexprimée dans le cadre du processus de transformation maligne et de progression de la tumeur (3-8). L amplification du gène HER2 entraîne généralement une surexpression de la protéine HER2 à la surface des cellules de cancer du sein (9). L amplification du gène HER2 et/ou la surexpression de sa protéine ont été démontrées dans 25 à 30 % des cas de cancer du sein. Cette régulation en amont est associée à un mauvais pronostic, un risque accru de récurrence et une survie écourtée. Plusieurs études ont montré que le statut de HER2 est en corrélation avec la sensibilité ou la résistance à certains régimes de chimiothérapie (10). La démonstration d une forte surexpression de la protéine HER2 ou de l amplification du gène HER2 est essentielle pour commencer une thérapie avec l Herceptin, un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine HER2. Des études cliniques ont montré que ce sont les patients avec des tumeurs dans lesquelles la protéine HER2 est surexprimée et/ou le gène HER2 est amplifié qui bénéficient le plus de l Herceptin (11). Principe de la procédure Sein Le kit HER2 FISH pharmdx contient tous les réactifs nécessaires pour réaliser une procédure FISH sur des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Après déparaffinage et réhydratation, les échantillons sont chauffés dans la solution de prétraitement pendant 10 minutes. L étape suivante implique une digestion protéolytique avec de la pepsine prête à l emploi soit à température ambiante soit à 37 C. Le temps d incubation optimal de la pepsine dépend des antécédents de fixation du tissu et doit être déterminé par l utilisateur mais 10 minutes à température ambiante ou 3 minutes à 37 C conviennent pour la plupart des échantillons. Après les étapes de chauffage et de digestion protéolytique, cette trousse emploie un mélange (FISH Probe Mix) prêt à l emploi basé sur l association des technologies PNA (peptide d acide nucléique) (12) et ADN. Le Probe Mix se compose d un mélange de sondes ADN marquées au Texas Red couvrant une région de 218 kb incluant le gène HER2 sur le chromosome 17, et d un mélange de sondes PNA marquées à la fluorescéine dirigées contre la région centromérique du chromosome 17 (CEN-17). L hybridation spécifique des deux cibles entraîne la formation d un signal distinct rouge fluorescent à chaque locus du gène HER2 et un signal distinct vert fluorescent sur chaque centromère du chromosome 17. Pour diminuer la coloration de fond, le mélange Probe Mix contient également des sondes de blocage PNA non marquées. Après un lavage stringent, les échantillons sont montés avec un milieu de montage fluorescent contenant du DAPI et recouvert par une lamelle. A l aide d un microscope de fluorescence équipé des filtres appropriés (voir Annexe 3), les cellules tumorales sont localisées et un décompte des signaux rouges (HER2) et verts (CEN-17) est effectué. Puis, le rapport HER2/CEN-17 est calculé. Les cellules normales dans la coupe de tissu analysée servent de contrôle positif interne de l efficacité du prétraitement et de l hybridation. Pour plus de détails, voir la section Interprétation des résultats de la coloration. Pour une formation en ligne interactive, utiliser le programme de formation en ligne HER2 FISH pharmdx conçu pour former rapidement et avec précision les techniciens de laboratoire, les pathologistes et les scientifiques aux techniques nécessaires pour obtenir des résultats optimaux avec le kit HER2 FISH pharmdx : ( ) K /EFG/ULH/ p. 53/148

54 Réactifs Sein Cancer du sein Matériel fourni Le matériel énuméré ci-dessous est suffisant pour 20 tests (un test est défini comme une zone cible de 22 mm x 22 mm). Le nombre de tests est basé sur l utilisation de 5 à 8 gouttes (250 µl par lame pour le flacon 2, 10 µl par lame pour le flacon 3 et 15 µl par lame pour le flacon 5). Le kit fournit suffisamment de matériaux pour 10 cycles de coloration. Le kit HER2 FISH pharmdx est expédié sur de la glace sèche. Pour être sûr que les éléments du kit n ont pas été exposés à des températures élevées pendant le transport, on doit trouver de la glace sèche à la réception. Noter que certains éléments peuvent rester décongelés, mais cela n affecte pas les performances du kit HER2 FISH pharmdx. Flacon 1 Flacon 2 Flacon 3 Flacon 4 Flacon 5 Flacon 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentré 20x Tampon MES (acide 2-[N - morpholino]éthanesulphonique). Pepsin 7,5 ml, prêt à l emploi Solution de pepsine, ph 2,0 ; contient un stabilisateur et un agent antimicrobien. HER2/CEN-17 Probe Mix 0,2 ml, prêt à l emploi Mélange de sondes ADN HER2 marquées au Texas Red et de sondes PNA CEN-17 marquées à la fluorescéine ; fournies dans un tampon d hybridation avec 45 % de formamide, stabilisateur et sondes de blocage PNA non marquées. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentré 20x Tampon SSC (solution saline/citrate de sodium) avec détergent. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, prêt à l emploi Milieu de montage pour fluorescence avec 100 µg/l de DAPI (dihydrochlorure de 4,6-diamidino-2-phénylindole). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentré 20x Tampon Tris/HCl Coverslip Sealant 1 tube, prêt à l emploi Solution étanchéisante amovible pour lamelle REMARQUE : tous les réactifs, y compris la solution de prétraitement, le tampon de lavage stringent et le milieu de montage pour fluorescence, sont formulés spécifiquement pour être utilisés avec ce test. ( ) K /EFG/ULH/ p. 54/148

55 Matériel requis mais non fourni Réactifs de laboratoire Eau distillée ou dé-ionisée Éthanol à 96 % Xylène ou substituts de xylène Cancer du sein Equipement de laboratoire Tissus absorbants Pipettes réglables Thermomètre d immersion partielle étalonné (plage de 37 à 100 C) Thermomètre de surface étalonné (plage de 37 à 100 C) Lamelles (22 mm x 22 mm) Pince Hotte de laboratoire Dako Hybridizer (réf. S2450 ou S2451)* Lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou lames revêtues de poly-l-lysine (voir Préparation des échantillons) Cuves ou bains de coloration Minuteur (avec une capacité de 2 à 15 mn) Bain-marie avec couvercle (capable de maintenir la température entre 65 C et 99 C) Four à micro-ondes avec fonction de détection si le prétraitement est réalisé à l aide d un four à micro-ondes (voir B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, Méthode B) * Un bloc chauffant ou un four d hybridation pour la dénaturation (82 C (±2 C)) et l hybridation (45 C (±2 C)), associés à une chambre d hybridation humide, peuvent être utilisés en remplacement du Dako Hybridizer. Microscope et accessoires Filtres pour microscope à fluorescence : double filtre DAPI et FITC/Texas Red, ou filtres simples FITC et Texas Red (voir les détails dans l Annexe 3) Un microscope à fluorescence avec une lampe à mercure de 100 watts est recommandé Boîte de rangement des lames de microscope (plateau en carton pour 20 lames avec couvercle à charnières ou similaire) Précautions - Sein 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Pour utilisateurs professionnels. 3. Le flacon 1, solution de prétraitement (20x), contient 1-<20 % d acide 2-morpholinoéthanesulphonique, le flacon 2, Pepsine, contient 5 à 10 % de propane-2-ol, le flacon 4, tampon de lavage stringent (20x), contient 1-<5 % d octoxinol et le flacon 6, tampon de lavage (20x), contient 1-<20 % de trométamol. Aux concentrations du produit, ces substances ne nécessitent pas d étiquetage de sécurité. La fiche de données de sécurité (FDS) est disponible sur demande pour les utilisateurs professionnels. 4. Le flacon 2, pepsine, contient de la pepsine A qui peut provoquer une réaction allergique. 5. Le flacon 3, mélange Probe Mix HER2/CEN-17 contient 45 % de formamide et est étiqueté : Toxique. R61 Risques pendant la grossesse d effets néfastes pour l enfant. S45 En cas d accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible, lui montrer l étiquette). S53 Éviter l exposition - se procurer des instructions spéciales avant l utilisation. S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. ( ) K /EFG/ULH/ p. 55/148

56 Cancer du sein En règle générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent avoir été soigneusement formés à la procédure opérationnelle correcte, et informés des propriétés dangereuses du produit et des consignes de sécurité requises. Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 6. L étanchéisant pour lamelle contient 60 à 100 % de naphte (pétrole), fraction légère hydrotraitée, et il est étiqueté : Extrêmement inflammable. Dangereux pour l environnement. R11 Facilement inflammable. R51/53 Toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner des effets néfastes à long terme pour l environnement aquatique. S9 Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé. S16 Conserver à l écart de toute flamme ou source d étincelles Ne pas fumer. S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu en prenant toutes les précautions d usage. S57 Utiliser un récipient approprié pour éviter toute contamination du milieu ambiant. S61 Éviter le rejet dans l environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de données de sécurité. Se reporter à la fiche des données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 7. Les échantillons, avant et après la fixation, ainsi que tous les matériaux qui y ont été exposés, doivent être manipulés comme s ils pouvaient transmettre une infection, et être éliminés avec toutes les précautions nécessaires (13). Ne pas pipeter les réactifs à la bouche et éviter tout contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs et les échantillons. Si les réactifs entrent en contact avec des zones sensibles, laver abondamment à l eau. 8. Minimiser tout risque de contamination microbienne des réactifs afin d éviter des résultats erronés. 9. Toute modification des durées et des températures d incubation spécifiées est susceptible d entraîner des résultats erronés. 10. Toute modification des méthodes de fixation des tissus et des épaisseurs d échantillons spécifiées peut affecter la morphologie tissulaire et/ou l intensité du signal. 11. Éviter l évaporation du mélange Probe Mix HER2/CEN-17 pendant l hybridation en assurant une humidité suffisante dans la chambre d hybridation. 12. Les réactifs sont à dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut se traduire par un affaiblissement des performances. 13. Porter un équipement de protection approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d informations. Conservation Sein Conserver à l obscurité entre 2 et 8 C. Tous les r éactifs tolèrent une conservation au congélateur. La congélation et la décongélation des réactifs pour chaque analyse n affectent pas les performances. La pepsine, le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 et le milieu de montage pour fluorescence (flacons 2, 3 et 5) peuvent s altérer s ils sont exposés à la chaleur. Ne pas laisser ces éléments à température ambiante. Le mélange HER2/CEN-17 et le milieu de montage pour fluorescence (flacons 3 et 5) peuvent s altérer s ils sont exposés à une lumière vive. Ne pas conserver ces éléments, ni procéder à l analyse sous une lumière trop vive telle que la lumière du soleil. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur la boîte. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles spécifiées dans la notice contenue dans le kit, les performances des réactifs doivent être validées par l utilisateur (14). Aucun signe visible n indique l instabilité du produit. Il est donc important d évaluer les cellules normales dans la coupe de tissu analysée. Si un profil de fluorescence imprévu est observé qui ne peut pas être expliqué par des changements de procédures de laboratoire et qu un problème avec le kit HER2 FISH pharmdx est suspecté, contacter nos services techniques. ( ) K /EFG/ULH/ p. 56/148

57 Cancer du sein Préparation des échantillons Sein Les échantillons des biopsies, excisions ou résections doivent être manipulés de manière à préserver le tissu pour l analyse FISH. Les méthodes standards de traitement des tissus pour un immunomarquage doivent être utilisées pour tous les échantillons (15). Coupes incluses en paraffine Seuls les tissus préservés dans du formol tamponné neutre et ceux inclus en paraffine conviennent à cet usage. Les échantillons doivent, par exemple, être inclus dans des blocs d une épaisseur de 3 à 4 mm et fixés pendant 18 à 24 heures dans du formol tamponné neutre. Les tissus sont alors déshydratés dans une série de bains d éthanol et de xylène à des concentrations de plus en plus élevées, pour être ensuite infiltrés avec de la paraffine liquide maintenue à une température maximale de 60 C. Les tissus, fixés et inclus correctement, se conservent indéfiniment avant la coupe et le montage sur lame s ils sont conservés au frais (15 à 25 C) (15-16). Les autres fixateurs ne convi ennent pas. Les échantillons de tissus doivent être découpés en tranches de 4 à 6 µm. Les lames nécessaires pour l analyse de l amplification du gène HER2 et la vérification de la présence d une tumeur doivent être préparées au même moment. Un minimum de 2 coupes consécutives est recommandé, 1 coupe pour détecter la présence d une tumeur colorée à l hématoxyline et l éosine (coloration H&E), et 1 coupe pour l analyse de l amplification du gène HER2. Il est recommandé de monter les coupes de tissu sur des lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou des lames revêtues de poly-l-lysine. Les échantillons doivent être analysés dans les 4 à 6 mois suivant la coupe lorsqu ils sont conservés à température ambiante (20 25 C). INSTRUCTIONS D UTILISATION Sein A. Préparation des réactifs Sein Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant la coloration : A.1 Solution de prétraitement Des cristaux peuvent se former dans le flacon 1, mais ils se dissolvent à température ambiante. S assurer qu il n y a pas de cristaux avant de préparer le réactif. Préparer une quantité suffisante du flacon 1 (Solution de prétraitement 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. La solution diluée inutilisée peut être conservée à 2 8 C pendant un mois. Jeter la soluti on diluée si elle a un aspect trouble. A.2 Tampon de lavage stringent Préparer une quantité suffisante du flacon 4 (Tampon de lavage stringent 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s i l a un aspect trouble. A.3 Tampon de lavage Préparer une quantité suffisante du flacon 6 (Tampon de lavage 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s il a un aspect trouble. A.4 Série de bains d éthanol A partir d une solution d éthanol à 96 %, préparer 3 cuves contenant de l éthanol à 70 %, à 85 % et à 96 % respectivement. Stocker les cuves recouvertes d un couvercle à température ambiante ou entre 2 et 8 C et les utiliser pour un maximum de 200 lames. Jeter les solutions si elles ont un aspect trouble. ( ) K /EFG/ULH/ p. 57/148

58 B. Procédure de coloration Sein Cancer du sein B.1 Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire soigneusement les instructions et se familiariser avec tous les composants avant utilisation (voir Précautions). Si les composants du kit sont congelés pour la conservation, il est recommandé de ramener les réactifs entre 2 et 8 C le jour précédent l analys e pour permettre un équilibrage correct de la température. Tous les réactifs doivent être équilibrés à la température correcte avant utilisation comme suit : Flacon 1 : la solution de prétraitement diluée doit être équilibrée entre 95 et 99 C si un bainmarie est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, Méthode A). Si un four à micro-ondes avec fonction de détection est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, Méthode B), la solution de prétraitement diluée doit être équilibrée à température ambiante (20 25 C). Flacon 2 : la température de la pepsine pour l application doit se situer entre 2 et 8 C et elle doit rester constamment froide. Flacon 3 : le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. Flacon 4 : tampon de lavage stringent dilué ; une cuve doit être équilibrée à température ambiante et l autre à 65 C avant utilisation. Flacon 5 : le milieu de montage pour fluorescence peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. Flacon 6 : le tampon de lavage dilué doit être équilibré à température ambiante entre 20 et 25 C. L étanchéisant pour lamelle peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. Toutes les étapes doivent être exécutées à la température indiquée. La procédure comprend plusieurs déshydratations suivies d un séchage des coupes de tissu. S assurer que les coupes de tissu sont complètement sèches avant de passer à l étape suivante. Ne pas laisser les coupes de tissus se dessécher pendant les autres étapes de la procédure. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans du tampon de lavage après l étape de déparaffinage et pendant une heure maximum à température ambiante (20 25 C) sans que cela n affecte les rés ultats. B.2 Traitement des tissus avant coloration Déparaffinage et réhydratation : avant l analyse, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d éliminer le milieu d inclusion puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Les résidus de milieu d inclusion provoquent un accroissement du nombre de colorations non spécifiques. Cette étape doit être exécutée à température ambiante (20 25 C). 1. Placer les lames dans un bain de xylène et laisser incuber pendant 5 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 2. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans l éthanol à 96 % pendant 2 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 3. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans l éthanol à 70 % pendant 2 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 4. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans le tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.3) pendant 2 minutes minimum. Commencer la procédure de coloration comme indiqué dans la section B.3, Étape 1, prétraitement. Les solutions de xylène et d alcool doivent être changées au maximum toutes les 200 lames. Les substituts de xylène peuvent être utilisés. REMARQUE : les réactifs et les instructions fournis dans ce kit ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des ( ) K /EFG/ULH/ p. 58/148

59 Cancer du sein températures d incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Toute différence de traitement des tissus ou de procédure technique dans le laboratoire de l utilisateur peut invalider les résultats du test. B.3 Protocole de coloration JOUR 1 Étape 1 : prétraitement Le prétraitement peut être réalisé soit en utilisant un bain-marie, comme décrit dans la méthode A), soit en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection, comme décrit dans la méthode B). Méthode A) Prétraitement à l aide d un bain-marie : Remplir les cuves, par ex. cuves de Coplin, de solution de prétraitement diluée (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la solution de prétraitement dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et la solution de prétraitement entre 95 et 99 C. Vérifier la tempér ature à l intérieur de la cuve à l aide d un thermomètre étalonné pour s assurer que la température est correcte. Recouvrir les cuves avec des couvercles afin de stabiliser la température et d éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées à température ambiante dans les cuves de coloration contenant la solution de prétraitement préchauffée. Vérifier à nouveau la température et laisser incuber pendant 10 (±1) minutes de 95 à 99 C. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Retirer le couvercle et laisser les lames refroidir dans la solution de prétraitement pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (de 20 à 25 C). Renouveler le tampon de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Méthode B) Prétraitement à l aide d un four à micro-ondes avec fonction de détection : Remplir une cuve en plastique de solution de prétraitement diluée à température ambiante (20 25 C). Immerger les coupes déparaffinées dans la solution de prétraitement, recouvrir la cuve d un couvercle percé et la placer dans le four à micro-ondes. Sélectionner la fonction de détection de l ébullition ainsi qu un programme qui s exécute pendant 10 minutes après avoir atteint la température d ébullition*. Après les 10 minutes d incubation, sortir la cuve contenant les lames du four. Retirer le couvercle et laisser refroidir pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du tampon de lavage dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Renouveler le tamp on de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. * L utilisation d un four à micro-ondes doté d une fonction de détection de l ébullition signifie que le four doit être doté d un capteur et de programmes qui chauffent d abord la solution de prétraitement jusqu à ébullition puis maintiennent la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) tout en décomptant le temps prédéterminé (10 minutes [±1 minute]). Il est possible que certains modèles de fours à micro-ondes avec fonction de détection ne permettent pas de choisir le temps de chauffage. Si le modèle comprend uniquement des programmes préréglés, s assurer de sélectionner un programme qui maintient la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) pendant au moins 10 minutes (±1 minute) et arrêter manuellement le programme après 10 minutes (±1 minute). REMARQUE : la solution de prétraitement est conçue pour une seule application. Ne pas réutiliser. Étape 2 : pepsine prête à l emploi L incubation de la pepsine peut être réalisée à température ambiante (20 25 C), comme décrit dans la méthode A), ou à 37 C, comme décrit dans l a méthode B). Éliminer l excédent de tampon en tapotant. Avec un tissu non pelucheux (tissu absorbant ou tampon de gaze par exemple), essuyer soigneusement le pourtour de l échantillon pour éliminer tout liquide restant et pour garder les réactifs dans la zone prescrite. ( ) K /EFG/ULH/ p. 59/148

60 Cancer du sein Déposer 5 à 8 gouttes (250 µl) de pepsine froide (2 à 8 C) (flacon 2) pour couvrir l échantillon. La pepsine doit toujours être conservée entre 2 et 8 C. Méthode A) Incubation à température ambiante : Incuber à température ambiante (20 à 25 C) pendant 5 à 15 minutes. Une durée d incubation de 10 minutes est adéquate pour la plupart des échantillons, mais la durée d incubation optimale peut dépendre de la fixation des tissus et/ou de l épaisseur de l échantillon et doit être déterminée par l utilisateur. Éliminer l excès de pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans le tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Méthode B) Incubation à 37 C : Placer l échantillon avec la pepsine sur un bloc chauffant à 37 C (par ex. Dako Hybridizer) et incuber pendant 3 minutes. Un temps d incubation de 3 minutes convient pour la plupart des échantillons, mais le temps d incubation optimal peut dépendre de la fixation du tissu et doit être déterminé par l utilisateur. Tapoter pour enlever la pepsine et faire tremper les coupes dans du tampon de lavage dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Renouveler le tampon de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans l éthanol à 70 %, 2 minutes dans l éthanol à 85 % et 2 minutes dans l éthanol à 96 %. Laisser sécher complètement les coupes de tissus à l air libre. Étape 3 : mélange Probe Mix HER2/CEN-17 prêt à l emploi L étape suivante doit être exécutée dans une hotte de laboratoire. Appliquer 10 µl de mélange Probe Mix HER2/CEN-17 (flacon 3) au centre de la coupe de tissu. Placer immédiatement une lamelle de 22 mm x 22 mm sur le mélange Probe Mix et le laisser s étaler régulièrement sous la lame. Éviter la formation de bulles d air. En cas de formation de bulles d air, les éliminer du tissu en tapotant doucement avec une pince. Sceller la lamelle avec de l étanchéisant pour lamelle en éjectant l étanchéisant sur le pourtour de la lame. Laisser l étanchéisant dépasser de la lamelle et de la lame pour former un joint autour de la lamelle. S assurer que l étanchéisant recouvre bien tout le bord de la lamelle. Préparer le Dako Hybridizer* (réf. S2450 ou S2451) pour un cycle d hybridation. S assurer que les bandelettes de contrôle de l humidité Humidity Control Strips (réf. S2452) sont saturées et optimales pour utilisation. Démarrer l Hybridizer et choisir un programme qui va dénaturer à 82 C pendant 5 minutes puis hybrider pendant la nuit (14 à 20 heures) à 45 C (se reporter au manuel d instruction du Dako Hybridizer pour plus de détails). Placer les lames dans l Hybridizer, s assurer que le couvercle est correctement fermé puis lancer le programme. * Les instruments qui permettent d assurer des conditions similaires à celles décrites ci-dessus peuvent être utilisés pour la dénaturation et l hybridation. Placer les lames sur une surface métallique ou en pierre plate (bloc chauffant ou bloc dans un four d hybridation) préchauffé à 82 (±2) C. Dénatu rer pendant 5 minutes en s assurant que la température du bloc ne chute jamais en dessous de 80 C. Placer les lames dans une chambre d hybridation humide préchauffée. Placer un couvercle sur la chambre et laisser incuber pendant la nuit (14 à 20 heures) à 45 (±2) C. Noter qu une température d hybridation de 37 C ne convient pas aux sondes contenues dans ce kit. ( ) K /EFG/ULH/ p. 60/148

61 Cancer du sein JOUR 2 Étape 4 : lavage stringent Remplir deux cuves de coloration, par ex. cuves de Coplin, de solution de tampon de lavage stringent dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.2). Un volume minimum de 100 ml ou 15 ml par lame dans chaque cuve est recommandé. Placer l une des cuves de coloration contenant du tampon de lavage stringent dilué à température ambiante dans une hotte de laboratoire et l autre dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et le tampon de lavage stringent à 65 C. S assurer que la température est stabilisée. Recouvrir la cuve avec un couvercle pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Vérifier la température à l intérieur de la cuve se trouvant au bain-marie à l aide d un thermomètre étalonné pour s assurer que la température est correcte. Le tampon de lavage stringent contient un détergent et peut se troubler à 65 C ; ceci n a ffecte pas les performances. A l aide d une pince ou de gants, sortir les lames de la chambre d hybridation et retirer avec précautions l étanchéisant ainsi que la lamelle et placer les lames l une après l autre dans la cuve de prélavage à température ambiante. Une fois toutes les lamelles retirées, transférer les lames de la cuve de prélavage à température ambiante dans la cuve à 65 C dans le bain-marie. E xécuter un lavage stringent pendant exactement 10 minutes à 65 C. Retirer les lames du tampon de lavage stringent dilué et faire tremper les coupes dans le tampon de lavage dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans l éthanol à 70 %, 2 minutes dans l éthanol à 85 % et 2 minutes dans l éthanol à 96 %. Laisser sécher complètement les coupes de tissus. Étape 5 : montage Appliquer 15 µl de milieu de montage pour fluorescence contenant du DAPI (flacon 5) sur la zone cible de la lame et poser une lamelle en verre. REMARQUE : les lames peuvent être lues après 15 minutes ou dans les 7 jours suivant le montage. Toutefois, une décoloration se produit si les lames sont exposées à la lumière ou à des températures élevées. Pour minimiser la décoloration, stocker les lames à l obscurité entre 2 et 8 C. ( ) K /EFG/ULH/ p. 61/148

62 Cancer du sein Contrôle de qualité Sein 1. Les signaux doivent être de couleur vive, bien distincts et faciles à évaluer. 2. Les cellules normales permettent d effectuer un contrôle interne du cycle de coloration. Les cellules normales doivent montrer 1 à 2 signaux verts clairement visibles indiquant que la sonde CEN-17 PNA a réussi l hybridation de la région centromérique du chromosome 17. Les cellules normales doivent aussi montrer 1 à 2 signaux rouges clairement visibles indiquant que la sonde HER2 ADN a réussi l hybridation de l amplicon HER2. A cause du découpage du tissu, certaines cellules normales ne montreront pas 2 signaux de chaque couleur, mais moins. L absence de détection de signaux dans les cellules normales indique que le test a échoué et les résultats doivent être considérés comme invalides. 3. La morphologie nucléaire doit être intacte lors d une évaluation à l aide d un filtre DAPI. De nombreuses cellules fantômes et une mauvaise morphologie nucléaire générale indiquent une surdigestion de l échantillon ayant entraîné une perte ou une fragmentation des signaux. Ces échantillons doivent être considérés comme invalides. 4. Des différences dans la fixation, le traitement ou l inclusion du tissu au niveau du laboratoire de l utilisateur peuvent produire des variations significatives dans les résultats, ce qui exige une évaluation régulière des contrôles internes. Interprétation de la coloration Sein Tissu évaluable Seuls les échantillons des patients avec des carcinomes invasifs doivent être analysés. Dans les cas d échantillons contenant à la fois des carcinomes in situ et invasifs, seuls les composants invasifs doivent être évalués. Éviter la région de la nécrose et celles où les limites nucléaires sont ambiguës. Ne pas inclure les noyaux réclamant un jugement subjectif. Ne pas inclure les noyaux avec un signal de faible intensité et une coloration de fond non spécifique ou importante. Numération des signaux : localiser la tumeur dans le contexte de la lame marquée à l hématoxyline et à l éosine et évaluer la même zone sur la lame marquée par la procédure FISH. Scanner plusieurs zones des cellules tumorales pour prendre en compte toute hétérogénéité possible. Sélectionner une zone avec une bonne distribution de noyaux. Commencer l analyse dans le quart supérieur gauche de la zone sélectionnée en scannant de gauche à droite, compter le nombre de signaux dans les limites nucléaires de chaque noyau évalué conformément aux directives ci-dessous (voir aussi l Annexe 3). - Régler la mise au point pour trouver tous les signaux dans chaque noyau. - Compter deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comme un seul signal. - Dans les noyaux avec une forte amplification du gène HER2, les signaux HER2 peuvent être placés très proches les uns des autres et former un agrégat de signaux. Dans ce cas, il est impossible de compter le nombre de signaux HER2 mais il doit être estimé. Faire particulièrement attention aux signaux verts car les agrégats de signaux HER2 peuvent couvrir les signaux verts et les rendre impossible à voir. En cas de doute, vérifier les signaux verts à l aide d un filtre FITC spécifique. Ne pas évaluer les noyaux sans signaux ou avec des signaux d une seule couleur. Evaluer uniquement les noyaux avec un ou plusieurs signaux FISH de chaque couleur. ( ) K /EFG/ULH/ p. 62/148

63 Guide de décompte des signaux Cancer du sein 1 Ne pas compter. Les noyaux se chevauchent, toutes les zones des noyaux ne sont pas visibles 2 Deux signaux verts, ne pas évaluer les noyaux avec des signaux d une seule couleur 3 Compter comme 3 signaux verts et 12 signaux rouges (estimation d agrégat) 4 Compter comme 1 signal vert et 1 signal rouge. Deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comptent pour un seul signal 5 Ne pas compter (noyaux surdigérés ou sous-digérés). ou Signaux manquants dans le centre des noyaux (noyaux en forme d anneau). 6 Compter comme 2 signaux verts et 3 signaux rouges. Deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comptent pour un seul signal 7 Compter comme 1 signal vert et 5 signaux rouges 8 Compter comme 3 signaux verts (1 vert flou) et 3 signaux rouges 9 Agrégat de signaux rouges cachant les signaux verts, vérifier les signaux verts à l aide d un filtre FITC spécifique ou ne pas compter Noter le décompte dans un tableau tel que celui donné dans l Annexe 2. Compter 20 noyaux par échantillon de tissu dans une zone distincte des zones tumorales si possible (17). Calculer le rapport HER2/CEN-17 en divisant le nombre total de signaux HER2 rouges par le nombre total de signaux CEN-17 verts. Les échantillons avec un rapport HER2/CEN-17 supérieur ou égal à 2 doivent être considérés comme présentant un gène HER2 amplifié (5, 17-19). Les résultats à la limite ou proche de la limite (1,8 2,2) doivent être interprétés avec prudence. Si le rapport est à ou proche de la limite (1,8 2,2), compter 20 noyaux de plus et recalculer le rapport pour les 40 noyaux. En cas de doute, la lame d échantillon doit être réévaluée. Pour les cas limite, une consultation entre le pathologiste et le médecin traitant est recommandée. ( ) K /EFG/ULH/ p. 63/148

64 Cancer du sein Limites Sein 1. L analyse FISH est un procédé à plusieurs étapes qui nécessite une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés, la sélection des tissus, la fixation et le traitement, la préparation des lames FISH et l interprétation des résultats de la coloration. 2. Les résultats de l analyse FISH dépendent de la manipulation et du traitement du tissu avant la coloration. Une fixation, un lavage, un séchage, un chauffage ou un découpage incorrects, ou une contamination par d autres tissus ou fluides peuvent influencer la sonde d hybridation. Des résultats non cohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d inclusion ou à des irrégularités inhérentes au tissu. 3. Pour des résultats optimaux et reproductibles, les lames de tissus doivent être entièrement déparaffinées. L élimination de la paraffine doit être terminée avant le début du processus de coloration (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section B.2). 4. Utiliser uniquement un bain-marie, un bloc chauffant et un four d hybridation à température étalonnée. L utilisation d autres types d équipement peut entraîner l évaporation du mélange Probe Mix HER2/CEN-17 pendant l hybridation et doit être validée par l utilisateur. Caractéristiques de performance Sein Efficacité de l hybridation L efficacité d hybridation du kit HER2 FISH pharmdx a été testée dans un laboratoire de pathologie de routine. 126 coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine ont été testées suivant la procédure recommandée. Sur les 126 échantillons, 124 ont pu être évalués selon les directives du produit et 2 échantillons n ont pas pu être évalués pour des raisons techniques. En conséquence, l efficacité de l hybridation était de 124/126 = 98 % (20). Sensibilité analytique La sensibilité du mélange Probe Mix HER2/CEN-17 a été testée à l aide d une lignée cellulaire avec amplification et de 2 lignées cellulaires sans amplification du gène HER2. Le rapport entre le nombre de signaux HER2 et CEN-17 a été calculé sur la base du décompte de 60 noyaux par lignée cellulaire. La lignée cellulaire amplifiée a été évaluée comme telle avec un rapport moyen de 3,21, alors que les deux lignées cellulaires non amplifiées ont été évaluées comme telles avec un rapport moyen de 0,96 et 1,17. De plus, les rapports HER2/CEN-17 de 5 coupes de tissu sans amplification du gène HER2 ont été déterminés à l aide du kit HER2 FISH PharmDx. Chaque coupe de tissu a été évaluée par 3 techniciens indépendants. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1. Rapports HER2/CEN-17 dans 5 tissus non amplifiés évalués par 3 techniciens indépendants Tissu 1 Tissu 2 Tissu 3 Tissu 4 Tissu 5 Technicien 1 0,95 1,01 1,04 1,21 1,15 Technicien 2 1,05 1,00 0,99 1,11 1,09 Technicien 3 1,05 1,00 0,92 1,14 1,06 Rapport moyen 1,02 1,00 0,98 1,15 1,10 CV % CV : coefficient de variation L étude a confirmé que les 5 coupes de tissu n étaient pas amplifiées avec un rapport moyen HER2/ CEN-17 proche de 1,0. ( ) K /EFG/ULH/ p. 64/148

65 Cancer du sein Spécificité analytique Les sondes HER2 ADN dans le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 ont été séquencées à la fin et mises sur une carte pour confirmer une couverture totale de 218 kb comprenant le gène HER2. Les sondes CEN-17 PNA dans le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 ont été testées individuellement et combinées pour confirmer leur hybridation spécifique à la région centromérique du chromosome 17. Pour exclure toute hybridation croisée des chromosomes autres que le chromosome 17, des études ont été menées sur des métaphases suivant les procédures standards de CQ de Dako. Un total de 250 métaphases a été évalué pour l hybridation spécifique des mélanges de sonde HER2 ADN et CEN-17 PNA. Dans les 250 cas, l hybridation était spécifique au chromosome 17. Aucune hybridation croisée sur les loci d autres chromosomes n a été observée dans les 250 cas. Études de robustesse La robustesse du test HER2 FISH pharmdx a été testée en variant la durée et la température de prétraitement, la durée d incubation dans la pepsine, la température de dénaturation, la durée et la température d hybridation et la durée et la température du lavage stringent. Aucune différence significative n a été observée dans les résultats dans les conditions expérimentales suivantes : Prétraitement à 7, 10 et 13 minutes combiné à des températures de 89, 92 et C. Durées d incubation dans la pepsine de 2, 5, 10, 15 et 18 minutes. Températures de dénaturation de 72, 77, 82, 87 et 92 C. Durée d hybridation de 17 heures combinée à des températures de 40, 45 et 50 C. Durée d hybridation de 10, 12 et 14 heures à une température de 45 C. Le lavage stringent a été testé pendant 10 minutes à 60, 65 et 70 C. De plus, il a été testé pendant 5, 10 et 15 minutes à 65 C. Le lavage stri ngent pendant 10 minutes à 70 C et pendant 15 minutes à 65 C a entraîné une perte de signaux alors qu aucune différence significative n a été observée dans les résultats aux autres combinaisons de durée/ température. Répétabilité La répétabilité du rapport HER2/CEN-17 a été testée à l aide du kit HER2 FISH pharmdx sur des coupes consécutives de tissu mammaire normal et de carcinome du sein. Le coefficient de variation pour le tissu mammaire normal était de 6 % et 4 % pour le carcinome du sein. Un total de 10 coupes consécutives tissus de cancer du sein avec différentes épaisseurs (duplicats de 3, 4, 5, 6, et 7 µm) a été testé avec le kit HER2 FISH pharmdx. Le coefficient de variation du rapport HER2/CEN-17 dans cette étude était de 12 %, c est-à-dire supérieur à celui des coupes de tissu de même épaisseur. Reproductibilité La reproductibilité de lot à lot, d un jour à l autre et d observateur à observateur du kit HER2 FISH pharmdx a été testée à l aide de 3 lignées cellulaires différentes incluses en paraffine et fixées au formol (MDA-231 et MDA-175 non amplifiées et SKBR3 avec gène HER2 amplifié). La plus grande variation du rapport HER2/CEN-17 (8 %) a été observée dans l étude d observateur à observateur sur la lignée cellulaire amplifiée. Ceci est prévisible et peut refléter une certaine subjectivité dans l interprétation et l énumération des signaux. Les résultats exprimés sous forme de rapport moyen, d écart type et de coefficient de variation sont présentés dans les tableaux 2 à 4. ( ) K /EFG/ULH/ p. 65/148

66 Cancer du sein Tableau 2. Reproductibilité inter-lots. Rapport HER2/CEN-17 mesuré sur 3 lots différents de trousse HER2 FISH pharmdx Lignée cellulaire MDA-231 MDA-175 SKBR3 Rapport Lot 1 Lot 2 Lot 3 Total HER2/CEN-17 Moyen 1,06 1,04 1,07 1,06 ET 0,04 0,04 0,05 0,04 CV % N Moyen 1,23 1,20 1,16 1,20 ET 0,02 0,05 0,07 0,06 CV % N Moyen 3,99 3,77 3,82 3,86 ET 0,18 0,19 0,29 0,23 CV % N ET : Ecart-type CV : Coefficient de variation N : Nombre de lames Tableau 3. Reproductibilité inter-jours. Rapport HER2/CEN-17 mesuré sur 4 jours différents Lignée cellulaire MDA-231 MDA-175 SKBR3 Rapport Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Total HER2/CEN-17 Moyen 1,04 1,03 1,05 0,99 1,03 ET 0,05 0,02 0,03 0,01 0,04 CV % N Moyen 1,26 1,17 1,25 1,16 1,21 ET 0,06 0,04 0,07 0,04 0,07 CV % N Moyen 4,30 4,59 4,56 4,09 4,39 ET 0,39 0,32 0,15 0,08 0,32 CV % N ET : écart-type CV : coefficient de variation N : nombre de lames Tableau 4. Reproductibilité inter-observateurs. Rapport HER2/CEN-17 mesuré par 3 observateurs différents Lignée cellulaire MDA-231 MDA-175 SKBR3 Rapport HER2/CEN-17 Obs. 1 Obs. 2 Obs. 3 Total Moyen 1,03 1,03 1,09 1,05 ET 0,02 0,08 0,05 0,06 CV % N Moyen 1,17 1,15 1,11 1,14 ET 0,02 0,05 0,11 0,07 CV % N Moyen 4,03 3,57 3,63 3,74 ET 0,18 0,19 0,24 0,29 CV % N ET : écart type CV : coefficient de variation N : nombre de lames ( ) K /EFG/ULH/ p. 66/148

67 Cancer du sein Transférabilité du test Pour évaluer la reproductibilité inter-laboratoire (transférabilité du test), une étude comparative en aveugle, randomisée des rapports HER2/CEN-17 mesurés sur 4 échantillons inclus en paraffine, fixés au formol de cancer du sein a été effectuée sur 5 sites d étude différents. Les 4 échantillons inclus dans l étude représentaient divers niveaux d amplification du gène HER2 et avaient été sélectionnés pour refléter une gamme naturelle de taux d amplification, comprenant un échantillon non amplifié (rapport mesuré 0,9 1,2), un échantillon modifié mais non amplifié (rapport mesuré 1,4 1,7), un échantillon faiblement amplifié (rapport mesuré 3,0 4,0) et un échantillon fortement amplifié (rapport mesuré 5,0 8,0). Les 4 échantillons ont été marqués et interprétés sur chaque site dans 3 cycles séparés (12 lames au total). Un contrôle fourni a également été inclus dans chaque cycle. Lors du classement des résultats comme amplification positive ou négative du gène HER2 (rapport limite = 2,0), les 5 sites se sont trouvés entièrement d accord. Voir le tableau 5. Tableau 5. Récapitulatif des résultats de transférabilité Échantillon HER2 négatif HER2 positif Non amplifié 15 0 Modifié mais non amplifié 15 0 Faible amplification 0 15 Forte amplification 0 15 Un écart de 10 % d un jour à l autre du rapport HER2/CEN-17 a été observé dans les 5 laboratoires. Un écart d environ % de site à site du rapport HER2/CEN-17 a été observé dans les échantillons non amplifiés et les échantillons avec des rapports proches de la limite. Ce chiffre correspond aux résultats exprimés dans la documentation. Un écart plus important (25 %) a été observé sur l échantillon fortement amplifié ; cela correspond également à la documentation et cet écart n est pas considéré comme cliniquement pertinent (17). L évaluation des échantillons fortement amplifiés dans lesquels les signaux sont regroupés ne pouvant pas être basée sur un décompte mais sur une estimation du nombre de signaux, on peut s attendre à un écart important dans ces cas. Utilité clinique L utilité clinique du kit Dako HER2 FISH pharmdx a été testée dans une étude comparative avec le kit Vysis PathVysion HER-2 DNA. 150 échantillons archivés de patients avec un cancer du sein à ganglions positifs ou à ganglions négatifs de grade II-III, ont été inclus dans l étude. L objectif primaire de cette étude était de vérifier le degré de concordance entre les rapports HER2/centromère du chromosome 17 des 150 échantillons testés avec les kits Dako et Vysis, à la fois sur le plan de la concordance générale des rapports et de celle des résultats FISH dichotomisés (groupes +/-). Un total de 145 échantillons a été hybridisé et évalué avec succès, et était donc éligible pour l analyse statistique. Le Tableau 6 présente une tabulation croisée 2 x 2 des résultats. ( ) K /EFG/ULH/ p. 67/148

68 Cancer du sein Tableau 6. Résultats dichotomisés de 145 échantillons de cancer du sein testés avec le kit Dako HER2 FISH pharmdx et le kit Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe. 60 noyaux ont été évalués dans chaque échantillon avec chacune des deux kits. Kit Dako (-) amplifié Kit Dako (+) amplifié Somme Kit Vysis (-) amplifié Kit Vysis (+) amplifié Somme La concordance entre les tests Dako et Vysis était de 95 % avec un intervalle de confiance de %. La valeur kappa était 0,89. Le test de McNemars sur le biais systématique entre les deux tests n était pas significatif (p=0,22). La Figure 1 montre une courbe de diffusion des observations appariées pour les 145 échantillons. Figure échantillons de cancer du sein testés pour l amplification du gène HER2 à l aide du kit Dako HER2 FISH pharmdx et du kit Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe. Les résultats sont exprimés sous la forme d un rapport HER2/centromère du chromosome noyaux ont été évalués dans chaque échantillon avec chacune des deux kits. 12,00 Courbe Scatter de diffusion plot of paired des observations observations appariées DakoCytomation HER2 FISH HER2 pharmdx FISH pharmdx Kit Kit g 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis Kit Vysis PathVysion PathVysion HER-2 HER-2 DNA DNA Probe Probe Kit La concordance générale entre les tests Dako HER2 FISH pharmdx et Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe a été vérifiée par une analyse des différences entre les observations appariées de log (rapport) et une analyse de régression linéaire de log (rapport) des deux tests. ( ) K /EFG/ULH/ p. 68/148

69 Cancer du sein La conclusion est que la différence entre les observations appariées de log (rapport) est systématiquement augmentée de la somme des rapports HER2/centromère du chromosome 17 et qu en ce qui concerne les rapports les plus élevés, le rapport mesuré est plus élevé dans le test Dako que dans le test Vysis. Le rapport HER2/centromère du chromosome 17 plus élevé observé dans le test avec le kit Dako HER2 FISH pharmdx peut être lié à une différence vraie entre les deux tests, par ex. une résolution plus élevée du kit Dako HER2 FISH pharmdx donne des rapports également plus élevés dans les cas de forte amplification du gène HER2. Cependant, les kits ont été testés sur 2 sites différents et on s attend à un écart entre les laboratoires. De plus, un écart plus important dans les cas de forte amplification, qui n est pas considéré comme cliniquement pertinent (18), est mentionné dans la documentation. L étude actuelle ne permet pas l investigation d une différence systématique entre les deux tests dans plusieurs laboratoires. Il faut ajouter que l écart observé entre les deux tests est d une importance similaire à celui observé entre sites dans l étude de transférabilité. La méthode HER2 FISH est relativement longue à appliquer ceci étant dû principalement au décompte conventionnel des signaux dans un nombre considérable de cellules tumorales dans chaque échantillon. Cependant, l analyse de sous-groupe de données dans l étude comparative du kit Dako HER2 pharmdx et du kit Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe supporte l utilisation de méthodes de décompte simplifiées. Le tableau 7 présente les résultats de test obtenus lors de l analyse de 145 échantillons de cancer du sein à l aide du kit Dako HER2 pharmdx et après décompte de 10, 20, 30 et 60 événements (signaux) dans un minimum de 6 cellules pour chaque échantillon. De plus, le tableau 7 présente les résultats des analyses statistiques de ces «méthodes de décompte d événements fixes» comparées au test Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe et au décompte des signaux dans 60 cellules. Il faut noter que le décompte d un nombre fixe d événements implique le décompte d un nombre relativement plus élevé de noyaux dans les échantillons avec des rapports HER2/centromère du chromosome 17 proches de la limite, que dans les échantillons avec gène HER2 fortement amplifié, et donc positifs sans ambiguïté. Tableau 7. Concordance et valeurs kappa lors du décompte d un nombre fixe d événements (signaux). Comparaison entre le décompte de 10, 20, 30 et 60 événements dans le test Dako HER2 FISH pharmdx et le décompte des signaux dans 60 noyaux dans le test Vysis PathVysion HER-2 DNA. L intégralité des 145 échantillons de cancer du sein a été testée pour l amplification du gène HER2 par les 5 méthodes. Kit Vysis ( ) amplifié (n=97) Trousse Dako ( ) (+) amp. amp. Décompte jusqu à 10 événements Décompte jusqu à 20 événements Décompte jusqu à 30 événements Décompte jusqu à 60 événements Kit Vysis (+) amplifié (n=48) ( ) amp. (+) amp. Concordance IC à 95% Valeur kappa Test de McNemar (valeur p) ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,96 0,92 0,99 0,91 0, ,97 0,93 0,99 0,92 0,19 IC : intervalle de confiance N : nombre d échantillons Comparées au décompte des signaux dans 60 noyaux, la concordance et les valeurs kappa restent inchangées, c est-à-dire avec un IC se chevauchant, pour les 4 méthodes de décompte d événements fixes testées. Le nombre de noyaux comptés par chaque méthode de décompte d événements fixes a été étudié. Le tableau 8 présente un résumé des résultats. ( ) K /EFG/ULH/ p. 69/148

70 Cancer du sein Tableau 8. Nombre de noyaux comptés par les 4 méthodes de décompte d événements fixes Méthode de décompte Décompte jusqu à 10 événements Décompte jusqu à 20 événements Décompte jusqu à 30 événements Décompte jusqu à 60 événements Médiane Nombre de noyaux Gamme Nombre de noyaux 90 %- quantile Nombre de noyaux La possibilité d un décompte de signaux dans moins de 60 noyaux a également été étudiée. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le Tableau 9. Tableau 9. Concordance et valeurs kappa lors du décompte d un nombre fixe de cellules. Comparaison entre le décompte des signaux dans 10, 20 et 30 noyaux dans le test Dako HER2 FISH pharmdx et le décompte des signaux dans 60 noyaux dans le test Vysis PathVysion HER-2 DNA. L intégralité des 145 échantillons de cancer du sein a été testée pour l amplification du gène HER2 par les 4 méthodes. Kit Vysis (-) amplifié (n=97) Kit Vysis (+) amplifié (n=48) Concordance IC à 95 % Valeur kappa Test de McNemar (valeur p) Kit Dako (-) amp. (+) amp. (-) amp. (+) amp. Décompte de 10 noyaux Décompte de 20 noyaux Décompte de 30 noyaux ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0,34 IC : intervalle de confiance N : nombre d échantillons Comparées au décompte des signaux dans 60 noyaux, la concordance et les valeurs kappa restent inchangées, c est-à-dire avec un IC se chevauchant, pour les 3 méthodes testées de décompte de 10, 20 et 30 noyaux. Donc, l analyse statistique supporte l évaluation des échantillons sur la base du décompte de signaux dans 10 noyaux. ( ) K /EFG/ULH/ p. 70/148

71 Dépannage Sein Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Pas de signal ou signaux faibles 2. Pas de signaux verts 3. Pas de signaux rouges 1a. Le kit a été exposé à des températures élevées pendant le transport ou le stockage. 1b. Le microscope ne fonctionne pas correctement - Mauvais jeu de filtres - Mauvaise lampe - Lampe à mercure trop vieille - Lentilles du collecteur sales et/ou fissurées - Mauvaise huile d immersion 1c. Signaux décolorés 1d. Mauvaise conditions de prétraitement 1e. Évaporation du mélange Probe Mix pendant l hybridation 2a. Mauvaises conditions de lavage stringent 3a. Mauvaise conditions de prétraitement Cancer du sein 1a. Vérifier les conditions de stockage. S assurer qu il y avait de la glace sèche à la réception de colis. S assurer que les flacons 2, 3 et 5 ont bien été conservés à une température maximale de 2 8 C, et les flacons 3 et 5 à l obscurité. 1b. Vérifier le microscope et s assurer que les filtres utilisés conviennent pour les fluorochromes du kit et que la lampe au mercure est la bonne et qu elle n a pas été utilisée au delà de sa durée de vie prévue. (voir l Annexe 3). En cas de doute, contacter le distributeur local du microscope. 1c. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l exposition aux sources de lumière vive. 1d. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées. 1e. Assurer une humidité suffisante dans la chambre d hybridation. 2a. S assurer que la température et la durée de lavage stringent recommandées sont bien respectées et que les lamelles sont retirées avant le lavage stringent 3a. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées. ( ) K /EFG/ULH/ p. 71/148

72 Cancer du sein Problème Cause probable Mesure suggérée 4. Zones sans signal 4a. Volume de sonde insuffisant 4a. Veiller à ce que le volume de sonde soit suffisant pour couvrir la zone sous la lamelle. 5. Coloration de fond excessive 6. Mauvaise morphologie tissulaire 4b. Bulles d air formées durant l application du mélange Probe Mix ou durant le montage. 5a. Mauvaise fixation du tissu. 5b. Élimination incomplète de la paraffine. 5c. Température du lavage stringent trop basse. 5d. Exposition prolongée de la coupe hybridisée à une lumière vive. 6a. Mauvais traitement à la pepsine 6b. De mauvaises conditions de prétraitement peuvent causer un aspect trouble ou laiteux. 6c. Un traitement trop long à la pepsine ou des coupes très fines peuvent faire apparaître des cellules fantômes ou en forme d anneau. 4b. Éviter la formation de bulles d air. Si des bulles sont observées, les éliminer en tapotant doucement. 5a S assurer que seules des coupes de tissus incluses en paraffine fixées au formol sont utilisées. 5b. Suivre les procédures de déparaffinisation et de réhydratation décrites dans la section B.2. 5c. S assurer que la température du lavage stringent est 65 (±2) C. 5d. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l exposition à la lumière vive. 6a. Respecter les durées d incubation dans la pepsine recommandées. Voir section B.2, étape.2. S assurer que la pepsine est manipulée à la température correcte. Voir Section B.1. 6b. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées. 6c. Raccourcir la durée d incubation dans la pepsine. Voir section B.3, étape.2. S assurer que le volume de sonde est suffisant pour couvrir la zone sous la lamelle est 4 à 6 µm. REMARQUE : si le problème ne peut pas être attribué à l une des causes ci-dessus, ou si la mesure préconisée ne parvient pas à le résoudre, contacter les services techniques Dako. ( ) K /EFG/ULH/ p. 72/148

73 Cancer du sein Annexe 1 Sein Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Liste de contrôle du protocole Date (Jour 1) du cycle : Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Lot : ID de l échantillon : ID de l équipement : ID du registre du cycle de coloration : Date de dilution/d expiration du tampon de lavage x 1 (flacon 6 dilué à 1:20) : / Tissu fixé dans du formol tamponné neutre Oui Non JOUR 1 Étape 1 : prétraitement Date de dilution/d expiration de la solution de prétraitement (flacon 1 dilué à 1:20) / Température mesurée de la solution de prétraitement (95 99 C) si le chauffage se fait au bain-marie Prétraitement (10 minutes) et refroidissement (15 minutes) Lavage dans le tampon de lavage (flacon 6 dilué à 1:20) (2 x 3 minutes) Étape 2 : pepsine Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à 37 C ou Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à température ambiante Lavage dans le tampon de lavage (flacon 6 dilué à 1:20) (2 x 3 minutes) Déshydratation des lames (3 x 2 minutes) dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et séchage à l air libre Étape 3 : mélange HER2/CEN-17 Probe Mix Appliquer le mélange Probe Mix (flacon 3), poser une lamelle et sceller avec de l étanchéisant pour lamelle C minutes minutes Température de dénaturation mesurée (82 ± 2 C) C Dénaturation pendant 5 minutes Température d hybridation mesurée (45 ± 2 C) C Hybridation pendant la nuit (protéger de la lumière) JOUR 2 Étape 4 : lavage stringent Date de dilution/d expiration du tampon de lavage stringent (flacon 4 dilué à 1:20) / Température mesurée du tampon de lavage stringent (65 C) C Lavage stringent (10 minutes) après retrait des lamelles Lavage dans le tampon de lavage (flacon 6 dilué à 1:20) (2 x 3 minutes) Déshydratation des lames (3 x 2 minutes) dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et séchage à l air libre Étape 5 : montage Appliquer 15 µl de milieu de montage pour fluorescence (flacon 5) et poser une lamelle Commentaires : Date et signature du technicien : ( ) K /EFG/ULH/ p. 73/148

74 Cancer du sein Annexe 2 Sein Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Feuille d évaluation ID du registre du cycle de coloration : Date (Jour 1) du cycle : Kit HER2 FISH pharmdx TM, réf. K5331 Lot : ID de l échantillon : Décompte des signaux dans 20 noyaux Nº du noyau HER2 score (rouge) CEN-17 score (vert) Nº du noyau Total (1-10) Total (11-20) HER2 score (rouge) CEN-17 score (vert) Pour la détermination du rapport HER2/CEN-17, compter le nombre de signaux HER2 et celui des signaux CEN-17 sur les 20 mêmes noyaux et diviser le nombre total de signaux HER2 par le total de signaux CEN-17. Si le rapport HER2/CEN-17 est limite (1,8 à 2,2), compter 20 noyaux supplémentaires et calculer à nouveau le rapport. Un rapport à la limite ou proche de la limite (1,8 à 2,2) doit être interprété avec prudence (voir le guide de décompte). Score total (1-20) HER2 CEN-17 Rapport HER2/CEN-17 Rapport < 2 : aucune amplification du gène HER2 observée Rapport 2 : amplification du gène HER2 observée Date et signature du technicien : Date et signature du pathologiste : Pour les directives d évaluation : voir la section Interprétation de la coloration. ( ) K /EFG/ULH/ p. 74/148

75 Cancer du sein Annexe 3 Sein Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Spécifications du microscope à fluorescence Dako recommande l équipement suivant pour une utilisation avec le kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 : 1. Type de microscope Microscope à épifluorescence 2. Lampe Lampe à mercure de 100 watts (noter la durée d utilisation). 3. Objectifs Pour la sélection des tissus, des objectifs de fluorescence secs 10X ou à bain d huile 16X conviennent. Pour un fort grossissement et l évaluation des signaux, seul des objectifs de fluorescence à immersion d huile, par ex. 100x, sont recommandés. 4. Filtres Les filtres sont conçus individuellement pour des fluorochromes spécifiques et doivent être choisis en conséquence. Dako recommande l utilisation d un filtre DAPI spécifique combiné à un double filtre Texas Red/FITC de haute qualité. Filtre DAPI, par ex. filtre Chroma # Double filtre Texas Red/FITC, par ex. filtre Chroma # Les filtres Texas Red et FITC simples peuvent être utilisés pour la confirmation. Fluorochrome Longueur d onde d excitation Longueur d onde d émission FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Les filtres sont spécifiques à chaque type de microscope et l utilisation des filtres appropriés est cruciale pour l interprétation. Pour obtenir des informations détaillées, contacter le fournisseur du microscope ou votre représentant Dako. 5. Huile Huile non fluorescente. Précautions d emploi L emploi d une lampe au mercure de 50 watts n est pas recommandé. Les filtres rhodamine ne peuvent pas être utilisés. Les filtres triples ne sont pas recommandés. Un microscope non optimisé peut causer des problèmes pour la lecture des signaux fluorescents. Il est important que la source de lumière n ait pas dépassé la date de péremption et qu elle soit correctement alignée et centrée. Les clients doivent contrôler et suivre les recommandations du fabricant concernant la lampe à mercure. Le microscope doit être maintenu et la lampe à mercure doit être dans l alignement avant l interprétation des résultats. Tous les efforts doivent être faits pour exposer l échantillon le moins possible à la lumière d excitation pour minimiser la décoloration de la fluorescence. Nous recommandons que vous discutiez du paramétrage de votre microscope particulier avant de commencer l hybridation in situ fluorescente ou de vous reporter à la documentation. ( ) K /EFG/ULH/ p. 75/148

76 Cancer de l estomac Résumé et explication Estomac Le gène humain HER2 (également connu sous le nom de ERBB2 ou NEU) se trouve sur le chromosome 17 et code la protéine HER2 ou p185 HER2. La protéine HER2 est un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase possédant une homologie avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR ou HER1) (1, 2). Le gène HER2 est présent en 2 copies dans toutes les cellules diploïdes normales. La surexpression de la protéine HER2 et l amplification du gène HER2 dans le cancer gastrique ont été démontrées dans un grand nombre d études (celles-ci sont passées en revue à la référence (21)). La positivité à la HER2 peut être détectée dans environ 20 % des patients par ICH ou FISH (21). Les études précliniques in vitro et in vivo ont démontré l efficacité du trastuzumab (Herceptin ) dans divers types de cancers de l estomac, conduisant ainsi à la réalisation de plusieurs études cliniques (21-25). Dans une étude de phase III BO18255, l essai ToGA, des patients positifs à la HER2 atteints d adénocarcinomes gastriques ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancés, récurrents et/ou métastatiques inopérables ont reçu de manière aléatoire du 5-FU ou de la capécitabine et de la cisplatine, seuls ou en association avec le trastuzumab. Un accroissement statistiquement significatif de la survie globale (SG) a été observé chez les patients ayant reçu un traitement combiné de trastuzumab et de chimiothérapie (26). Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé qui se lie avec une forte affinité à la protéine HER2 et s est avéré inhiber la prolifération des cellules tumorales humaines qui surexpriment la protéine HER2 in vitro et in vivo (22 25). Principe de la procédure Estomac Le kit HER2 FISH pharmdx contient tous les réactifs nécessaires pour réaliser une procédure FISH sur des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Après déparaffinage et réhydratation, les échantillons sont chauffés dans la solution de prétraitement pendant 10 minutes. L étape suivante implique une digestion protéolytique avec de la pepsine prête à l emploi soit à température ambiante soit à 37 C. Le temps d incubation optimal de la pepsine dépend des antécédents de fixation du tissu et doit être déterminé par l utilisateur mais 10 minutes à température ambiante ou 3 minutes à 37 C conviennent pour la plupart des échantillons. Après les étapes de chauffage et de digestion protéolytique, cette trousse emploie un mélange (FISH Probe Mix) prêt à l emploi basé sur l association des technologies PNA (peptide d acide nucléique) (12) et ADN. Le Probe Mix se compose d un mélange de sondes ADN marquées au Texas Red couvrant une région de 218 kb incluant le gène HER2 sur le chromosome 17, et d un mélange de sondes PNA marquées à la fluorescéine dirigées contre la région centromérique du chromosome 17 (CEN-17). L hybridation spécifique des deux cibles entraîne la formation d un signal rouge fluorescent distinct sur chaque locus du gène HER2 et d un signal vert fluorescent distinct sur chaque centromère du chromosome 17. Pour diminuer la coloration de fond, le mélange Probe Mix contient également des sondes de blocage PNA non marquées. Après un lavage stringent, les échantillons sont montés avec un milieu de montage fluorescent contenant du DAPI et recouvert par une lamelle. À l aide d un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés (voir Annexe 3), les cellules tumorales sont localisées et une numération des signaux rouges (HER2 ) et verts (CEN-17) est effectuée. Puis, le rapport HER2/CEN-17 est calculé. Les cellules normales dans la coupe de tissu analysée servent de contrôle positif interne de l efficacité du prétraitement et de l hybridation. Pour plus de détails, voir la section Interprétation des résultats de la coloration. Pour une formation en ligne interactive, utiliser le programme de formation en ligne HER2 FISH pharmdx conçu pour former rapidement et avec précision les techniciens de laboratoire, les pathologistes et les scientifiques aux techniques nécessaires pour obtenir des résultats optimaux avec le kit HER2 FISH pharmdx : ( ) K /EFG/ULH/ p. 76/148

77 Cancer de l estomac Réactifs Estomac Matériel fourni Le matériel énuméré ci-dessous est suffisant pour 20 tests (un test est défini comme une zone cible de 22 mm x 22 mm). Le nombre de tests est basé sur l utilisation de 5 à 8 gouttes (250 µl par lame pour le flacon 2, 10 µl par lame pour le flacon 3 et 15 µl par lame pour le flacon 5). Le kit fournit suffisamment de matériaux pour 10 cycles de coloration. Le kit HER2 FISH pharmdx est expédiée sur de la glace sèche. Pour être sûr que les éléments du kit n ont pas été exposés à des températures élevées pendant le transport, on doit trouver de la glace sèche à la réception. Noter que certains éléments peuvent rester décongelés, mais cela n affecte pas les performances du kit HER2 FISH pharmdx. Flacon 1 Flacon 2 Flacon 3 Flacon 4 Flacon 5 Flacon 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentré 20x Tampon MES (acide 2-[N-morpholino]éthanesulphonique). Pepsin 7,5 ml, prêt à l emploi Solution de pepsine, ph 2,0 ; contient un stabilisateur et un agent antimicrobien. HER2/CEN-17 Probe Mix 0,2 ml, prêt à l emploi Mélange de sondes ADN HER2 marquées au Texas Red et de sondes PNA CEN-17 marquées à la fluorescéine ; fournies dans un tampon d hybridation avec 45 % de formamide, stabilisateur et sondes de blocage PNA non marquées. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentré 20x Tampon SSC (solution saline/citrate de sodium) avec détergent. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, prêt à l emploi Milieu de montage pour fluorescence avec 100 µg/l de DAPI (dihydrochlorure de 4,6-diamidino-2-phénylindole). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentré 20x Tampon Tris/HCl Coverslip Sealant 1 tube, prêt à l emploi Solution étanchéisante amovible pour lamelle REMARQUE : tous les réactifs, y compris la solution de prétraitement, le tampon de lavage stringent et le milieu de montage pour fluorescence, sont formulés spécifiquement pour être utilisés avec ce test. ( ) K /EFG/ULH/ p. 77/148

78 Matériel requis mais non fourni Réactifs de laboratoire Eau distillée ou dé-ionisée Éthanol à 96 % Xylène ou substituts de xylène Cancer de l estomac Equipement de laboratoire Tissus absorbants Pipettes réglables Thermomètre d immersion partielle étalonné (plage de 37 à 100 C) Thermomètre de surface étalonné (plage de 37 à 100 C) Lamelles (22 mm x 22 mm) Pince Hotte de laboratoire Dako Hybridizer (réf. S2450 ou S2451)* Lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou lames revêtues de poly-l-lysine (voir Préparation des échantillons) Cuves ou bains de coloration Minuteur (avec capacité de 2 à 15 mn) Bain-marie avec couvercle (capable de maintenir la température entre 65 C et 99 C) Four à micro-ondes avec fonction de détection si le prétraitement est réalisé à l aide d un four à micro-ondes (voir B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, Méthode B) * Un bloc chauffant ou un four d hybridation pour la dénaturation (82 C (±2 C)) et l hybridation (45 C (±2 C)), associés à une chambre d hybridation humide, peuvent être utilisés en remplacement du Dako Hybridizer. Microscope et accessoires Filtres pour microscope à fluorescence : double filtre DAPI et FITC/Texas Red, ou filtres simples FITC et Texas Red (voir les détails dans l Annexe 3) Un microscope à fluorescence avec une lampe à mercure de 100 watts est recommandé Boîte de rangement des lames de microscope (plateau en carton pour 20 lames avec couvercle à charnières ou similaire) Précautions Estomac 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Pour utilisateurs professionnels. 3. Le flacon 1, solution de prétraitement (20x), contient 1-<20 % d acide 2-morpholinoéthanesulphonique, le flacon 2, Pepsine, contient 5 10 % de propane-2-ol, le flacon 4, tampon de lavage stringent (20x), contient 1-<5 % d octoxinol et le flacon 6, tampon de lavage (20x), contient 1-<20 % de trométamol. Aux concentrations du produit, ces substances ne nécessitent pas d étiquetage de sécurité. La fiche de données de sécurité (FDS) est disponible sur demande pour les utilisateurs professionnels. 4. Le flacon 2, pepsine, contient de la pepsine A qui peut provoquer une réaction allergique. 5. Le flacon 3, MELANGE Probe Mix HER2/CEN-17 contient 45 % de formamide et est étiqueté : Toxique. R61 Risques pendant la grossesse d effets néfastes pour l enfant. S45 En cas d accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible, lui montrer l étiquette). S53 Éviter l exposition - se procurer des instructions spéciales avant l utilisation. S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. ( ) K /EFG/ULH/ p. 78/148

79 Cancer de l estomac En règle générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent avoir été soigneusement formés à la procédure opérationnelle correcte, et informés des propriétés dangereuses du produit et des consignes de sécurité requises. Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 6. L étanchéisant pour lamelle contient 60 à 100 % de naphta (pétrole), fraction légère hydrotraitée, et il est étiqueté : Extrêmement inflammable. Dangereux pour l environnement. R11 Facilement inflammable. R51/53 Toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner des effets néfastes à long terme pour l environnement aquatique. S9 Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé. S16 Conserver à l écart de toute flamme ou source d étincelles Ne pas fumer. S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu en prenant toutes les précautions d usage. S57 Utiliser un récipient approprié pour éviter toute contamination du milieu ambiant. S61 Éviter le rejet dans l environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de données de sécurité. Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 7. Les échantillons, avant et après la fixation, ainsi que tous les matériaux qui y ont été exposés, doivent être manipulés comme s ils pouvaient transmettre une infection, et être éliminés avec toutes les précautions nécessaires (16). Ne pas pipeter les réactifs à la bouche et éviter tout contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs et les échantillons. Si les réactifs entrent en contact avec des zones sensibles, laver abondamment à l eau. 8. Minimiser tout risque de contamination microbienne des réactifs afin d éviter des résultats erronés. 9. Toute modification des durées et des températures d incubation spécifiées est susceptible d entraîner des résultats erronés. 10. Toute modification des méthodes de fixation des tissus et des épaisseurs d échantillons spécifiées peut affecter la morphologie tissulaire et/ou l intensité du signal. 11. Éviter l évaporation du mélange Probe Mix HER2/CEN-17 pendant l hybridation en assurant une humidité suffisante dans la chambre d hybridation. 12. Les réactifs sont à dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut se traduire par un affaiblissement des performances. 13. Porter un équipement de protection approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. Se reporter à la fiche toxicologique (MSDS) pour plus d informations. 14. En raison de la nature hétérogène des échantillons de cancers gastriques, il est important de procéder à l examen approfondi de la totalité de l échantillon afin d évaluer la distribution des signaux avant de sélectionner une zone particulière pour le décompte des signaux. 15. Il n est pas recommandé d évaluer des échantillons de très petite taille (c.-à-d. que les échantillons doivent posséder une morphologie intacte et suffisamment de noyaux pour permettre le décompte). 16. Si l analyse FISH de HER2 est réalisée sur un échantillon issu d une biopsie, il faut, pour assurer une détermination fiable du statut de HER2, analyser plusieurs échantillons de biopsies évaluables (7 à 8) provenant de différentes régions de la tumeur. 17. Pour identifier tous les centres tissulaires d un échantillon de biopsie, il est important d examiner la lame colorée à l hématoxyline et à l éosine. ( ) K /EFG/ULH/ p. 79/148

80 Cancer de l estomac Conservation Estomac Conserver à l obscurité entre 2 et 8 C. Tous les r éactifs tolèrent une conservation au congélateur. La congélation et la décongélation des réactifs pour chaque analyse n affectent pas les performances. La pepsine, le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 et le milieu de montage pour fluorescence (flacons 2, 3 et 5) peuvent s altérer s ils sont exposés à la chaleur. Ne pas laisser ces éléments à température ambiante. Le mélange HER2/CEN-17 et le milieu de montage pour fluorescence (flacons 3 et 5) peuvent s altérer s ils sont exposés à une lumière vive. Ne pas conserver ces éléments, ni procéder à l analyse sous une lumière trop vive telle que la lumière du soleil. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur la boîte. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles spécifiées dans la notice contenue dans le kit, les performances des réactifs doivent être validées par l utilisateur (13). Aucun signe visible n indique l instabilité du produit. Il est donc important d évaluer les cellules normales dans la coupe de tissu analysée. Si un profil de fluorescence imprévu est observé qui ne peut pas être expliqué par des changements de procédures de laboratoire et qu un problème avec le kit HER2 FISH pharmdx est suspecté, contacter nos services techniques. Préparation des échantillons Estomac Les échantillons d adénocarcinomes de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne issus de biopsies, d excisions ou de résections doivent être manipulés de manière à préserver les tissus pour une analyse FISH. Les méthodes standards de traitement des tissus pour un immunomarquage doivent être utilisées pour tous les échantillons (14). Lors du test de petits échantillons de biopsie, s assurer de disposer de la morphologie tumorale intacte et de la présence de suffisamment de cellules tumorales pour l évaluation IHC. Si l analyse FISH de HER2 est réalisée sur un échantillon issu d une biopsie, il faut, pour assurer une détermination fiable du statut de HER2, analyser plusieurs échantillons de biopsies évaluables (7 à 8). Coupes incluses en paraffine Seuls les tissus préservés dans du formol tamponné neutre et ceux inclus en paraffine conviennent à cet usage. Les échantillons doivent par exemple être coupés en blocs de 3 à 4 mm d épaisseur et fixés durant 18 à 24 heures dans du formol neutre tamponné. Les échantillons de biopsies ont été fixés pendant 6 à 8 heures lors de l essai ToGA (pour des détails sur l étude, se reporter à la référence (26)). Les tissus sont alors déshydratés dans une série de bains d éthanol et de xylène à des concentrations de plus en plus élevées, pour être ensuite infiltrés avec de la paraffine liquide maintenue à une température maximale de 60 C. Les tissus, fixés et inclus correctement, se conservent indéfiniment avant la coupe et le montage sur lame s ils sont stockés au frais (15 à 25 C) (14, 15). Les autres fixateurs ne conviennent pas. Les échantillons de tissus doivent être découpés en tranches de 3 à 6 µm. Les lames nécessaires pour l analyse de l amplification du gène HER2 et la vérification de la présence d une tumeur doivent être préparées au même moment. Un minimum de 2 coupes consécutives est recommandé, 1 coupe pour détecter la présence d une tumeur colorée à l hématoxyline et l éosine (coloration H&E), et 1 coupe pour l analyse de l amplification du gène HER2. Il est recommandé de monter les coupes de tissu sur des lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou des lames revêtues de poly-l-lysine. Les échantillons doivent être analysés dans les 4 à 6 mois suivant la coupe lorsqu ils sont conservés à température ambiante (20 25 C). ( ) K /EFG/ULH/ p. 80/148

81 Cancer de l estomac INSTRUCTIONS D UTILISATION Estomac A. Préparation des réactifs Estomac Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant la coloration : A.1 Solution de prétraitement Des cristaux peuvent se former dans le flacon 1, mais ils se dissolvent à température ambiante. S assurer qu il n y a pas de cristaux avant de préparer le réactif. Préparer une quantité suffisante du flacon 1 (solution de prétraitement 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. La solution diluée inutilisée peut être conservée à 2 8 C pendant un mois. Jeter la soluti on diluée si elle a un aspect trouble. A.2 Tampon de lavage stringent Préparer une quantité suffisante du flacon 4 (tampon de lavage stringent 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s il a un aspect trouble. A.3 Tampon de lavage Préparer une quantité suffisante du flacon 6 (Tampon de lavage 20x) en diluant le concentré à 1:20 dans de l eau distillée ou dé-ionisée. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s il a un aspect trouble. A.4 Série de bains d éthanol A partir d une solution d éthanol à 96 %, préparer 3 cuves contenant de l éthanol à 70 %, à 85 % et à 96 % respectivement. Stocker les cuves recouvertes d un couvercle à température ambiante ou entre 2 et 8 C et les utiliser pour un maximum de 200 lames. Jeter les solutions si elles ont un aspect trouble. B. Procédure de coloration Estomac B.1 Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire soigneusement les instructions et se familiariser avec tous les composants avant utilisation (voir Précautions). Si les composants du kit sont congelés pour la conservation, il est recommandé de mettre les réactifs entre 2 et 8 C le jour précédent l analys e pour permettre un équilibrage correct de la température. Tous les réactifs doivent être équilibrés à la température correcte avant utilisation comme suit : Flacon 1 : la solution de prétraitement diluée doit être équilibrée entre 95 et 99 C si un bainmarie est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, méthode A). Si un four à micro-ondes avec fonction de détection est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration. Étape 1 : prétraitement, méthode B), la solution de prétraitement diluée doit être équilibrée à température ambiante (20 25 C). Flacon 2 : la température de la pepsine pour l application doit se situer entre 2 et 8 C et elle doit rester constamment froide. Flacon 3 : le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. Flacon 4 : tampon de lavage stringent dilué ; une cuve doit être équilibrée à température ambiante et l autre à 65 C avant utilisation. Flacon 5 : le milieu de montage pour fluorescence peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. Flacon 6 : le tampon de lavage dilué doit être équilibré à température ambiante entre 20 et 25 C. L étanchéisant pour lamelle peut être appliqué à n importe quelle température entre 2 et 25 C. ( ) K /EFG/ULH/ p. 81/148

82 Toutes les étapes doivent être exécutées à la température indiquée. Cancer de l estomac La procédure comprend plusieurs déshydratations suivies d un séchage des coupes de tissu. S assurer que les coupes de tissu sont complètement sèches avant de passer à l étape suivante. Ne pas laisser les coupes de tissus se dessécher pendant les autres étapes de la procédure. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans du Tampon de lavage après l étape de déparaffinage et pendant une heure maximum à température ambiante (20 25 C) sans que cela n affecte les rés ultats. B.2 Traitement des tissus avant coloration Déparaffinage et réhydratation : avant l analyse, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d éliminer le milieu d inclusion puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Les résidus de milieu d inclusion provoquent un accroissement du nombre de colorations non spécifiques. Cette étape doit être exécutée à température ambiante (20 25 C). 1. Placer les lames dans un bain de xylène et laisser incuber pendant 5 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 2. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans l éthanol à 96 % pendant 2 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 3. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans l éthanol à 70 % pendant 2 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 4. Éliminer l excès de liquide en tapotant et placer les lames dans le tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.3) pendant 2 minutes minimum. Commencer la procédure de coloration comme indiqué dans la Section B.3, Étape 1, Prétraitement. Les solutions de xylène et d alcool doivent être changées au maximum toutes les 200 lames. Les substituts de xylène peuvent être utilisés. REMARQUE : les réactifs et les instructions fournis dans cette trousse ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des températures d incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Toute différence de traitement des tissus ou de procédure technique dans le laboratoire de l utilisateur peut invalider les résultats du test. B.3 Protocole de coloration JOUR 1 Étape 1 : prétraitement Le prétraitement peut être réalisé soit en utilisant un bain-marie, comme décrit dans la méthode A), soit en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection, comme décrit dans la méthode B). Méthode A) Prétraitement à l aide d un bain-marie : Remplir les cuves, par ex. cuves de Coplin, de Solution de prétraitement diluée (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la solution de prétraitement dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et la solution de prétraitement entre 95 et 99 C. Vérifier la tem pérature à l intérieur de la cuve à l aide d un thermomètre étalonné pour s assurer que la température est correcte. Recouvrir les cuves avec des couvercles afin de stabiliser la température et d éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées à température ambiante dans les cuves de coloration contenant la solution de prétraitement préchauffée. Vérifier à nouveau la température et laisser incuber pendant 10 (±1) minutes de 95 à 99 C. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Retirer le couvercle et laisser les lames refroidir dans la solution de prétraitement pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (de 20 à 25 C). Renouveler le tampon de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. ( ) K /EFG/ULH/ p. 82/148

83 Cancer de l estomac Méthode B) Prétraitement à l aide d un four à micro-ondes avec fonction de détection : Remplir une cuve en plastique de solution de prétraitement diluée à température ambiante (20 25 C). Immerger les coupes déparaffinées dans la solution de prétraitement, recouvrir la cuve d un couvercle percé et la placer dans le four à micro-ondes. Sélectionner la fonction de détection de l ébullition ainsi qu un programme qui s exécute pendant 10 minutes après avoir atteint la température d ébullition*. Après les 10 minutes d incubation, sortir la cuve contenant les lames du four. Retirer le couvercle et laisser refroidir pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du tampon de lavage dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Renouveler le tamp on de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. * L utilisation d un four à micro-ondes doté d une fonction de détection de l ébullition signifie que le four doit être doté d un capteur et de programmes qui chauffent d abord la Solution de prétraitement jusqu à ébullition puis maintiennent la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) tout en décomptant le temps prédéterminé (10 minutes (±1 minute)). Il est possible que certains modèles de fours à micro-ondes avec fonction de détection ne permettent pas de choisir le temps de chauffage. Si le modèle comprend uniquement des programmes préréglés, s assurer de sélectionner un programme qui maintient la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) pendant au moins 10 minutes (±1 minute) et arrêter manuellement le programme après 10 minutes (±1 minute). REMARQUE : la solution de prétraitement est conçue pour une seule application. Ne pas réutiliser. Étape 2 : pepsine prête à l emploi L incubation de la pepsine peut être réalisée à température ambiante (20 25 C), comme décrit dans la méthode A), ou à 37 C, comme décrit dans l a méthode B). Éliminer l excédent de tampon en tapotant. Avec un tissu non pelucheux (tissu absorbant ou tampon de gaze par exemple), essuyer soigneusement le pourtour de l échantillon pour éliminer tout liquide restant et pour garder les réactifs dans la zone prescrite. Déposer 5 à 8 gouttes (250 µl) de pepsine froide (2 à 8 C) (flacon 2) pour couvrir l échantillon. La pepsine doit toujours être stockée entre 2 et 8 C. Méthode A) Incubation à température ambiante : Incuber à température ambiante (20 à 25 C) pendant 5 à 15 minutes. Une durée d incubation de 10 minutes est adéquate pour la plupart des échantillons, mais la durée d incubation optimale peut dépendre de la fixation des tissus et/ou de l épaisseur de l échantillon et doit être déterminée par l utilisateur. Éliminer l excès de pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans le tampon de lavage dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Méthode B) Incubation à 37 C : Placer l échantillon avec la pepsine sur un bloc chauffant à 37 C (par ex. Dako Hybridizer) et incuber pendant 3 minutes. Une durée d incubation de 3 minutes est adéquate pour la plupart des échantillons, mais la durée d incubation optimale peut dépendre de la fixation des tissus et/ou de l épaisseur de l échantillon et doit être déterminée par l utilisateur. Tapoter pour enlever la pepsine et faire tremper les coupes dans du tampon de lavage dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Renouveler le tampon de lavage et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans l éthanol à 70 %, 2 minutes dans l éthanol à 85 % et 2 minutes dans l éthanol à 96 %. Laisser sécher complètement les coupes de tissus à l air libre. ( ) K /EFG/ULH/ p. 83/148

84 Étape 3 : mélange Probe Mix HER2/CEN-17 prêt à l emploi L étape suivante doit être exécutée dans une hotte de captation des fumées. Cancer de l estomac Appliquer 10 µl de mélange Probe Mix HER2/CEN-17 (flacon 3) au centre de la coupe de tissu. Placer immédiatement une lamelle de 22 mm x 22 mm sur le mélange Probe Mix et le laisser s étaler régulièrement sous la lame. Éviter la formation de bulles d air. En cas de formation de bulles d air, les éliminer du tissu en tapotant doucement avec une pince. Sceller la lamelle avec de l étanchéisant pour lamelle en éjectant l étanchéisant sur le pourtour de la lame. Laisser l étanchéisant dépasser de la lamelle et de la lame pour former un joint autour de la lamelle. S assurer que l étanchéisant recouvre bien tout le bord de la lamelle. Préparer le Dako Hybridizer* (réf. S2450 ou S2451) pour un cycle d hybridation. S assurer que les bandelettes de contrôle de l humidité Humidity Control Strips (réf. S2452) sont saturées et optimales pour utilisation. Démarrer l Hybridizer et choisir un programme qui va dénaturer à 82 C pendant 5 minutes puis hybrider pendant la nuit (14 à 20 heures) à 45 C (veuillez vous reporter au manuel d instruction du Dako Hybridizer pour plus de détails). Placer les lames dans l Hybridizer, s assurer que le couvercle est correctement fermé puis lancer le programme. * Les instruments qui permettent d assurer des conditions similaires à celles décrites ci-dessus peuvent être utilisés pour la dénaturation et l hybridation. Placer les lames sur une surface métallique ou en pierre plate (bloc chauffant ou bloc dans un four d hybridation) préchauffé à 82 (±2) C. Dénatu rer pendant 5 minutes en s assurant que la température du bloc ne chute pas en dessous de 80 C à tout moment. Placer les lames dans une chambre d hybridation humide préchauffée. Placer un couvercle sur la chambre et laisser incuber pendant la nuit (14 à 20 heures) à 45 (±2) C. Noter qu une température d hybridation de 37 C ne convient pas aux sondes contenues dans cette trousse. JOUR 2 Étape 4 : lavage stringent Remplir deux cuves de coloration, par ex. cuves de Coplin, de solution de tampon de lavage stringent dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.2). Un volume minimum de 100 ml ou 15 ml par lame dans chaque cuve est recommandé. Placer l une des cuves de coloration contenant du tampon de lavage stringent dilué à température ambiante dans une hotte de captation des fumées et l autre dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et le tampon de lavage stringent à 65 C. S assurer que la température s est stabilisée. Recouvrir la cuve avec un couvercle pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Vérifier la température à l intérieur de la cuve se trouvant au bain-marie à l aide d un thermomètre étalonné pour s assurer que la température est correcte. Le tampon de lavage stringent contient un détergent et peut se troubler à 65 C ; ceci n affecte pas les performances. A l aide d une pince ou de gants, sortir les lames de la chambre d hybridation et retirer avec précautions l étanchéisant ainsi que la lame et placer les lames l une après l autre dans la cuve de prélavage à température ambiante. Une fois toutes les lamelles retirées, transférer les lames de la cuve de prélavage à température ambiante dans la cuve à 65 C dans le bain-marie. E xécuter un lavage stringent pendant exactement 10 minutes à 65 C. Retirer les lames du tampon de lavage stringent dilué et faire tremper les coupes dans le tampon de lavage dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans l éthanol à 70 %, 2 minutes dans l éthanol à 85 % et 2 minutes dans l éthanol à 96 %. Laisser sécher complètement les coupes de tissus. ( ) K /EFG/ULH/ p. 84/148

85 Cancer de l estomac Étape 5 : montage Appliquer 15 µl de milieu de montage pour fluorescence contenant du DAPI (flacon 5) sur la zone cible de la lame et poser une lamelle en verre. REMARQUE : les lames peuvent être lues après 15 minutes ou dans les 7 jours suivant le montage. Toutefois, une décoloration se produit si les lames sont exposées à la lumière ou à des températures élevées. Pour minimiser la décoloration, stocker les lames à l obscurité entre 2 et 8 C. Contrôle de qualité Estomac 1. Les signaux doivent être de couleur vive, bien distincts et faciles à évaluer. 2. Les cellules normales permettent d effectuer un contrôle interne du cycle de coloration. Les cellules normales doivent montrer 1 à 2 signaux verts clairement visibles indiquant que la sonde CEN-17 PNA a réussi l hybridation de la région centromérique du chromosome 17. Les cellules normales doivent aussi montrer 1 à 2 signaux rouges clairement visibles indiquant que la sonde HER2 ADN a réussi l hybridation de l amplicon HER2. A cause du découpage du tissu, certaines cellules normales ne montreront pas 2 signaux de chaque couleur, mais moins. L absence de détection de signaux dans les cellules normales indique que le test a échoué et les résultats doivent être considérés comme invalides. 3. La morphologie nucléaire doit être intacte lors d une évaluation à l aide d un filtre DAPI. De nombreuses cellules fantômes et une mauvaise morphologie nucléaire générale indiquent une surdigestion de l échantillon ayant entraîné une perte ou une fragmentation des signaux. Ces échantillons doivent être considérés comme invalides. 4. Le nombre minimum de cellules tumorales pour l évaluation est de Des différences dans la fixation, le traitement ou l inclusion du tissu au niveau du laboratoire de l utilisateur peuvent produire des variations significatives dans les résultats, ce qui exige une évaluation régulière des contrôles internes. Interprétation de la coloration Estomac Tissu évaluable Localiser la tumeur dans le contexte de la lame marquée à l hématoxyline et à l éosine et évaluer la même zone sur la lame marquée par la procédure FISH (dans le filtre DAPI). Seuls les échantillons de patients atteints d un adénocarcinome de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, doivent être évalués. Dans les cas de métaplasie intestinale et d adénocarcinome gastrique dans le même échantillon, seule la composante adénocarcinome gastrique doit être évaluée. Éviter la région de la nécrose et celles où les limites nucléaires sont ambiguës. Ne pas inclure les noyaux réclamant un jugement subjectif. Ne pas inclure les noyaux avec un signal de faible intensité et une coloration de fond non spécifique ou importante. Commencer par l évaluation au microscope de l ensemble de la lame colorée par la procédure FISH puis de la zone affectée sur la coupe colorée à l hématoxyline et à l éosine, respectivement. Avant de passer à la numération de la lame colorée par la procédure FISH, noter la répartition générale du signal (homogène ou hétérogène) sur la feuille de numération des signaux. En cas de répartition hétérogène, noter si on observe une amplification des cellules focalisée ou en mosaïque. 1) Répartition homogène du signal En cas de répartition homogène, compter le nombre de centromères chromosomiques (signaux verts) et le nombre de gènes HER2 (signaux rouges) dans 20 cellules de une ou deux zones représentatives de la tumeur. 2) Répartition hétérogène du signal En cas de répartition hétérogène du signal, compter un total de 20 cellules sur des zones sélectionnées, comme indiqué ci-après : ( ) K /EFG/ULH/ p. 85/148

86 Cancer de l estomac A) S il existe une amplification focalisée, sélectionner les zones avec des cellules amplifiées. B) S il existe une répartition en mosaïque ou amplifiée, avec présence de cellules à polysomes et disomes, effectuer le décompte dans les zones à cellules amplifiées. Dans ces zones, non seulement les cellules amplifiées doivent être comptées, mais les cellules adjacentes non amplifiées doivent l être également pour un total de 20 cellules. Si possible, ne pas sélectionner de zones se chevauchant. Ignorer la coloration de l ADN bactérien Un certain nombre de cellules spécialisées (mastocytes et macrophages), dispersés dans le tissu gastrique, montrent un degré de coloration élevé avec la sonde HER2 en raison de la présence d ADN bactérien. Les cellules sont colorées en rouge, très fluorescentes, et se distinguent clairement des cellules tumorales avec une amplification importante du gène HER2. Numération des signaux Lorsqu une zone a été sélectionnée pour l évaluation des signaux, commencer l analyse dans l un des 20 noyaux voisins choisis, puis effectuer le décompte cellule par cellule, en n ignorant que les noyaux ne répondant pas aux critères de qualité. Compter le nombre de signaux dans la limite nucléaire de chaque noyau évalué, conformément aux directives ci-dessous (voir également l Annexe 7). - Régler la mise au point pour trouver tous les signaux dans chaque noyau. - Compter deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comme un seul signal. La distance doit être au moins égale à un signal de taille normale, pour pouvoir compter deux signaux comme des signaux distincts. Lorsque la distance entre deux signaux est inférieure au diamètre d un signal, ils doivent être comptés comme un seul signal. - Dans les noyaux avec une forte amplification du gène HER2, les signaux HER2 peuvent être placés très proches les uns des autres et former un agrégat de signaux. Dans ce cas, il est impossible de compter le nombre de signaux HER2 mais il doit être estimé. Faire particulièrement attention aux signaux verts car les agrégats de signaux rouges HER2 peuvent couvrir les signaux verts et les rendre impossible à voir. En cas de doute, vérifier les signaux verts à l aide d un filtre FITC spécifique. Ne pas évaluer les noyaux sans signaux ou avec des signaux d une seule couleur. Évaluer uniquement les noyaux avec un ou plusieurs signaux FISH de chaque couleur. Guide de décompte des signaux 1 Ne pas compter. Les noyaux se chevauchent, toutes les zones des noyaux ne sont pas visibles 2 Deux signaux verts, ne pas évaluer les noyaux avec des signaux d une seule couleur 3 Compter comme 3 signaux verts et 12 signaux rouges (estimation d agrégat) 4 Compter comme 1 signal vert et 1 signal rouge. Deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comptent pour un seul signal 5 Ne pas compter (noyaux surdigérés ou sous-digérés). ou Signaux manquants dans le centre des noyaux (noyaux en forme d anneau). ( ) K /EFG/ULH/ p. 86/148

87 Cancer de l estomac 6 Compter comme 2 signaux verts et 3 signaux rouges. Deux signaux de la même dimension et séparés d une distance égale ou inférieure à leur diamètre comptent pour un seul signal. 7 Compter comme 1 signal vert et 5 signaux rouges 8 Compter comme 3 signaux verts (1 vert flou) et 3 signaux rouges. 9 Agrégat de signaux rouges cachant les signaux verts, vérifier les signaux verts à l aide d un filtre FITC spécifique ou ne pas compter. Noter le décompte des signaux dans un tableau comme celui donné dans les Annexes 5 et 6. Compter 20 noyaux par échantillon tissulaire, avec des échantillons issus si possible de zones tumorales distinctes. Calculer le rapport HER2/CEN-17 en divisant le nombre total de signaux HER2 rouges par le nombre total de signaux CEN-17 verts. Les échantillons avec un rapport HER2/CEN-17 supérieur ou égal à 2 doivent être considérés comme présentant un gène HER2 amplifié (27). Les résultats à la limite ou proche de la limite (1,8 2,2) doivent être interprétés avec prudence. Si le rapport est à, ou proche de, la limite (1,8 2,2), compter 40 noyaux de plus et recalculer le rapport pour les 40 noyaux. Si le décompte continue à se montrer limite, le résultat de la seconde évaluation est considéré comme valide. Si elle est possible, une coloration immunohistochimique de l HER2 doit être effectuée pour une meilleure orientation au cours du second décompte. En cas de doute, la lame d échantillon doit être réévaluée. Pour les cas limite, une consultation entre le pathologiste et le médecin traitant est recommandée. Limites Estomac 1. L analyse FISH est un procédé à plusieurs étapes qui nécessite une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés, la sélection des tissus, la fixation et le traitement, la préparation des lames FISH et l interprétation des résultats de la coloration. 2. Les résultats de l analyse FISH dépendent de la manipulation et du traitement du tissu avant la coloration. Une fixation, un lavage, un séchage, un chauffage ou un découpage incorrects, ou une contamination par d autres tissus ou fluides peuvent influencer la sonde d hybridation. Des résultats non cohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d inclusion ou à des irrégularités inhérentes au tissu. 3. Pour des résultats optimaux et reproductibles, les lames de tissus doivent être entièrement déparaffinées. L élimination de la paraffine doit être terminée avant le début du processus de coloration. (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section B.2). 4. Utiliser uniquement un bain-marie, un bloc chauffant et un four d hybridation à température étalonnée. L utilisation d autres types d équipement peut entraîner l évaporation du mélange Probe Mix HER2/CEN-17 pendant l hybridation et doit être validée par l utilisateur. ( ) K /EFG/ULH/ p. 87/148

88 Cancer de l estomac Caractéristiques de performance Estomac Contexte L innocuité et l efficacité du trastuzumab (Herceptin ) ont été démontrées dans une étude clinique (l essai ToGA) (26). Cette étude a été conçue comme une étude multicentrique de phase III, ouverte et randomisée portant sur des patients positifs à la HER2, atteints d adénocarcinomes gastriques ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancés, récurrents et/ou métastatiques inopérables. Dans l essai ToGA, la positivité à la HER2 a été définie comme déterminée par IHC (3+) (HercepTest, Dako) et/ou par HER2 FISH (HER2/CEN-17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Après leur enrôlement dans l étude, les patients recevaient de manière aléatoire une chimiothérapie (5-FU ou capécitabine et cisplatine) ou une chimiothérapie plus du trastuzumab. Le principal résultat final de l étude était la survie globale (SG). Dans cette étude randomisée portant sur 594 patients, 584 ont reçu le médicament de l étude et ont été inclus dans l intégralité de l ensemble des analyses. Concernant le principal résultat final, la combinaison chimiothérapie plus trastuzumab s est avérée statistiquement supérieure à la chimiothérapie seule. La SG médiane est passée de 11,1 à 13,8 mois (p=0,0046) avec un taux de risque de 0,74 (IC à 95 % : 0,60 à 0,91). Les courbes de Kaplan-Meier pour la SG sont présentées à la Figure 2. Probabilité de survie 1,0 0,9 0,8 0,7 Test de Mantel-Cox P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Durée (mois) Nbre restant Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Groupe de traitement Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 2. Courbe de Kaplan-Meier de la SG (n=584). Des analyses exploratoires préalablement spécifiées portant sur des sous-groupes par statut de HER2 ont été réalisées une fois les données disponibles ; et consécutif à cela, deux nouveaux sous-groupes HER2 se sont constitués basés sur l évaluation IHC : Groupe 1 («groupe à faible expression de la HER2») : IHC 0/FISH+ et IHC 1+/FISH+ (n=131) Groupe 2 («groupe à forte expression de la HER2») : IHC 2+/FISH+ et IHC 3+ (FISH+ ou FISH - ou FISH sans résultat) (n=446) Lorsque l analyse primaire de la SG a été répétée après cela pour le «groupe à forte expression de la HER2» (n=446), l avantage du traitement combiné était encore supérieur. La SG médiane du groupe de patients ayant reçu une chimiothérapie plus du trastuzumab atteignait 16,0 mois contre 11,8 pour les patients sous chimiothérapie seule. Le taux de risque de cette analyse a ( ) K /EFG/ULH/ p. 88/148

89 Cancer de l estomac diminué à 0,65 (IC à 95 % : 0,51 à 0,83). Les courbes de Kaplan-Meier pour la SG du «groupe à forte expression de la HER2» sont présentées à la Figure 3. Probabilité de survie 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Durée (mois) Nbre restant Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Groupe de traitement Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 3. Courbe de Kaplan-Meier pour la SG du «groupe à forte expression de la HER2» (n=446). L étude BO18255 a mis en évidence l utilité clinique à la fois du test HercepTest et du kit HER2 FISH pharmdx dans le cadre de l évaluation du statut de HER2 chez les patients atteints d adénocarcinomes gastriques ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancés, récurrents et/ou métastatiques inopérables. Sensibilité analytique La sensibilité analytique du mélange HER2/CEN-17 Probe Mix a fait l objet d une étude sur 18 échantillons d adénocarcinome gastrique. Le rapport entre le nombre de signaux HER2 et CEN-17 a été calculé sur la base du décompte de 20 noyaux par lignée cellulaire entourant la tumeur. Le rapport HER2/CEN-17 a été évalué entre 0,91 et 1,09, ce qui se situait dans les critères d acceptation pré-établis. Spécificité analytique Les sondes HER2 ADN dans le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 ont été séquencées à la fin et mises sur une carte pour confirmer une couverture totale de 218 kb comprenant le gène HER2. Les sondes CEN-17 PNA dans le mélange Probe Mix HER2/CEN-17 ont été testées individuellement et combinées pour confirmer leur hybridation spécifique à la région centromérique du chromosome 17. Afin d exclure toute hybridation croisée de chromosomes autres que le chromosome 17, les études ont été réalisées sur des métaphases. Un total de 250 métaphases a été évalué pour l hybridation spécifique des mélanges de sonde HER2 ADN et CEN-17 PNA. Dans les 250 cas, l hybridation était spécifique au chromosome 17. Aucune hybridation croisée sur les loci d autres chromosomes n a été observée dans les 250 cas. ( ) K /EFG/ULH/ p. 89/148

90 Cancer de l estomac Études de robustesse La robustesse du test HER2 FISH pharmdx a été testée en variant la durée et la température de prétraitement, la durée d incubation dans la pepsine, la température de dénaturation, la durée et la température d hybridation, la durée et la température du lavage stringent et la concentration du tampon. Aucune différence significative n a été observée dans les résultats dans les conditions expérimentales suivantes : Prétraitement à 7, 9, 10, 11 et 13 minutes à C. Prétraitement à 89, 92 et ºC pendant 10 minutes. Durées d incubation dans la pepsine de 2, 2½, 3 et 4 minutes à 37 C. Températures de dénaturation de 72, 77, 82, 87 et 92 C durant 5 minutes. Durées d hybridation de 10, 12 et 14 heures. Températures d hybridation de 40, 45 et 50 C. Lavage stringent durant 5, 10 et 15 minutes à 65 C. Lavage stringent à 60, 65 et 70 C durant 10 minut es. Concentration du tampon pour lavage stringent à 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 et 1:40. Remarque : pour les tests de robustesse, seul un paramètre de la procédure de coloration a été modifié à la fois tandis que les autres paramètres étaient conservés. Il est recommandé de respecter les durées et températures indiquées dans la procédure de coloration. Répétabilité La répétabilité du rapport HER2/CEN-17 a été testée à l aide du kit HER2 FISH pharmdx sur trois coupes consécutives provenant de 9 échantillons différents d adénocarcinome gastrique. Le coefficient de variation était de 1 à 5 %, ce qui se situait dans les critères d acceptation pré-établis. La répétabilité sur des coupes consécutives d échantillons d adénocarcinome gastrique (IHC HER2 2+) de différentes épaisseurs (2 à 7 µm) a été testée avec le kit HER2 FISH pharmdx. Le coefficient de variation du rapport HER2/CEN-17 lors de cette étude était de 2 à 6 %, c est-à-dire de même ordre que celui des coupes tissulaires de même épaisseur et se situait dans les critères d acceptation pré-établis. Reproductibilité La reproductibilité d un jour à l autre (inter-jours), d un site à l autre (inter-sites) et d un observateur à l autre (inter-observateurs) a été testée à l aide du kit HER2 FISH pharmdx. Des coupes provenant de 24 échantillons différents de cancer gastrique, obtenues à partir d estomac (75 %) ou de la jonction gastro-œsophagienne (25 %) ont été colorées puis analysées sur cinq jours non consécutifs par deux observateurs et sur trois sites. Le rapport HER2/CEN-17 a été évalué à partir de 720 numérations de signaux au total (voir tableau 10). Les échantillons se composaient de résections chirurgicales (70 %) et de biopsies (30 %) avec un nombre égal d échantillons non amplifiés, d échantillons IHC 2+ (déterminé à l aide du test HercepTest ) et d échantillons amplifiés. Tableau 10. Déterminations du rapport HER2/CEN-17 à partir de 720 numérations de signaux Site 1 Observateurs Site 2 Observateurs Site 3 Observateurs A B C D E F Total Jour Jour Jour Jour Jour Total ( ) K /EFG/ULH/ p. 90/148

91 Cancer de l estomac Le CV moyen (écart-type / moyenne x 100) pour le rapport HER2/CEN-17, déterminé pour chaque observateur à partir des huit échantillons dans chaque catégorie (cinq observations par bloc), est présenté au tableau 11. Les CV moyens globaux pour chaque observateur étaient de 5,4 %, 3,8 %, 12,0 %, 11,9 %, 4,7 % et 24,4 %, respectivement (tableau 11). Les CV moyens déterminés dans chaque catégorie pour l ensemble des observations combinées (jours, sites, observateurs) étaient de 22,8 %, 16,5 % et 25,2 % dans les catégories non amplifié, IHC 2+ et amplifié, respectivement. Tableau 11. Le CV (%) inter-jours moyen pour chaque observateur et le CV (%) moyen pour l ensemble des numérations dans les trois catégories. CV (%) moyens Site 1 Observateurs Site 2 Observateurs Site 3 Observateurs Tous les sites Tous les observateurs A B C D E F Non amplifié 5,4 4,7 8,1 16,3 3,1 20,6 22,8 IHC 2+ 6,2 3,9 8,9 7,5 4,5 17,2 16,5 Amplifié 4,7 2,9 19,1 11,9 6,6 35,3 25,2 Toutes les catégories 5,4 3,8 12,0 11,9 4,7 24,4 21,5 Le tableau 11 présente le CV (%) moyen pour chaque observateur aux trois sites (variation interjours) pour les déterminations des rapports HER2/CEN-17. Dans la dernière colonne, le CV (%) moyen est présenté pour toutes les déterminations effectuées pour chaque échantillon dans les trois catégories. En utilisant des modèles statistiques des composants de la variance, il a été mis en évidence que la variation associée à l échantillon contribuait pour une grande majorité à la variation inter-jours, inter-sites et inter-observateurs. Efficacité de l hybridation L efficacité d hybridation du kit HER2 FISH pharmdx a été testée dans le cadre de l étude de reproductibilité. Sur les 360 coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine testées sur les trois sites de l étude, 358 ont pu être évaluées conformément aux recommandations du produit. En conséquence, l efficacité de l hybridation était de 99,4 %. ( ) K /EFG/ULH/ p. 91/148

92 Dépannage Estomac Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Pas de signal ou signaux faibles 2. Pas de signaux verts 3. Pas de signaux rouges 4. Zones sans signal 1a. Le kit a été exposé à des températures élevées pendant le transport ou le stockage 1b. Le microscope ne fonctionne pas correctement - Mauvais jeu de filtres - Mauvaise lampe - Lampe à mercure trop vieille - Lentilles du collecteur sales et/ou fissurées - Mauvaise huile d immersion 1c. Signaux décolorés 1d. Mauvaise conditions de prétraitement 1e. Évaporation du mélange Probe Mix pendant l hybridation 2a. Mauvaises conditions de lavage stringent 3a. Mauvaise conditions de prétraitement 4a. Volume de sonde insuffisant 4b. Bulles d air formées durant l application du mélange Probe Mix ou durant le montage Cancer de l estomac 1a. Vérifier les conditions de stockage. S assurer qu il y avait de la glace sèche à la réception de colis. S assurer que les flacons 2, 3 et 5 ont bien été stockés à une température maximale de 2 8 C, et les flacons 3 et 5 à l obscurité. 1b. Vérifier le microscope et s assurer que les filtres utilisés conviennent pour les fluorochromes du kit et que la lampe au mercure est la bonne et qu elle n a pas été utilisée au delà de sa durée de vie prévue. (voir l Annexe 7). En cas de doute, contacter le distributeur local du microscope. 1c. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l exposition aux sources de lumière vive. 1d. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées 1e. Assurer une humidité suffisante dans la chambre d hybridation 2a. S assurer que la température et la durée de lavage stringent recommandées sont bien respectées et que les lamelles sont retirées avant le lavage stringent 3a. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées 4a. Veiller à ce que le volume de sonde soit suffisant pour couvrir la zone sous la lamelle 4b. Éviter la formation de bulles d air. Si des bulles sont observées, les éliminer en tapotant doucement ( ) K /EFG/ULH/ p. 92/148

93 Problème Cause probable Mesure suggérée 5. Coloration de fond excessive 5a. Mauvaise fixation du tissu 6. Mauvaise morphologie tissulaire 5b. Élimination incomplète de la paraffine 5c. Température du lavage stringent trop basse 5d. Exposition prolongée de la coupe hybridisée à une lumière vive 6a. Mauvais traitement à la pepsine 6b. De mauvaises conditions de prétraitement peuvent causer un aspect trouble ou laiteux. 6c. Un traitement trop long à la pepsine ou des coupes très fines peuvent faire apparaître des cellules fantômes ou en forme d anneau. Cancer de l estomac 5a. S assurer que seules des coupes de tissus incluses en paraffine fixées au formol sont utilisées. 5b. Suivre les procédures de déparaffinisation et de réhydratation décrites dans la section B.2 5c. S assurer que la température du lavage stringent est 65 (±2) C. 5d. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l exposition à la lumière vive. 6a. Respecter les durées d incubation dans la pepsine recommandées. Voir section B.2, étape.2. S assurer que la pepsine est manipulée à la température correcte. Voir Section B.1 6b. S assurer que la température et la durée de prétraitement recommandées sont bien respectées 6c. Raccourcir la durée d incubation dans la pepsine. Voir section B.3, étape.2. S assurer que le volume de sonde est suffisant pour couvrir la zone sous la lamelle est 3 à 6 µm. REMARQUE : si le problème ne peut pas être attribué à l une des causes ci-dessus, ou si la mesure préconisée ne parvient pas à le résoudre, contacter les services techniques Dako. ( ) K /EFG/ULH/ p. 93/148

94 Cancer de l estomac Annexe 4 Estomac Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Liste de contrôle du protocole Date (Jour 1) du cycle : Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Lot : ID de l échantillon : ID de l équipement : ID du registre du cycle de coloration : Date de dilution/d expiration du tampon de lavage x 1 (flacon 6 dilué à 1:20) : / Tissu fixé dans du formol tamponné neutre Oui Non JOUR 1 Étape 1 : prétraitement Date de dilution/d expiration de la solution de prétraitement (flacon 1 dilué au 1:20) / Température mesurée de la solution de prétraitement (95 99 C) si le chauffage se fait au bain-marie Prétraitement (10 minutes) et refroidissement (15 minutes) Lavage dans le tampon de lavage (flacon 6 dilué au 1:20) (2 x 3 minutes) Étape 2 : pepsine Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à 37 C ou Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à température ambiante Lavage dans le Tampon de lavage (flacon 6 dilué au 1:20) (2 x 3 minutes) Déshydratation des lames (3 x 2 minutes) dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et séchage à l air libre Étape 3 : mélange HER2/CEN-17 Probe Mix Appliquer le mélange Probe Mix (flacon 3), poser une lamelle et sceller avec de l étanchéisant pour lamelle Température de dénaturation mesurée (82 ± 2 C) C Dénaturation pendant 5 minutes Température d hybridation mesurée (45 ± 2 C) C Hybridation pendant la nuit (protéger de la lumière) JOUR 2 Étape 4 : lavage stringent Date de dilution/d expiration du tampon de lavage stringent (flacon 4 dilué au 1:20) / Température mesurée du tampon de lavage stringent (65 C) C Lavage stringent (10 minutes) après retrait des lamelles Lavage dans le Tampon de lavage (flacon 6 dilué au 1:20) (2 x 3 minutes) Déshydratation des lames (3 x 2 minutes) dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et séchage à l air libre Étape 5 : montage Appliquer 15 µl de milieu de montage pour fluorescence (flacon 5) et poser une lamelle Commentaires : C minutes minutes heures Date et signature du technicien : ( ) K /EFG/ULH/ p. 94/148

95 Cancer de l estomac Annexe 5 Estomac Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Feuille d évaluation Kit HER2 FISH pharmdx TM, réf. K5331 Lot : ID du registre du cycle de coloration : Date (Jour 1) du cycle : ID de l échantillon : Caractéristiques de la répartition du signal dans le tissu : Homogène : Hétérogène focalisée : ou Hétérogène mosaïque : Décompte des signaux dans 20 noyaux Nº des noyaux Rouge (HER2) Vert (CEN-17) Nº des noyaux Rouge (HER2) Vert (CEN-17) Total 1-10 Total Pour la détermination du rapport HER2/CEN-17, compter le nombre de signaux HER2 et celui des signaux CEN-17 sur les 20 mêmes noyaux et diviser le nombre total de signaux HER2 par le total de signaux CEN-17. Si le rapport HER2/CEN-17 est limite (1,8 à 2,2), compter 40 noyaux supplémentaires et calculer à nouveau le rapport (se rapporter au schéma d évaluation pour le nouveau décompte). HER2 FISH HER2 CEN-17 Rapport HER2/CEN-17 SCORE TOTAL (1-20) Rapport < 2 : aucune amplification du gène HER2 observée Rapport 2 : amplification du gène HER2 observée Date et signature du technicien : Date et signature du pathologiste : Pour les directives d évaluation : voir la section Interprétation de la coloration. ( ) K /EFG/ULH/ p. 95/148

96 Cancer de l estomac Annexe 6 Estomac Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Schéma d évaluation du nouveau décompte Kit HER2 FISH pharmdx TM, réf. K5331 Lot : ID du registre du cycle de coloration : Date (Jour 1) du cycle : ID de l échantillon : Nº des Rouge noyaux HER2 Vert CEN-17 Signaux dans les 40 noyaux supplémentaires (1 40) Nº des Rouge noyaux HER2 Vert CEN-17 Nº des Rouge noyaux HER2 Vert CEN Nº des Rouge noyaux HER2 Vert CEN-17 Total Total Total Total Pour la détermination du rapport HER2/CEN-17, compter le nombre de signaux HER2 et celui des signaux CEN-17 sur les 40 mêmes noyaux et diviser le nombre total de signaux HER2 par le total de signaux CEN-17. Indiquer le score total des noyaux 1 à 40 dans le tableau ci-dessous. HER2 FISH HER2 CEN-17 Rapport HER2/CEN-17 SCORE TOTAL (1-40) Rapport < 2 : aucune amplification du gène HER2 observée Rapport 2 : amplification du gène HER2 observée Date et signature du technicien : Date et signature du pathologiste : Pour les directives d évaluation : voir la section Interprétation de la coloration. ( ) K /EFG/ULH/ p. 96/148

97 Cancer de l estomac Annexe 7 Estomac Kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 Spécifications du microscope à fluorescence Dako recommande l équipement suivant pour une utilisation avec le kit HER2 FISH pharmdx, réf. K5331 : 1. Type de microscope Microscope à épifluorescence 2. Lampe Lampe à mercure de 100 watts (noter la durée d utilisation). 3. Objectifs Pour la sélection des tissus, des objectifs de fluorescence secs 10X ou à immersion d huile 16X conviennent. Pour un fort grossissement et l évaluation des signaux, seul des objectifs de fluorescence à immersion d huile, par ex. 100X, sont recommandés. 4. Filtres Les filtres sont conçus individuellement pour des fluorochromes spécifiques et doivent être choisis en conséquence. Dako recommande l utilisation d un filtre DAPI spécifique combiné à un double filtre Texas Red/FITC de haute qualité. Filtre DAPI, par ex. filtre Chroma # Double filtre Texas Red/FITC, par ex. filtre Chroma # Les filtres Texas Red et FITC simples peuvent être utilisés pour la confirmation. Fluorochrome Longueur d onde d excitation Longueur d onde d émission FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Les filtres sont spécifiques à chaque type de microscope et l utilisation des filtres appropriés est cruciale pour l interprétation. Pour obtenir des informations détaillées, contacter le fournisseur du microscope ou votre représentant Dako. 5. Huile Huile non fluorescente. Précautions d emploi L emploi d une lampe au mercure de 50 watts n est pas recommandé. Les filtres rhodamine ne peuvent pas être utilisés. Les filtres triples ne sont pas recommandés. Un microscope non optimisé peut causer des problèmes pour la lecture des signaux fluorescents. Il est important que la source de lumière n ait pas dépassé la date de péremption et qu elle soit correctement alignée et centrée. Les clients doivent contrôler et suivre les recommandations du fabricant concernant la lampe à mercure. Le microscope doit être maintenu et la lampe à mercure doit être dans l alignement avant l interprétation des résultats. Tous les efforts doivent être faits pour exposer l échantillon le moins possible à la lumière d excitation pour minimiser la décoloration de la fluorescence. Nous recommandons que vous discutiez du paramétrage de votre microscope particulier avant de commencer l hybridation in situ fluorescente ou de vous reporter à la documentation. ( ) K /EFG/ULH/ p. 97/148

98 DEUTSCH Verwendungszweck HER2 FISH pharmdx Kit ist ein In-situ-Hybridisierungsassay unter direkter Fluoreszenz (FISH) für die quantitative Bestimmung der HER2-Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Mammakarzinom-Schnitten und FFPE-Proben von Patienten mit Magenadenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs. Das HER2 FISH pharmdx Kit ist zusätzlich zu HercepTest für die Bewertung von Patientinnen indiziert, für die eine Behandlung mit Herceptin (Trastuzumab) in Erwägung gezogen wird. Mit dem HER2 FISH pharmdx Kit erhaltene Resultate dienen als Adjunkt zu den klinischpathologischen Informationen, die gegenwärtig für die Erhebung der Prognose bei Patientinnen mit einem Mammakarzinom, Stadium II, mit positivem Lymphknotenbefund genutzt werden. Magen-Adenokarzinom einschließlich des ösophagogastralen Übergangs wird in diesem Dokument auch als Magenkrebs bezeichnet. Für Anwendungen bei einem Mammakarzinom siehe Seite 99 bis 122. Für Anwendungen bei Magenkrebs siehe Seite 123 bis 145. Wichtig: Bitte die Unterschiede zwischen Brustkrebsgewebe und Magenkrebsgewebe beachten, besonders im Abschnitt Auswertung der Färbung ( ) K /EFG/ULH/ p. 98/148

99 Brustkrebs Zusammenfassung und Erläuterung - Brustkrebs Das humane HER2-Gen (auch ERBB2 oder NEU) ist auf Chromosom 17 lokalisiert und kodiert das HER2-Protein oder p185 HER2. Als eine Membranrezeptor-Tyrosinkinase zeigt das HER2-Protein Rezeptorhomologie mit dem Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR oder HER1) (1-2). Das HER2-Gen liegt in allen normalen diploiden Zellen in 2 Kopien vor. Bei einem gewissen Anteil von Patientinnen mit Mammakarzinom erfolgt die Amplifikation des HER2-Gens als Bestandteil des Prozesses der malignen Transformation und der Tumorprogression (3-8). Generell führt die HER2-Genamplifikation zur Überexpression des HER2-Proteins auf der Oberfläche von Mammakarzinomzellen (9). Bei % der Mammakarzinome wurde eine Amplifikation des HER2-Gens und/oder eine Überexpression seines Proteins nachgewiesen. Diese Up-Regulation geht einher mit schlechter Prognose, erhöhtem Rezidivrisiko und verkürzter Überlebenszeit. In mehreren Studien wurde aufgezeigt, dass der HER2-Status einen korrelativen Zusammenhang mit der Empfindlichkeit für oder der Resistenz gegen bestimmte Chemotherapieschemata aufweist (10). Der Nachweis einer hohen Überexpression des HER2-Proteins oder der HER2-Genamplifikation ist für die Einleitung der Behandlung mit Herceptin einem monoklonalen Antikörper gegen das HER2-Protein unerlässlich. Klinische Studien haben den Nachweis erbracht, dass Patientinnen, deren Tumore eine starke Überexpression des HER2-Proteins und/oder Amplifikation des HER2- Gens zeigen, am meisten von der Behandlung mit Herceptin profitieren (11). Prinzip des Testverfahrens - Brustkrebs Im HER2 FISH pharmdx Kit sind alle Reagenzien enthalten, die zur Durchführung eines FISH-Verfahrens an formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitten benötigt werden. Nach Entparaffinieren und Rehydrierung werden Proben 10 Minuten lang in Pre-Treatment Solution erwärmt. Der nächste Schritt dient der proteolytischen Andauung mit gebrauchsfertigem Pepsin bei Raumtemperatur oder bei 37 C. Die optim ale Pepsin-Inkubationszeit hängt von der Fixierung des Gewebes ab und sollte vom Anwender bestimmt werden. 10 Minuten bei Raumtemperatur oder 3 Minuten bei 37 C dürfte für die Mehrzahl der Proben ausreichend sein. Nach den Schritten des Erwärmens und der proteolytischen Vorbehandlung nutzt dieses Kit einen gebrauchsfertigen FISH Probe Mix, basierend auf einer Kombination aus PNA- (Peptid- Nucleinsäure, peptide nucleic acid) (12) und DNA-Technologie. Dieser Probe Mix besteht aus einer Mischung von mit Texas Red markierten DNA-Sonden, die eine Region von 218 kb einschließlich des HER2-Gens auf Chromosom 17 abdecken und einer Mischung aus Fluorescein-markierten PNA-Sonden, die auf die Centromer-Region von Chromosom 17 (CEN-17) abzielen. Die spezifische Hybridisierung der beiden Targets resultiert in der Bildung eines deutlichen roten Fluoreszenzsignals an jedem HER2-Genlokus und eines distinkten grünen Fluoreszenzsignals an jedem der Centromere von Chromosom 17. Zum Herabsetzen der Hintergrundanfärbung enthält der Probe Mix auch nicht markierte PNA-Blockierungssonden. Nach dem Adstringens-Waschschritt werden die Proben mit DAPI-haltigem Fluorescence Mounting Medium auf Objektträgern aufgebracht und mit Deckglas versehen. Mit einem mit den angemessenen Filtern (siehe Anhang 3) versehenen Fluoreszenzmikroskop werden die Tumorzellen lokalisiert und es erfolgt eine Auszählung der roten (HER2) und grünen (CEN-17) Signale. Daraufhin wird das HER2/CEN-17-Verhältnis berechnet. Im untersuchten Gewebeschnitt vorliegende normale Zellen dienen als interne Positivkontrolle der Effizienz der Vorbehandlung und Hybridisierung. Weitere Einzelheiten finden sich im Abschnitt über die Interpretation der Anfärbung. Für das interaktive e-learning verwenden Sie bitte das HER2 FISH pharmdx e-learning- Programm, das Labortechnikern, Pathologen und Wissenschaftlern akkurat und schnell Kenntnisse vermittelt, wie sie mit dem HER2 FISH pharmdx Kit optimale Ergebnisse erzielen: ( ) K /EFG/ULH/ p. 99/148

100 Reagenzien - Brustkrebs Brustkrebs Mitgelieferte Materialien Die unten angeführten Kitmaterialien reichen für 20 Tests aus (Definition eines Tests: Targetbereich von 22 mm x 22 mm). Die Anzahl von Tests basiert auf der Verwendung von 5 8 Tropfen (250 µl pro Objektträger aus Flasche 2, 10 µl pro Objektträger aus Flasche 3 und 15 µl pro Objektträger aus Flasche 5). Die Kitmaterialien sind für 10 einzelne Färbedurchgänge ausreichend. Der HER2 FISH pharmdx Kit wird in Trockeneis verpackt ausgeliefert. Um sicherzustellen, dass Kit-Komponenten während des Transport keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurden, muss bei Entgegennahme des Kits immer noch Trockeneis vorhanden sein. Hinweis: Einige Kit-Komponenten können nicht tiefgefroren sein. Dies übt keinen nachteiligen Einfluss auf die Leistung des HER2 FISH pharmdx Kit aus. Flasche 1 Flasche 2 Flasche 3 Flasche 4 Flasche 5 Flasche 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert MES- (2-[N-Morpholin]ethansulfonsäure) Puffer. Pepsin 7,5 ml, gebrauchsfertig Pepsinlösung, ph 2,0, mit Stabilisierungsmittel und antimikrobiellem Wirkstoff. HER2/CEN-17 Probe Mix 0,2 ml, gebrauchsfertig Mischung aus Texas Red-markierten HER2-DNA-Sonden und Fluorescein-markierten CEN-17-PNA-Sonden in Hybridisierungspuffer mit 45 % Formamid, Stabilisierungsmittel und nicht markierten PNA-Blockierungssonden. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert SSC-Puffer (saline-sodium citrate; NaCl + Natriumzitrat) mit Detergenz. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, gebrauchsfertig Fluoreszenz-Eindeckmedium mit 100 µg/l DAPI (4,6-Diamidin-2-phenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20-fach konzentriert Tris/HCl-Puffer. Coverslip Sealant 1 Tube, gebrauchsfertig Lösung für das wieder entfernbare Versiegeln von Deckgläsern. ( ) K /EFG/ULH/ p. 100/148

101 Brustkrebs HINWEIS: Alle Reagenzien, einschließlich von Pre-Treatment Solution, Stringent Wash Buffer und Fluorescence Mounting Medium, wurden spezifisch für die Verwendung zusammen mit diesem Kit formuliert. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Laborreagenzien Destilliertes oder entionisiertes Wasser Ethanol, 96 % Xylol oder Xylol-Ersatz Laborausstattungen-/geräte Saugfähige Wischtücher Einstellbare Pipetten Kalibriertes Thermometer für die teilweise Immersion (Messbereich: C) Kalibriertes Oberflächenthermometer (Messbereich: C) Deckgläser (22 mm x 22 mm) Pinzette Abzugshaube Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450 oder S2451)* Objektträger, Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, oder mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (siehe Abschnitt zur Probenvorbereitung) Färbeschalen oder -bäder Kurzzeitwecker (auf Zeitabstände zwischen 2 15 Minuten ausgelegt) Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, eine Temperatur von 65 C bis 99 C aufrechtzuerhalten) Mikrowellenherd mit Temperatursensor, falls Vorbehandlung mit Mikrowellenherd erfolgt (siehe B3. Färbeprotokoll. Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B) * Heizblock oder Hybridisierungsofen für die Denaturierung (82 (±2) C) und Hybridisierung (45 (±2) C), zusam men mit einer feuchten Hybridisierungskammer können alternativ zum Dako Hybridizer verwendet werden. Mikroskopausstattungen und zubehör Filter für das Fluoreszenzemikroskop: DAPI- und FITC/Texas Red-Doppelfilter oder FITCund Texas Red-Monofilter weitere Einzelheiten siehe Anhang 3. Es wird ein Fluoreszenzemikroskop mit einer 100 Watt Quecksilberdampflampe empfohlen Mappe für Mikroskop-Objektträger (Halter aus Pappe für 20 Objektträger mit beweglicher Klappe o.ä.) Vorsichtsmaßnahmen - Brustkrebs 1. Zur In-vitro-Diagnostik. 2. Nur für Fachpersonal bestimmt. 3. Flasche 1, Pre-Treatment Solution (20x), enthält 1-<20 % 2-Morpholinethansulfonsäure; Flasche 2, Pepsin, enthält 5 10 % Propan-2-ol; Flasche 4, Stringent Wash Buffer (20x), enthält 1-<5 % Octoxinol und Flasche 6, Wash Buffer (20x), enthält 1-<20 % Trometamol. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen benötigen diese Substanzen keine Warnhinweise. Von fachlich qualifizierten Anwendern können Sicherheitsdatenblätter angefordert werden. 4. Flasche 2, Pepsin, enthält Pepsin A, das eine allergische Reaktion hervorrufen kann. 5. Flasche 3, HER2/CEN-17 Probe Mix, enthält 45 % Formamid und ist wie folgt gekennzeichnet: Giftig. R61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen. S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). S53 Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. S60 Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 101/148

102 Brustkrebs In der Regel ist es Personen unter 18 Jahren nicht gestattet, mit diesem Produkt zu arbeiten. Benutzer müssen sorgfältig in die richtigen Arbeitsverfahren eingewiesen und über die gefährdenden Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsvorschriften informiert werden. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. 6. Coverslip Sealant enthält %, durch Hydrotreating leicht eingestelltes Naphtha (Benzin) und ist wie folgt gekennzeichnet: Hoch entzündlich. Umweltgefährlich. R11 Leicht entzündlich. R51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. S9 Behälter an einem gut belüfteten Ort aufbewahren. S16 Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen. S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden. S57 Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt geeigneten Behälter verwenden. S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/ Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. 7. Proben müssen ebenso wie alle ihnen ausgesetzten Materialien vor und nach dem Fixieren in einer Weise behandelt werden, als seien sie zum Übertragen von Infektionen befähigt. Außerdem muss die Entsorgung unter Beachtung der korrekten Vorsichtsmaßnahmen erfolgen (13). Reagenzien nie mit dem Mund pipettieren und Haut- bzw. Schleimhautkontakt mit Reagenzien und Proben vermeiden. Empfindliche Bereiche nach Kontakt mit den Reagenzien mit reichlich Wasser waschen. 8. Mikrobielle Kontamination von Reagenzien vermeiden, da dies falsche Ergebnisse hervorrufen könnte. 9. Von den angegebenen Spezifikationen abweichende Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden können zu fehlerhaften Resultaten führen. 10. Verfahren der Gewebefixierung und Schnittdicken, die von den gemachten Angaben abweichen, können die Gewebemorphologie und/oder die Signalintensität beeinträchtigen. 11. Während der Hybridisierung ein Verdunsten des HER2/CEN-17 Probe Mix vermeiden, indem für ausreichende Feuchtigkeit in der Hybridisierungskammer gesorgt wird. 12. Die Reagenzien wurden zur Verwendung mit dem Eridan Staining System optimal verdünnt. Eine weitergehende Verdünnung kann zu einem Leistungsverlust führen. 13. Um einen Kontakt mit Augen und Haut zu vermeiden, ist angemessene persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. Aufbewahrung - Brustkrebs Im Dunklen bei 2 8 C lagern. Alle Reagenzien könne n für die Lagerung tiefgekühlt werden. Tiefgefrieren und Auftauen der Reagenzien für jede Analyse führt nicht zu einer Leistungsbeeinträchtigung. Pepsin, HER2/CEN-17 Probe Mix und Fluorescence Mounting Medium (Flaschen 2, 3 und 5) können durch Aussetzung zu Hitze beeinträchtigt werden. Diese Kit-Komponenten dürfen nicht Raumtemperatur ausgesetzt werden. HER2/CEN-17 Probe Mix und Fluorescence Mounting Medium (Flaschen 3 und 5) können durch Aussetzung zu Hitze beeinträchtigt werden. Die Lagerung dieser Komponenten oder die Durchführung des Färbeverfahrens darf nicht unter intensiver Lichteinstrahlung, wie z. B. direktem Sonnenlicht, erfolgen. Der Kit darf nicht nach dem auf dem Außenkarton angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den in der Packungsbeilage beschriebenen aufbewahrt werden, so muss die Reagenzienleistung vom Anwender verifiziert werden (14). ( ) K /EFG/ULH/ p. 102/148

103 Brustkrebs Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Folglich ist es wichtig, dass die im untersuchten Gewebeschnitt vorliegenden normalen Zellen bewertet werden. Wenn ein unerwartetes Fluoreszenzmuster beobachtet wird, welches durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem HER2 FISH pharmdx Kit besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen. Probenvorbereitung - Brustkrebs Die Handhabung von Biopsie-, Exzisions- oder Resektionsproben muss dergestalt erfolgen, dass die Gewebe für die FISH-Analyse erhalten bleiben. Für alle Proben sollten Standardmethoden der Gewebeverarbeitung für das immunzytochemische Anfärben genutzt werden (15). Paraffineingebettete Schnitte Für die Verwendung sind nur in neutralem gepuffertem Formalin konservierte und paraffineingebettete Schnitte geeignet. Von Proben sollten beispielsweise Präparatblöcke mit einer Dicke von 3 oder 4 mm angefertigt werden, gefolgt von Stunden Fixierung in neutralem gepuffertem Formalin. Die Dehydrierung der Gewebeschnitte erfolgt dann in einer abgestuften Reihe von Ethanol und Xylol, gefolgt von der Infiltration mit geschmolzenem Paraffin, das auf einer Temperatur von nicht mehr als 60 C gehalten wird. Sachgemäß fixierte und eingebettete Gewebe sind vor dem Anfertigen der histologischen Schnitte und dem Aufziehen auf Objektträgern bei kühler Lagerung (15 25 C) unbegrenzt haltbar (15-1 6). Andere Fixative sind nicht geeignet. Von den Gewebeproben werden Schnitte von 4 6 µm angefertigt. Die für die Analyse der HER2-Genamplifikation wie auch für die Verifikation des Vorliegens des Tumors benötigten Objektträger werden zur gleichen Zeit vorbereitet. Es wird empfohlen, mindestens 2 Serienschnitte von Gewebeproben anzufertigen: 1 Schnitt wird zum Tumornachweis mit Hämatoxylin und Eosin (H&E-Anfärbung) angefärbt und 1 Schnitt dient für die Analyse der HER2-Genamplifikation. Es wird empfohlen, die histologischen Schnitte auf Dako Silanized Slides, Code S3003, oder auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern aufzuziehen. Proben sollten bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur (20 25 C) innerhal b von 4 6 Monaten nach Anfertigen der Schnitte analysiert werden. GEBRAUCHSANWEISUNG - Brustkrebs A. Vorbereitung der Reagenzien - Brustkrebs Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen: A.1 Pre-Treatment Solution In Flasche 1 kann Kristallbildung auftreten, Kristalle werden sich jedoch bei Raumtemperatur auflösen. Vor Ansetzen des Reagenzes muss sichergestellt werden, dass keine Kristalle vorliegen. Aus Flasche 1 (Pre-Treatment Solution 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Getrübte verdünnte Lösung entsorgen. A.2 Stringent Wash Buffer Aus Flasche 4 (Stringent Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.3 Wash Buffer Aus Flasche 6 (Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. ( ) K /EFG/ULH/ p. 103/148

104 Brustkrebs Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.4 Ethanol-Reihe Aus einer 96%igen Ethanol-Lösung drei Gefäße mit jeweils 70%igem, 85%igem und 96%igem Ethanol ansetzen. Abgedeckte Gefäße bei Raumtemperatur oder 2 8 C aufbewahren und für maximal 200 Objektträger verwenden. Angesetzte Lösungen mit getrübtem Aussehen müssen entsorgt werden. B. Färbeverfahren - Brustkrebs B.1 Verfahrenshinweise Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit allen Kit-Komponenten vertraut machen (siehe Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen ). Werden Kit-Komponenten tiefgekühlt gelagert, dann wird empfohlen, am Tag vor der Durchführen der Analyse die Reagenzien bei 2 8 C a ufzubewahren, damit eine korrekte Temperaturangleichung erzielt wird. Alle Reagenzien sind vor ihrer Verwendung wie folgt auf die jeweilige Temperatur zu bringen: Flasche 1: Die verdünnte Pre-Treatment Solution wird auf C erwärmt, falls die Vorbehandlung in einem Wasserbad erfolgt (B3. Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode A). Falls ein Mikrowellenherd mit Temperatursensor für die Vorbehandlung verwendet wird (B3. Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B), sollte die Pre-Treatment Solution auf Raumtemperatur C erwärmt werden. Flasche 2: Pepsin ist bei 2 8 C aufzubringen und muss ständig gekühlt gehalten werden. Flasche 3: HER2/CEN-17 Probe Mix kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden. Flasche 4: Verdünnter Stringent Wash Buffer ein Gefäß sollte vor Verwendung auf Raumtemperatur und ein Gefäß auf 65 C gebracht werden. Flasche 5: Fluorescence Mounting Medium kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden. Flasche 6: Der verdünnte Diluted Wash Buffer sollte auf Raumtemperatur C gebracht werden. Coverslip Sealant kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden Alle Schritte müssen bei den angegebenen Temperaturbereichen durchgeführt werden. Das Verfahren schließt eine Reihe von Entwässerungsschritten ein, an die sich das Trocknen der Gewebeschnitte anschließt. Das vollständige Trocknen der Gewebeschnitte muss sichergestellt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Während weiterer Schritte des Färbeverfahrens dürfen Gewebeschnitte nicht austrocknen. Muss das Färbeverfahren unterbrochen werden, können Objektträger nach dem Entwachsen bis zu 1 Stunden lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in Waschpuffer aufbewahrt werden, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der Färberesultate kommt. B.2 Behandlung der Gewebeproben vor dem Färben Entparaffinieren und Rehydrierung: Vor Durchführen der Analyse müssen Objektträger mit Gewebeschnitten zum Entfernen des Einbettmediums entwachst und rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettungsmediums können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei Raumtemperatur (20 25 C) durchführen. 1. Objektträger in ein Xylolbad einlegen und 5 (±1) Minuten lang inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 96%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 104/148

105 Brustkrebs 3. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 2 (±1) Minuten in 70 %iges Ethanol eintauchen. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 4. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 2 Minuten lang in verdünnten Waschpuffer geben (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.3). Das Färbeverfahren wie in Abschnitt B.3, Schritt 1, Vorbehandlung, erläutert beginnen. Xylol- und Alkohollösungen sind nach 200 Objektträgern oder weniger zu erneuern. Es kann Xylol-Ersatz verwendet werden. HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und bei den technischen Verfahren im Labor des Benutzers können die Ergebnisse des Assays hinfällig machen. B.3 Färbeprotokoll TAG 1 Schritt 1: Vorbehandlung Die Vorbehandlung kann entweder in einem Wasserbad erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ durch Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor, wie unter Methode B) beschrieben. Methode A) Vorbehandlung mit Wasserbad: Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Färbeschalen, mit verdünnter Pre-Treatment Solution befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.1). Pre-Treatment Solution enthaltende Färbeschalen in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Pre-Treatment Solution auf C erwärmen. Temperatur innerhalb der Schale mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur sicherzustellen. Schalen mit Deckeln versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die auf Raumtemperatur gebrachten entwachsten Schnitte in die vorgewärmte Pre-Treatment Solution in die Färbeschalen einlegen. Temperatur erneut messen und 10 (±1) Minuten lang bei C inkubieren. Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Deckel abnehmen und die Objektträger 15 Minuten lang in der Pre-Treatment Solution bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in eine Färbeschale mit verdünntem Wash Buffer transferieren (siehe GEBRAUCHSANLEITUNGEN, Abschnitt A.3). Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Methode B) Vorbehandlung durch Mikrowellenherd mit Temperatursensor: Ein Plastikgefäß mit verdünnter Pre-Treatment Solution füllen (Raumtemperatur, C). Die entparaffinierten Schnitte in Pre-Treatment Solution tauchen, das Gefäß mit einem punktierten Deckel abdecken und in den Mikrowellenherd stellen. Kochtemperatursensor auswählen und ein Programm, das nach Erreichen der Kochtemperatur 10 Minuten lang weiterläuft*. Nach der 10-minütigen Inkubation das Gefäß mit den Objektträgern aus dem Herd nehmen, den Deckel entfernen und 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Objektträger in ein Gefäß mit verdünntem Wash Buffer transferieren und 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. * Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor heißt, der Herd muss mit einem Sensor ausgestattet sein sowie mit einem Programm, das die Pre-Treatment Solution zunächst auf den Siedepunkt erhitzt, und danach die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 ºC) beibehält, bis die voreingestellte Restzeit (10 (±1) Minuten) abgelaufen ist. Einige Mikrowellenherdmodelle mit Temperatursensor bieten unter Umständen nicht die Möglichkeit, eine beliebige Restzeit einzustellen. Falls das Modell lediglich voreingestellte Programme bietet, ist darauf zu achten, ein Programm auszuwählen, das die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 ºC) mindestens 10 (±1) Minuten lang beibehält und das Programm nach 10 (±1) Minuten manuell zu stoppen. HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist ausschließlich für den Einmalgebrauch ausgelegt. Nicht wiederverwenden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 105/148

106 Schritt 2: Pepsin, gebrauchsfertig Die Pepsin-Inkubation kann entweder bei Raumtemperatur (20 25 C) erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ bei 37 C, wie unter Methode B) beschrieben. Brustkrebs Überschüssigen Puffer abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (wie z. B. einem saugfähigen Labortuch oder Gazetupfer) vorsichtig rund um die Probe alle verbleibende Flüssigkeit abwischen und dafür sorgen, dass Reagenzien innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs verbleiben. 5 8 Tropfen (250 µl) kaltes (2 8 C) Pepsin (Flasch e 2) zum Bedecken der Probe aufbringen. Pepsin immer bei 2 8 C lagern. Methode A) Inkubation bei Raumtemperatur 5 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren (20 25 C). Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 10 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in einer Färbeschale mit verdünntem Wash Buffer weichen lassen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNGEN, Abschnitt A.3). Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitt weitere 3 Minuten lang einweichen. Weiter mit Dehydrierung. Methode B) Inkubation bei 37 C; Probe mit Pepsin auf einen Heizblock bei 37 C stel len z.b. Dako Hybridizer und 3 Minuten inkubieren. Eine Inkubationsdauer von 3 Minuten sollte für die Mehrzahl der Proben ausreichend sein, die optimale Inkubationsdauer hängt jedoch von der Gewebefixierung ab und sollte vom Anwender festgelegt werden. Pepsin durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte in verdünntem Wash Buffer 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Dehydrierung. In einer abgestuften Reihe von Ethanol-Bädern die Gewebeschnitte dehydrieren: 2 Minuten in 70 %igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96 %igem Ethanol. Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Schritt 3: HER2/CEN-17 Probe Mix, gebrauchsfertig Der folgende Schritt sollte unter einer Abzugshaube durchgeführt werden. 10 µl HER2/CEN-17 Probe Mix (Flasche 3) auf der Mitte des Gewebeschnitts aufbringen. Sofort über dem Probe Mix ein Eindeckglas von 22 mm x 22 mm Größe auflegen und Probe Mix sich gleichmäßig unter dem Deckglas ausbreiten lassen. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Sollten Luftblasen festgestellt werden, werden sie mit der Pinzette vorsichtig aus dem Gewebe herausgeklopft. Deckglas mit Coverslip Sealant absiegeln, indem das Abdichtmittel rund um die Peripherie des Deckglases aufgetragen wird. Den Coverslip Sealant das Deckglas und den Objektträger so überlappen lassen, dass er eine Abdichtung rund um das Deckglas bildet. Der Coverslip Sealant muss die gesamte Kante des Deckglases abdecken. Dako Hybridizer* (Code-Nr. S2450 oder S2451) für einen Hybridisierungslauf vorbereiten. Humidity Control Strips (Code-Nr. S2452) müssen gesättigt und optimal für den Gebrauch sein. Hybridizer starten und ein Programm wählen, das bei 82 C 5 Minuten lang denaturiert, und über Nacht (14 20 Stunden) bei 45 C hybridisieren (weit ere Einzelheiten siehe Dako Hybridizer Gebrauchsanweisung). Objektträger in den Hybridizer legen, dabei muss der Deckel richtig geschlossen sein, und das Programm starten. * Für Denaturierung und Hybridisierung können Geräte eingesetzt werden, die Bedingungen bereitstellen, die den oben beschriebenen ähnlich sind: Objektträger auf eine ebene Metall- oder Keramikfläche (Heizblock oder Block eines Hybridisierungsofens) legen, die auf 82 (±2) C vor geheizt wurde. Fünf Minuten lang denaturieren lassen und gewährleisten, dass die Temperatur des Blocks zu keinem Zeitpunkt unter 80 C abfällt. ( ) K /EFG/ULH/ p. 106/148

107 Brustkrebs Objektträger in eine vorgeheizte befeuchtete Hybridisierungskammer legen. Kammer mit einer Abdeckung versehen und über Nacht (14 20 Stunden) bei 45 (±2) C inkubieren. Bitte beachten: Zusammen mit den in diesem Kit bereitgestellten Sonden ist eine Hybridisierungstemperatur von 37 C ungeeignet. TAG 2 Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash Zwei Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Färbeschalen, mit verdünntem Stringent Wash Buffer befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.2). Für jede Schale wird ein Mindestvolumen von 100 ml oder von 15 ml pro Objektträger empfohlen. Eine Färbeschale mit verdünntem Stringent Wash Buffer bei Raumtemperatur unter eine Abzugshaube und die andere Färbeschale in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und den verdünnten Stringent Wash Buffer auf 65 C erwärmen. Die Temperatur muss sich stabilisiert haben. Schale mit Deckel versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Temperatur innerhalb der Schale im Wasserbad mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Der Stringent Wash Buffer enthält ein Detergenz, das bei 65 C ein getrübtes Aussehen annehmen kann. Die Leistung wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Mit einer Pinzette oder mit den durch Handschuhe geschützten Händen die Objektträger aus der Hybridisierungskammer nehmen. Vorsichtig Coverslip Sealant ebenso wie das Deckglas entfernen und die Objektträger jeweils einen nach dem anderen in die Raumtemperatur aufweisende Schale für den Vorwaschschritt geben. Sobald alle Deckgläser entfernt wurden, werden die Objektträger aus der für den Vorwaschschritt genutzten, Raumtemperatur aufweisenden Schale in die im Wasserbad (65 C) befindliche Schale transferiert. Waschen mit Stringent Wash Buffer genau 10 Minuten lang bei 65 C durchführen. Objektträger aus dem verdünnten Stringent Wash Buffer herausheben und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wa sh Buffer einweichen. Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitte 3 weitere Minuten lang einweichen. In einer abgestuften Reihe von Ethanol-Bädern die Gewebeschnitte dehydrieren: 2 Minuten in 70 %igem Ethanol, 2 Minuten in 85 %igem Ethanol und 2 Minuten in 96 %igem Ethanol. Gewebeschnitte vollständig trocknen lassen. Schritt 5: Fixierung Auf dem Targetbereich des Objektträgers 15 µl Fluorescence Mounting Medium mit DAPI (Flasche 5) aufbringen und mit einem Deckglas eindecken. HINWEIS: Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger kann nach 15 Minuten oder innerhalb von 7 Tagen nach dem Präparateinschluss erfolgen. Es kommt allerdings zu Verblassen, falls die Objektträger Licht oder hohen Temperaturen ausgesetzt werden. Um ein Verblassen auf dem Minimum zu halten, sind die Objektträger bei 2 8 C im Dunkeln aufzubewahren. ( ) K /EFG/ULH/ p. 107/148

108 Brustkrebs Qualitätskontrolle - Brustkrebs 1. Signale müssen hell, distinkt und leicht zu bewerten sein. 2. Normale Zellen dienen als interne Positivkontrolle für den Färbungsdurchgang. Normale Zellen sollten 1 2 deutlich sichtbare grüne Signale geben und darauf hinweisen, dass die CEN-17 PNA-Sonde erfolgreiche Anlagerung an die Centromer-Region von Chromosom 17 erreicht hat. Normal Zellen sollten außerdem 1 2 deutlich sichtbare rote Signale erbringen und darauf hinweisen, dass erfolgreiche Anlagerung der HER2 DNA-Sonde an das HER2-Amplicon stattfand. Durch das Mikrotomieren bedingt werden einige normale Zellen weniger als die für jede Farbe erwarteten 2 Signale erbringen. Werden bei normalen Zellen keine Signale nachgewiesen, verweist dies auf Assay- Versagen und die Ergebnisse müssen als ungültig angesehen werden. 3. Bei der Bewertung mit einem DAPI-Filter muss die Nucleus-Morphologie intakt sein. Zahlreiche schemenhafte Schattenzellen und eine generell schlechte nukleäre Morphologie verweisen auf übermäßige Andauung der Probe, die in Signalverlust oder -fragmentierung resultiert. Solche Proben müssen als ungültig angesehen werden. 4. Unterschiede bei der Gewebefixierung und -einbettung im Labor des Anwenders können Variationen der Resultate hervorrufen und eine regelmäßige Evaluation der laborinternen Kontrollen erforderlich machen. Interpretation des Anfärbens - Brustkrebs Bewertbares Gewebe Eine Untersuchung ist nur bei Proben von Patientinnen mit invasivem Karzinom vorzunehmen. Sind in einer Probe sowohl Karzinome in situ als auch invasive Karzinome vorhanden, so ist nur die invasive Komponente zu bewerten. Nekrotische Bereiche sind ebenso wie Bereich zu vermeiden, bei denen die nukleären Säume mehrdeutig sind. Es dürfen keine Nuclei einbezogen werden, bei denen ein subjektives Urteil gefällt werden muss. Nuclei mit schwacher Signalintensität und nicht spezifischer Hintergrundanfärbung sind zu übergehen. Auszählung: Den Tumor innerhalb des Kontextes des mit dem H&E-Verfahren angefärbten Objektträgers lokalisieren und den gleichen Bereich auf dem mit dem FISH-Verfahren verarbeiteten Objektträger bewerten. Mehrere Tumorzellbereiche untersuchen, um mögliche Heterogenität zu berücksichtigen. Einen Bereich auswählen, der durch gute Verteilung der Nuclei gekennzeichnet ist. Mit der Analyse am linken oberen Quadranten des ausgewählten Bereichs beginnen. Die mikroskopische Untersuchung von links nach rechts vornehmen und die Anzahl der Signale innerhalb des nukleären Saums jedes bewerteten Nucleus nach den unten angeführten Leitlinien auszählen (siehe auch Anhang 3). - Auf- und abwärts fokussieren, um alle Signale im jeweiligen Nucleus ausfindig zu machen. - Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die dem Durchmesser des Signals entspricht oder weniger als diesen ausmacht. - Bei Nuclei mit hohen Niveaus der HER2-Genamplifikation können die HER2-Signale sehr nahe aneinander liegen und einen Signal-Cluster bilden. In diesen Fällen kann die Anzahl der HER2-Signale nicht ausgezählt werden und es muss eine Schätzung erfolgen. Besondere Aufmerksamkeit muss den grünen Signalen gewidmet werden, da Cluster von HER-Signalen die grünen Signale verdecken können, sodass sie nicht sichtbar sind. Im Zweifelsfall sind die grünen Signale mithilfe eines spezifischen FITC-Filters zu kontrollieren. Nuclei ohne Signale oder mit nur eine Farbe aufweisenden Signalen dürfen nicht in die Zählung einbezogen werden. Nur solche Nuclei bewerten, die ein oder mehrere FISH-Signale jeder Farbe zeigen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 108/148

109 Brustkrebs Leitfaden für die Signalzählung 1 Nicht in die Zählung aufnehmen. Nuclei überlappen einander, nicht alle Bereiche der Nuclei sichtbar. 2 Zwei grüne Signale; Nuclei mit nur einer Signalfarbe dürfen nicht in die Zählung einbezogen werden. 3 Als 3 grüne und 12 rote Signale zählen (Cluster-Schätzung). 4 Als ein grünes und 1 rotes Signal zählen. Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die dem Durchmesser des Signals entspricht oder weniger als diesen ausmacht. 5 Nicht in die Zählung aufnehmen (übermäßige oder oder zu geringe Andauung der Nuclei). Fehlende Signale in der Mitte der Nuclei (ringförmige Nuclei). 6 Als 2 grüne und 3 rote Signale zählen. Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die dem Durchmesser des Signals entspricht oder weniger als diesen ausmacht. 7 Als ein grünes und 5 rote Signale zählen. 8 Als 3 grüne (1 grünes Signal mit verschwommenem Fokus) und 3 rote Signale zählen. 9 Cluster roter Signale kaschieren grüne Signale. Grüne Signale mit einem spezifischen FITC-Filter überprüfen oder nicht in die Zählung aufnehmen. Zählungen wie in Anhang 2 verdeutlicht in einer Tabelle aufzeichnen. Pro Gewebeprobe werden 20 Nuclei ausgezählt, und zwar wo möglich von deutlich erkennbaren Tumorbereichen (17). Das HER2/CEN-17-Verhältnis wie folgt berechnen: Dividieren der Gesamtzahl roter HER2- Signale durch die Gesamtzahl grüner CEN-17-Signale. Für Proben mit einem HER2/CEN-17-Verhältnis über oder gleich 2 ist die Amplifikation des HER2-Gens anzunehmen (5, 17-19). Ergebnisse am oder nahe des Cut-off-Wertes (1,8 2,2) sind mit Vorsicht zu interpretieren. Liegt das Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8 2,2) sind 20 weitere Nuclei auszuzählen und das Verhältnis wird auf der Basis von 40 Nuclei erneut berechnet. Im Zweifelsfall ist eine erneute Bewertung des Objektträgers vorzunehmen. Bei Fällen im Borderline-Bereich sollte eine Konsultation zwischen dem Pathologen und dem behandelnden Arzt stattfinden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 109/148

110 Brustkrebs Beschränkungen - Brustkrebs 1. Als zahlreiche Schritte umfassender diagnostischer Prozess erfordert das FISH-Verfahren spezielle Schulung und Ausbildung in der Auswahl der angemessenen Reagenzien, in der Selektion, Fixierung und Verarbeitung von Geweben, der Vorbereitung des FISH-Objektträgers und in der Interpretation der Färberesultate. 2. Mit dem FISH-Verfahren erhaltene Resultate sind von der Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor dem Färbeschritt abhängig. Unsachgemäßes Fixieren, falsches Waschen, Trocknen, Erwärmen, Schneiden oder Kontamination mit anderen Geweben oder Flüssigkeiten können die Sondenhybridisierung beeinflussen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein. 3. Die auf Objektträger aufgezogenen Gewebe müssen für optimale und reproduzierbare Ergebnisse vollständig entwachst werden. Diese Paraffinentfernung muss zu Beginn des gesamten Färbeverfahrens abgeschlossen worden sein. (Siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt B.2.) 4. Es sind ausschließlich Wasserbäder, Heizblöcke und Hybridisierungsöfen mit geeichten Einrichtungen für die Temperaturregelung zu verwenden. Die Verwendung anderer Gerätetypen muss vom Anwender validiert werden, da es hierbei während der Hybridisierung zu Verdunsten des HER2/CEN-17 Probe Mix kommen kann. Leistungsmerkmale - Brustkrebs Hybridisierungseffizienz Die Effizienz der Hybridisierung des HER2 FISH pharmdx Kit wurde in einem Labor für routinemäßige pathologische Untersuchungen erhoben. Es wurden insgesamt 126 formalinfixierte paraffineingebettete Gewebeproben nach dem empfohlenen Verfahren getestet. Von den 126 Proben konnten 124 nach den Leitlinien für das Produkt bewertet werden, während eine Score-Vergabe bei 2 Proben aus technischen Gründen nicht möglich war. Folglich belief sich die Effizienz der Hybridisierung auf 124/126 = 98 % (20). Analytische Empfindlichkeit Die Empfindlichkeit des HER2/CEN-17 Probe Mix wurde anhand 1 Zelllinie mit und 2 Zelllinien ohne Amplifizierung des HER2-Gens untersucht. Auf der Grundlage des Auszählens von 60 Nuclei pro Zelllinie wurde das Verhältnis zwischen der Anzahl von HER2-Signalen und CEN-17-Signalen berechnet. Die amplifizierte Zelllinie wurde als mit einem durchschnittlichen Verhältnis von 3,21 amplifiziert bewertet, während die nicht amplifizierten Zelllinien mit Durchschnittsverhältnissen von 0,96 und 1,17 bewertet wurden. Außerdem wurden mit dem HER2 FISH pharmdx Kit die HER2/CEN-17-Verhältnisse von 5 Gewebeschnitten erhoben, für die keine Amplifikation des HER2-Gens durchgeführt worden war. Die Bewertung jedes Gewebeschnitts wurde von 3 verschiedenen Laboranten unabhängig voneinander durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1. HER2/CEN-17-Verhältnis bei 5 nicht amplifizierten Gewebeproben laut unabhängiger Bewertung durch 3 Laboranten Gewebe 1 Gewebe 2 Gewebe 3 Gewebe 4 Gewebe 5 Laborant 1 0,95 1,01 1,04 1,21 1,15 Laborant 2 1,05 1,00 0,99 1,11 1,09 Laborant 3 1,05 1,00 0,92 1,14 1,06 Mittleres Verhältnis 1,02 1,00 0,98 1,15 1,10 CV % CV: Variationskoeffizient Die Studie bestätigte den nicht amplifizierten Status aller 5 Gewebeproben mit einem mittleren HER2/CEN-17-Verhältnis nahe 1,0. ( ) K /EFG/ULH/ p. 110/148

111 Brustkrebs Analytische Spezifizität Zur Bestätigung einer Gesamtabdeckung von 218 kb einschließlich des HER2-Gens wurden die HER2-DNA-Sonden im HER2/CEN-17 Probe Mix der Endsequenzierung und Kartierung unterzogen. Die CEN-17-PNA-Sonden im HER2/CEN-17 Probe Mix wurden einzeln und in Kombination miteinander getestet, um ihre spezifische Hybridisierung der Centromer-Region von Chromosom 17 zu bestätigen. Um eine Kreuz-Anlagerung an andere Chromosome als an Chromosom 17 auszuschließen, wurden nach Maßgabe der von Dako genutzten Verfahren der Qualitätskontrolle Studien an Metaphasen-Spreads durchgeführt. Insgesamt 250 Metaphasen-Ausdehnungen wurden auf die spezifische Hybridisierung der HER2-DNA und CEN-17 PNA Probe Mixes bewertet. In allen 250 Fällen erwies sich die Anlagerung als für Chromosom 17 spezifisch. In keinem der 250 Fälle wurde eine Kreuz-Anlagerung an Loci anderer Chromosome beobachtet. Studien zur Robustheit Testung der Robustheit des HER2 FISH pharmdx Assays erfolgte anhand von unterschiedlichen Vorbehandlungszeiten und -temperaturen, Pepsin-Inkubationszeiten, Denaturierungstemperaturen, Hybridisierungszeiten und -temperaturen sowie Zeiten und Temperaturen des Waschschritts mit adstringierendem Puffer. Unter den folgenden Experimentalbedingungen wurde keine signifikante Differenz bei den Resultaten erhalten: Vorbehandlungszeiten von 7, 10 und 13 Minuten in Kombination mit Vorbehandlungstemperaturen von 89, 92 und C. Pepsin-Inkubationszeiten von 2, 5, 10, 15 und 18 Minuten. Denaturierungstemperaturen von 72, 77, 82, 87 und 92 C. Hybridisierungszeit von 17 Stunden in Kombination mit einer Temperatur von jeweils 40, 45 und 50 C. Hybridisierungszeiten von 10, 12 und 14 Stunden bei einer Temperatur von 45 C. Der Waschschritt mit Stringent Wash Buffer wurde 10 Minuten lang bei 60, 65 und 70 C getestet. Zusätzlich wurde hierfür eine Prüfung über 5, 10 und 15 Minuten bei 65 C durchgeführt. Ein Waschschritt von 10 Minuten Dauer bei 70 C und von 15 Minuten bei 65 C resultierte in Signalverlust, wohingegen bei den anderen Zeit-/Temperatur-Kombinationen keine signifikanten Differenzen der Ergebnisse beobachtet wurden. Wiederholbarkeit Mit dem HER2 FISH pharmdx Kit wurde die Wiederholbarkeit des HER2/CEN-17- Verhältnisses an konsekutiven histologischen Schnitten von befundlosem Mammagewebe und von Mammakarzinomgewebe untersucht. Der Variationskoeffizient betrug für normales Mammagewebe 6 % und 4 % für Mammakarzinome. Insgesamt 10 konsekutive Schnitte von Mammakarzinomgewebe unterschiedlicher Dicke (Duplikate mit 3, 4, 5, 6 und 7 µm) wurden mit dem HER2 FISH pharmdx Kit getestet. In dieser Studie betrug der Variationskoeffizient des HER2/CEN-17-Verhältnisses 12 %, d. h. der Koeffizient lag höher als bei Gewebeschnitten gleicher Dicke. Reproduzierbarkeit An 3 unterschiedlichen, formalinfixierten und paraffineingebetteten Zelllinien (nicht amplifizierte Zelllinien MDA-231 und MDA-175 und die mit dem HER2-Gen amplifizierte Zelllinie SKBR3) wurde der HER2 FISH pharmdx Kit auf folgende Reproduzierbarkeiten untersucht: Charge-zu- Charge, Tag-zu-Tag und Untersucher-zu-Untersucher. Die größte Variation (8 %) des HER2/CEN-17-Verhältnisses wurde in der Studie zur Reproduzierbarkeit von Untersucher zu Untersucher bei der amplifizierten Zelllinie ermittelt. Dies kann potenziell erwartet werden und spiegelt möglicherweise ein gewisse Subjektivität hinsichtlich der Signalinterpretation und - auszählung wider. Tabellen 2 4 enthalten die Studienergebnisse, ausgedrückt als Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient. ( ) K /EFG/ULH/ p. 111/148

112 Brustkrebs Tabelle 2. Reproduzierbarkeit Charge-zu-Charge. Für 3 verschiedene Chargen des HER2 FISH pharmdx Kits erhobenes HER2/CEN-17-Verhältnis Zelllinie MDA-231 MDA-175 SKBR3 HER2/CEN-17- Kit- Kit- Kit- Gesamt Verhältnis Charge 1 Charge 2 Charge 3 Mittelwert 1,06 1,04 1,07 1,06 SD 0,04 0,04 0,05 0,04 CV % n Mittelwert 1,23 1,20 1,16 1,20 SD 0,02 0,05 0,07 0,06 CV % n Mittelwert 3,99 3,77 3,82 3,86 SD 0,18 0,19 0,29 0,23 CV % n SD: Standardabweichung CV: Variationskoeffizient n: Anzahl der Objektträger Tabelle 3. Reproduzierbarkeit Tag-zu-Tag. An 4 verschiedenen Arbeitstagen bestimmtes HER2/CEN-17-Verhältnis Zelllinie HER2/CEN-17-Verhältnis Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Gesamt MDA-231 Mittelwert 1,04 1,03 1,05 0,99 1,03 SD 0,05 0,02 0,03 0,01 0,04 CV % n MDA-175 Mittelwert 1,26 1,17 1,25 1,16 1,21 SD 0,06 0,04 0,07 0,04 0,07 CV % n SKBR3 Mittelwert 4,30 4,59 4,56 4,09 4,39 SD 0,39 0,32 0,15 0,08 0,32 CV % n SD: Standardabweichung CV: Variationskoeffizient n: Anzahl der Objektträger Tabelle 4. Reproduzierbarkeit Untersucher-zu-Untersucher. Von 3 verschiedenen Untersuchern bestimmtes HER2/CEN-17-Verhältnis Zelllinie HER2/CEN-17-Verhältnis Unters. 1 Unters. 2 Unters. 3 Gesamt MDA-231 Mittelwert 1,03 1,03 1,09 1,05 SD 0,02 0,08 0,05 0,06 CV % n MDA-175 Mittelwert 1,17 1,15 1,11 1,14 SD 0,02 0,05 0,11 0,07 CV % n SKBR3 Mittelwert 4,03 3,57 3,63 3,74 SD 0,18 0,19 0,24 0,29 CV% n SD: Standardabweichung CV: Variationskoeffizient n: Anzahl der Objektträger ( ) K /EFG/ULH/ p. 112/148

113 Brustkrebs Portabilität des Assays Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien (Portabilität) wurde an 45 verschiedenen Studienorten eine verblindete randomisierte Vergleichsstudie der HER2/CEN-17-Verhältnisse durchgeführt, die an 4 formalinfixierten paraffineingebetteten Mammakarzinomproben erhoben wurden. Die 4 in die Studie aufgenommenen Proben repräsentierten unterschiedliche Level der HER2-Genamplifikation und wurden dahin gehend ausgewählt, ein natürliches Spektrum der Amplifikationsraten widerzuspiegeln. Einbezogene Proben: 1 nicht amplifizierte (gemessenes Verhältnis: 0,9 1,2), eine veränderte aber nicht amplifizierte (gemessenes Verhältnis: 1,4 1,7), eine bei niedrigem Level amplifizierte (gemessenes Verhältnis: 3,0 4,0) und eine bei hohem Level amplifizierte Probe (gemessenes Verhältnis: In drei gesonderten Durchläufen wurden an jedem Prüfzentrum die Proben angefärbt und interpretiert (insgesamt 12 Objektträger). Bei jedem Durchlauf wurden eine bereitgestellte Kontrolle mitgeführt. Beim Stratifizieren der Resultate als entweder für die HER2-Genamplifikation positiv oder negativ (Cut-off-Verhältnis = 2,0) fand sich vollständige Übereinstimmung zwischen den 5 Studienlabors, siehe Tabelle 5. Tabelle 5. Zusammenfassung der Ergebnisse zur Portabilität Probe HER2 negativ HER2 positiv Nicht amplifiziert 15 0 Verändert aber nicht amplifiziert 15 0 Bei niedrigem Level amplifiziert 0 15 Bei hohem Level amplifiziert 0 15 Für das HER2/CEN-17-Verhältnis wurde in den 5 Labors eine Tag-zu-Tag-Variation von 10 % erhoben. Für die Fälle ohne Amplifizierung und die Fälle mit nahe am Cut-off liegenden Werten wurde für das HER2/CEN-17-Verhältnis eine Variation von Studienort zu Studienort von circa % beobachtet. Dieser Wert ist mit den in der Literatur mitgeteilten Befunden konsistent. Für die stärker amplifizierten Proben wurde eine ausgeprägtere Variation (25 %) ermittelt. Auch dies stimmt mit den Literaturmitteilungen überein und diese Variation wird nicht als klinisch relevant eingeschätzt (18). Bei Fällen mit ausgeprägter Amplifikation kann angesichts der Cluster-Bildung der Signale die Bewertung nicht auf der Auszählung basiert werden, sondern muss sich auf eine Schätzung der Anzahl der Signale stützen. Folglich kann für diese Fälle ein hoher Variationswert erwartet werden. Klinische Nützlichkeit Der klinische Nutzen des Dako HER2 FISH pharmdx Kit wurde in einer Vergleichsstudie mit dem Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit untersucht. In die Studie wurden 150 archivierte Proben einbezogen, die von Patientinnen mit lymphknotenpositivem und lymphknotennegativem Mammakarzinom, Grad II-III gewonnen worden waren. Die Zielsetzung der Studie bestand in der Erhebung des Ausprägungsgrades der Konkordanz zwischen den Verhältnisses HER2/Chromosom 17:Centromer für die 150 Proben gemäß Testung mit den Dako und Vysis Assaykits, wobei sowohl die generelle Übereinstimmung der Verhältnisse als auch die Übereinstimmung der dichotomisierten FISH-Ergebnisse berücksichtigt wurden (positive/negative Gruppen). Für insgesamt 145 Proben erfolgte eine erfolgreiche Hybridisierung und erfolgreiches Scoring, sodass sie in die statistische Analyse einbezogen werden konnten. Eine 2 x 2 Kreuztabulierung der Ergebnisse wird in Tabelle 6 vorgelegt. ( ) K /EFG/ULH/ p. 113/148

114 Brustkrebs Tabelle 6. Dichotomisierte Ergebnisse von 145 Mammakarzinomproben Testung mit dem Dako HER2 FISH pharmdx Kit und dem Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Mit jedem der beiden Kits wurden 60 Nuclei jeder Probe bewertet. Streuungsdiagramm der paarweise angeordneten Untersuchungsergebnisse Vysis Kit ( ) amplifiziert Vysis Kit (+) amplifiziert Dako Kit ( ) amplifiziert Dako Kit (+) amplifiziert Summe Summe Die Konkordanz zwischen den Dako und Vysis Tests betrug 95 % bei einem Konfidenzintervall von %. Der Kappa-Wert betrug 0,89. Der McNemars-Test für den systematischen Bias zwischen beiden Tests war nicht signifikant (p=0,22). Abbildung 1 zeigt ein Streuungsdiagramm der paarweise angeordneten Untersuchungsergebnisse für die 145 Proben. Abbildung 1. Insgesamt 145 Mammakarzinomproben, untersucht auf HER2-Genamplifikation unter Verwendung des Dako HER2 FISH pharmdx Kit und des Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Ergebnisse ausgedrückt als HER2/Chromosom 17: Centromer-Verhältnisse. Mit jedem der beiden Kits wurden 60 Nuclei jeder Probe bewertet. Streuungsdiagramm der paarweise angeordneten Scatter plot Untersuchungsergebnisse of paired observations 12,00 DakoCytomation HER2 FISH HER2 pharmdx FISH pharmdx Kit Kit g 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit ( ) K /EFG/ULH/ p. 114/148

115 Brustkrebs Die generelle Übereinstimmung zwischen den Dako HER2 FISH pharmdx und Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe-Tests wurde anhand einer Analyse der Differenzen zwischen paarweise angeordneten Untersuchungen des logarithmischen Verhältnisses und einer linearen Regressionsanalyse des logarithmischen Verhältnisses der beiden Tests untersucht. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die Differenz zwischen paarweise angeordneten Beobachtungen des logarithmischen Verhältnisses systematisch um die Summe der HER2/Chromosom 17: Centromer-Verhältnisse zunimmt und dass für die höheren Verhältniswerte das gemessene Verhältnis mit dem Dako-Test höher liegt als mit dem Vysis-Test. Das höhere HER2/Chromosom 17: Centromer-Verhältnis, das mit dem Dako HER2 FISH pharmdx Kit beobachtet wurde, kann mit einer echten Differenz zwischen den beiden Tests in Zusammenhang gebracht werden, z. B. dass eine vom Dako HER2 FISH pharmdx Kit erbrachte höhere Auflösung bei Fällen mit starker HER2-Genamplifikation in höheren Verhältnissen resultiert. Die Kit-Testung wurde jedoch an zwei unterschiedlichen Studienorten durchgeführt, sodass Abweichungen zwischen Labors erwartet werden. Hinzu kommt, dass in der Literatur bei Fällen mit starker Amplifikation eine höhere Variation mitgeteilt wird, die allerdings nicht als klinisch relevant eingeschätzt wird (18). Die vorgelegte Studie gestattet keine über mehrere Laboratorien hinweg reichende Untersuchung einer systematischen Differenz zwischen den beiden Tests. Es sollte hinzugefügt werden, dass die beobachtete Abweichung zwischen den beiden Tests einen ähnlichen Umfang aufweist wie die in der Studie zur Portabilität festgestellte Variation zwischen Studienorten. Das HER2 FISH-Verfahren ist relativ zeitaufwendig, was primär auf die konventionelle Auszählung der Signale bei einer erheblichen Anzahl von Tumorzellen in jeder Probe zurückzuführen ist. Eine Teilmengenanalyse der in der Vergleichsstudie zum Dako HER2 pharmdx Kit und Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit erhaltenen Daten unterstützt allerdings die Nutzung vereinfachter Auszählungsmethoden. In Tabelle 7 werden die Testergebnisse zusammengefasst, die bei der Analyse von 145 Mammakarzinomproben mit dem Dako HER2 pharmdx Kit erhalten wurden und bei der an einem Minimum von 6 Zellen jeder Probe bis zu 10, 20, 30 und 60 Ereignisse (Signale) ausgezählt wurden. Zudem verdeutlicht Tabelle 7 die Resultate der statistischen Analysen dieser Methoden der Auszählung festgelegter Ereignisse im Vergleich mit dem Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe-Test und dem Auszählen der Signale von 60 Zellen. Es sollte beachtet werden, dass mit dem Auszählen einer festgelegten Anzahl von Ereignissen impliziert wird, dass eine relativ höhere Anzahl von Nuclei bei Proben gezählt wird, deren HER2/Chromosom 17 : Centromer-Verhältnisse rund um den Cut-off-Wert liegen, als dies bei Proben gegeben ist, bei denen starke HER2-Genamplifikation erfolgte und die somit ohne Mehrdeutigkeiten positiv sind. ( ) K /EFG/ULH/ p. 115/148

116 Brustkrebs Tabelle 7. Konkordanz- und Kappa-Werte bei Auszählen einer festgelegten Anzahl von Ereignissen (Signalen). Vergleich zwischen dem Auszählen von 10, 20, 30 und 60 Ereignissen beim Dako HER2 FISH pharmdx Test und dem Auszählen der Signale von 60 Nuclei beim Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Test. Sämtliche der 145 Mammakarzinomproben wurden mit allen 5 Methoden auf die HER2-Genamplifikation gestestet. Dako Kit ( ) amp. Auszählen von bis zu 10 Ereignissen Auszählen von bis zu 20 Ereignissen Auszählen von bis zu 30 Ereignissen Auszählen von bis zu 60 Ereignissen CI: Konfidenzintervall Vysis Kit ( ) amplifiziert (n=97) (+) amp. Vysis Kit (+ ) amplifiziert (n=48) ( ) amp. (+) amp. Konkordanz 95 % CI Kappa Wert McNemars- Test (p-wert) ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,96 0,92 0,99 0,91 0, ,97 0,93 0,99 0,92 0,19 n: Anzahl der Proben Für alle der 4 untersuchten Verfahren der Auszählung festgelegter Ereignisse blieben im Vergleich zur Auszählung der Signale bei 60 Nuclei die Konkordanz- und Kappa-Werte unverändert und ihre Konfidenzintervalle überlappten sich. Es wurde die Anzahl der ausgezählten Nuclei bei jedem Verfahren des Auszählens festgelegter Ereigniszahlen untersucht. Tabelle 8 gibt eine Zusammenfassung der Resultate. Tabelle 8. Anzahl der ausgezählten Nuclei bei den vier Verfahren des Auszählens festgelegter Ereigniszahlen. Auszählverfahren Auszählen von bis zu 10 Ereignissen Auszählen von bis zu 20 Ereignissen Auszählen von bis zu 30 Ereignissen Auszählen von bis zu 60 Ereignissen Mittelwert der der Anzahl der Nuclei Streubreite der Anzahl der Nuclei 90%-Fraktil der Anzahl der Nuclei Außerdem wurde die Möglichkeit untersucht, Signale von weniger als 60 Nuclei auszuzählen. Die Ergebnisse dieser Analyse finden sich in Tabelle 9. ( ) K /EFG/ULH/ p. 116/148

117 Brustkrebs Tabelle 9. Konkordanz- und Kappa-Werte bei Auszählen einer festgelegten Anzahl von Zellen. Vergleich zwischen dem Auszählen der Signale von 10, 20 und 30 Nuclei beim Dako HER2 FISH pharmdx Test und dem Auszählen der Signale von 60 Nuclei beim Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Test. Sämtliche der 145 Mammakarzinomproben wurden mit allen 4 Methoden auf die HER2-Genamplifikation getestet. Vysis Kit ( ) amplifiziert (n=97) Vysis Kit (+) amplifiziert (n=48) Konkordanz 95 % CI Kappa Wert McNemars- Test (p-wert) Dako Kit (-) amp. (+) amp. (-) amp. (+) amp. Auszählen von 10 Nuclei Auszählen von 20 Nuclei Auszählen von 30 Nuclei CI: Konfidenzintervall ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0,34 n: Anzahl der Proben Für alle der 3 untersuchten Verfahren der Auszählung von 10, 20 und 30 Nuclei blieben im Vergleich zur Auszählung der Signale von 60 Nuclei die Konkordanz- und Kappa-Werte, d. h. mit überlappendem CI, unverändert. Folglich unterstützt die statistische Analyse die Punktvergabe bei Proben auf der Grundlage des Auszählens der Signale von 10 Nuclei. ( ) K /EFG/ULH/ p. 117/148

118 Fehlersuche Brustkrebs Problem Wahrscheinliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Signale oder schwache Signale 2. Keine grünen Signale 3. Keine roten Signale 1a. Kit wurde während Transport oder Lagerung hohen Temperaturen ausgesetzt 1b. Funktionsstörung des Mikroskops - Unangemessener Filtersatz - Falsche Lampe - Quecksilber- damfpflampe zu alt - Verschmutzte und/oder gesprungene Sammellinsen - Ungeeignetes Immersionsöl 1c. Abgeschwächte Signale 1d. Falsche Vorbehandlungsbedingungen 1e. Verdunsten des Probe Mix während der Hybridisierung 2a. Falsche Bedingungen beim Waschschritt mit Stringent Wash 3a. Falsche Vorbehandlungsbedingungen Brustkrebs 1a. Lagerungsbedingungen überprüfen. Bei Entgegennahme der Lieferung muss Trockeneis vorhanden gewesen sein. Flaschen 2, 3 und 5 müssen bei maximal 2 8 C und Flaschen 3 und 5 lichtgeschützt gelagert worden sein. 1b. Mikroskop überprüfen und gewährleisten, dass die genutzten Filter für die Kitfluorochrome geeignet sind und dass die Quecksilberdampflampe angemessen ist und ihre Nutzungszeit nicht überschritten wurde (siehe Anhang 3). Im Zweifelsfall mit Kontakt mit dem Mikroskop-Lieferanten aufnehmen. 1c. Lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und Aussetzung zu starkem Licht auf einem Minimum halten. 1d. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. 1e. In der Hybridisierungskammer muss ausreichend Feuchtigkeit vorhanden sein. 2a. Für den Waschschritt mit Stringent Wash muss die korrekte Temperatur und Zeit genutzt werden und vor diesem Waschschritt müssen die Deckgläser entfernt werden. 3a. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 118/148

119 4. Bereiche ohne Signal 5. Übermäßige Hintergrundanfärbung 6. Schlechte Gewebemorphologie 4a. Zu geringes Sondenvolumen 4b. Einschluss von Luftblasen während des Auftragens von Probe Mix oder beim Aufziehen 5a. Falsche Gewebefixierung 5b. Paraffin nicht vollständig entfernt 5c. Zu niedrige Temperatur der Stringent Wash-Lösung 5d. Verlängerte Aussetzung des hybridisierten Abschnitts zu starkem Licht 6a. Falsche Pepsin- Behandlung 6b. Falsche Vorbehandlungsbedingungen können zu unklarem oder getrübtem Aussehen führen 6c. Zu lange Pepsin- Behandlung oder sehr dünne Schnitte können zum Auftreten von Schattenoder bikonkaven Doughnut -Zellen führen Brustkrebs 4a. Das Sondenvolumen muss zum Abdecken des Bereichs unter dem Deckglas ausreichen. 4b. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Falls vorhanden, vorsichtig mit Pinzette wegklopfen. 5a. Es dürfen nur formalinfixierte paraffineingebettete Schnitte verarbeitet werden. 5b. Den Verfahren für Entwachsen und Rehydrieren in Abschnitt B.2 folgen. 5c. Die Temperatur der Stringent Wash-Lösung muss 65 (±2) C betragen. 5d. Lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und Aussetzung zu starkem Licht auf einem Minimum halten. 6a. Die empfohlenen Pepsin- Inkubationszeiten befolgen. Siehe Abschnitt B.3., Schritt 2. Pepsin muss bei der korrekten Temperatur gehandhabt werden. Siehe Abschnitt B.1 6b. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. 6c. Pepsin-Iinkubationszeit verkürzen. Siehe Abschnitt B.3., Schritt 2. Die Schnittstärke muss 4 6 µm betragen. HINWEIS: Sollte das Problem nicht auf eine oder mehrere der oben angeführten Ursachen zurückzuführen sein oder wenn das Problem durch die vorgeschlagene Abhilfemaßnahme nicht ausgeräumt werden kann, wird gebeten, den Technischen Kundendienst von zu verständigen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 119/148

120 Brustkrebs Anhang 1 - Brustkrebs HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Protokoll-Checkliste Datum (Tag 1) des Färbelaufs: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Charge: Proben-ID: Geräte-ID: Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des 1 x Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20): / Logbuch-ID des Färbelaufs: Fixierung des Gewebes in neutralem gepuffertem Formalin Ja Nein TAG 1 Schritt 1: Vorbehandlung Datum des Ansetzens / Verfallsdatum der Pre-Treatment Solution (Flasche 1, Verdünnung 1:20): Gemessene Temperatur der Pre-Treatment Solution (95 99 C), falls im Wasserbad erhitzt wird Vorbehandlung (10 Minuten) und Abkühlen (15 Minuten) Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Schritt 2: Pepsin Dauer der Behandlung mit Pepsin (Flasche 2) bei 37 C oder Dauer der Behandlung mit Pepsin (Flasche 2) bei Raumtemperatur Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Entwässern der Objektträger (3 x 2 Minuten) in abgestufter Reihe von Ethanol- Bädern und Lufttrocknung Schritt 3: HER2/CEN-17 Probe Mix Auftrag von Probe Mix (Flasche 3), Eindecken und Abdichten mit Coverslip Sealant / C Minuten Minuten Gemessene Denaturierungstemperatur (82 ± 2 C) C Denaturierung über einen Zeitraum von 5 Minuten Gemessene Hybridisierungstemperatur (45 ± 2 C) C Hybridisierung über Nacht (lichtgeschützt) TAG 2 Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des Stringent Wash Buffer (Flasche 4, Verdünnung 1:20) Gemessene Temperatur des Stringent Wash Buffer (65 C) C Waschen mit Stringent Wash Buffer (10 Minuten) nach Entfernen der Deckgläser Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Entwässern der Objektträger (3 x 2 Minuten) in abgestufter Reihe von Ethanol- Bädern und Lufttrocknung Schritt 5: Fixierung 15 µl Fluorescence Mounting Medium (Flasche 5) aufbringen und eindecken Anmerkungen: / Datum und Unterschrift Laborant/in: ( ) K /EFG/ULH/ p. 120/148

121 Brustkrebs Anhang 2 - Brustkrebs HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Bewertungsschema Logbuch-ID des Färbelaufs: Datum (Tag 1) des Färbelaufs: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Charge: Proben-ID: Nucleus Nr. HER2 Score (rot) Signale von 20 Nuclei auszählen CEN-17 Score (grün) Nucleus Nr Gesamt (1-10) Gesamt (11-20) HER2 Score (rot) CEN-17 Score (grün) Zum Ermitteln des HER2/CEN-17-Verhältnisses wird bei den gleichen 20 Nuclei die Anzahl der HER2-Signale und die Anzahl der CEN-17-Signale gezählt, woraufhin dann die Gesamtzahl der HER2-Signale durch die Gesamtzahl der CEN-17-Signale dividiert wird. Liegt das HER2/CEN-17- Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8 2,2), werden 20 weitere Nuclei ausgezählt und das Verhältnis erneut berechnet. Ergebnisse am oder nahe des Cut-off-Wertes (1,8 2,2) sind mit Vorsicht zu interpretieren (siehe Leitlinie für das Auszählen). Gesamtscore (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-Verhältnis Verhältnis < 2: HER2-Genamplifikation wurde nicht beobachtet Verhältnis 2: HER2-Genamplifikation wurde beobachtet Datum und Unterschrift Laborant/in: Datum und Unterschrift Pathologe/Pathologin: Leitlinien für die Punktvergabe: siehe Interpretation des Anfärbens. ( ) K /EFG/ULH/ p. 121/148

122 Brustkrebs Anhang 3 - Brustkrebs HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Spezifikationen des Fluoreszenzmikroskops Dako empfiehlt für die Verwendung zusammen mit dem HER2 FISH pharmdx Kit, K5331, die folgenden Ausstattungen: 1. Mikroskop - Ausführung Epifluoreszenz-Mikroskop. 2. Lampe Quecksilberdampflampe, 100 Watt (es sind Aufzeichnungen über die Einschaltzeit zu führen). 3. Objektive Für ein Screening des Gewebes: Frontoptik für trockene Betrachtung, 10x-Objektiv, oder Frontoptik für Ölimmersion, 16X-Objektiv. Für hochauflösende Vergrößerung und für die Punktbewertung der Signale werden nur Frontlinsen für Ölimmersion, z. B. 100X, empfohlen. 4. Filter Filter werden jeweils für spezifische Fluorochrome konzipiert und müssen entsprechend ausgewählt werden. Dako empfiehlt die Verwendung eines spezifischen DAPI-Filters in Kombination mit einem qualitativ hochwertigen Texas Red-/FITC-Doppelfilter. DAPI-Filter, z. B. Chroma -Filter Nr Texas Red-/FITC-Doppelfilter, z. B. Chroma -Filter Nr Texas Red- und FITC-Einzelfilter können für die Bestätigung genutzt werden. Fluorochrom Anregungswellenlänge Emissionswellenlänge FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter sind für jeden Mikroskoptyp spezifisch und für die Interpretation ist die Nutzung der jeweils angemessenen Filter unerlässlich. Ausführlichere Informationen können vom Hersteller des Mikroskops oder vom zuständigen Dako-Repräsentanten eingeholt werden. 5. Öl Nicht fluoreszierendes Öl. Vorsichtsmaßnahmen Eine Quecksilberdampflampe von 50 Watt wird nicht empfohlen. Rhodamin-Filter können nicht verwendet werden. Dreifachfilter werden nicht empfohlen. Ein nicht optimiertes Mikroskop kann Probleme beim Lesen der Fluoreszenzsignale verursachen. Große Bedeutung kommt der Tatsache zu, dass die Lichtquelle nicht ihren Nutzbarkeitszeitraum überschritten hat und korrekt ausgerichtet und fokussiert wurde. Hinsichtlich der Quecksilberdampflampe ist die Leistungsüberprüfung nach den Herstelleranleitungen durchzuführen. Vor einer Interpretation der Ergebnisse muss das Mikroskop gewartet und die korrekte Ausrichtung der Quecksilberdampflampe sichergestellt werden. Damit eine Abschwächung der Fluoreszenz vermieden wird ist sicherzustellen, dass die Probe so wenig Anregungslicht als möglich ausgesetzt wird. Vor dem ersten Durchführen der FISH-Technik wird empfohlen, das Einrichten des im Labor genutzten Mikroskops mit dem Hersteller zu diskutieren oder auf die Literatur Bezug zu nehmen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 122/148

123 Magenkarzinom Zusammenfassung und Erläuterung - Magenkarzinom Das humane HER2-Gen (auch ERBB2 oder NEU) ist auf Chromosom 17 lokalisiert und kodiert das HER2-Protein oder p185 HER2. Als eine Membranrezeptor-Tyrosinkinase zeigt das HER2-Protein Rezeptorhomologie mit dem Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR oder HER1) (1-2). Das HER2-Gen liegt in allen normalen diploiden Zellen in 2 Kopien vor. Bei einer großen Anzahl von Studien wurde eine Überexpression des HER2-Proteins und Amplifikation des HER2-Gens bei Magenkrebs nachgewiesen (geprüft in (21)). HER2-Positivität kann entweder durch das IHC- oder das FISH-Verfahren bei etwa 20 % der Patienten nachgewiesen werden (21). Vorklinische In-vitro- und In-vivo-Studien haben erwiesen, dass Trastuzumab (Herceptin ) bei verschiedenen Magenkrebsmodellen wirksam ist, was zur Einleitung mehrerer klinischer Studien geführt hat (21-25). In einer Phase-III-Studie BO18255, der ToGA-Studie, wurden HER2-positive Patienten mit inoperablem, lokal fortgeschrittenem, rezidivem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens oder ösophagogastralen Übergangs randomisiert, und ihnen wurde 5-FU oder Capecitabine und Cisplatin entweder allein oder in Verbindung mit Trastuzumab verabreicht. Bei den Patienten, die die kombinierte Behandlung aus Trastuzumab und Chemotherapie erhalten haben, wurde eine statistisch signifikante Erhöhung des Gesamt-Überlebens (OS) festgestellt (26). Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der sich mit hoher Affinität an das HER2-Protein bindet und die Proliferation von menschlichen, das HER2-Protein überexprimierenden Tumorzellen nachweislich in vitro und in vivo hemmt (22-25). Prinzip des Testverfahrens - Magenkarzinom Im HER2 FISH pharmdx Kit sind alle Reagenzien enthalten, die zur Durchführung eines FISH-Verfahrens an formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitten benötigt werden. Nach Entparaffinieren und Rehydrierung werden Proben 10 Minuten lang in Pre-Treatment Solution erwärmt. Der nächste Schritt dient der proteolytischen Andauung mit gebrauchsfertigem Pepsin bei Raumtemperatur oder bei 37 C. Die optim ale Pepsin-Inkubationszeit hängt von der Fixierung des Gewebes ab und sollte vom Anwender bestimmt werden. 10 Minuten bei Raumtemperatur oder 3 Minuten bei 37 C dürfte für die Mehrzahl der Proben ausreichend sein. Nach den Schritten des Erwärmens und der proteolytischen Vorbehandlung nutzt dieses Kit einen gebrauchsfertigen FISH Probe Mix, basierend auf einer Kombination aus PNA- (Peptid- Nucleinsäure, peptide nucleic acid) (12) und DNA-Technologie. Dieser Probe Mix besteht aus einer Mischung von mit Texas Red markierten DNA-Sonden, die eine Region von 218 kb einschließlich des HER2-Gens auf Chromosom 17 abdecken und einer Mischung aus Fluorescein-markierten PNA-Sonden, die auf die Centromer-Region von Chromosom 17 (CEN-17) abzielen. Die spezifische Hybridisierung der beiden Targets resultiert in der Bildung eines deutlichen roten Fluoreszenzsignals an jedem HER2-Genlokus und eines distinkten grünen Fluoreszenzsignals an jedem der Centromere von Chromosom 17. Zum Herabsetzen der Hintergrundanfärbung enthält der Probe Mix auch nicht markierte PNA-Blockierungssonden. Nach dem Adstringens-Waschschritt werden die Proben mit DAPI-haltigem Fluorescence Mounting Medium auf Objektträgern aufgebracht und mit Deckglas versehen. Mit einem mit den angemessenen Filtern (siehe Anhang 3) versehenen Fluoreszenzmikroskop werden die Tumorzellen lokalisiert und es erfolgt eine Auszählung der roten (HER2) und grünen (CEN-17) Signale. Daraufhin wird das HER2/CEN-17-Verhältnis berechnet. Im untersuchten Gewebeschnitt vorliegende normale Zellen dienen als interne Positivkontrolle der Effizienz der Vorbehandlung und Hybridisierung. Weitere Einzelheiten finden sich im Abschnitt über die Interpretation der Anfärbung. Für das interaktive e-learning verwenden Sie bitte das HER2 FISH pharmdx e-learning- Programm, das Labortechnikern, Pathologen und Wissenschaftlern akkurat und schnell Kenntnisse vermittelt, wie sie mit dem HER2 FISH pharmdx Kit optimale Ergebnisse erzielen: ( ) K /EFG/ULH/ p. 123/148

124 Reagenzien - Magenkarzinom Magenkarzinom Mitgelieferte Materialien Die unten angeführten Kitmaterialien reichen für 20 Tests aus (Definition eines Tests: Targetbereich von 22 mm x 22 mm). Die Anzahl von Tests basiert auf der Verwendung von 5 8 Tropfen (250 µl pro Objektträger aus Flasche 2, 10 µl pro Objektträger aus Flasche 3 und 15 µl pro Objektträger aus Flasche 5). Die Kitmaterialien sind für 10 einzelne Färbedurchgänge ausreichend. Der HER2 FISH pharmdx Kit wird in Trockeneis verpackt ausgeliefert. Um sicherzustellen, dass Kit-Komponenten während des Transport keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurden, muss bei Entgegennahme des Kits immer noch Trockeneis vorhanden sein. Hinweis: Einige Kit-Komponenten können nicht tiefgefroren sein. Dies übt keinen nachteiligen Einfluss auf die Leistung des HER2 FISH pharmdx Kit aus. Flasche 1 Flasche 2 Flasche 3 Flasche 4 Flasche 5 Flasche 6 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert MES- (2-[N-Morpholin]ethansulfonsäure) Puffer. Pepsin 7,5 ml, gebrauchsfertig Pepsinlösung, ph 2,0, mit Stabilisierungsmittel und antimikrobiellem Wirkstoff. HER2/CEN-17 Probe Mix 0,2 ml, gebrauchsfertig Mischung aus Texas Red-markierten HER2-DNA- Sonden und Fluorescein-markierten CEN-17-PNA- Sonden in Hybridisierungspuffer mit 45 % Formamid, Stabilisierungsmittel und nicht markierten PNA-Blockierungssonden. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert SSC-Puffer (saline-sodium citrate; NaCl + Natriumzitrat) mit Detergenz. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, gebrauchsfertig Fluoreszenz-Eindeckmedium mit 100 µg/l DAPI (4,6-Diamidin-2-phenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20-fach konzentriert Tris/HCl-Puffer. Coverslip Sealant 1 Tube, gebrauchsfertig Lösung für das wieder entfernbare Versiegeln von Deckgläsern. ( ) K /EFG/ULH/ p. 124/148

125 Magenkarzinom HINWEIS: Alle Reagenzien, einschließlich von Pre-Treatment Solution, Stringent Wash Buffer und Fluorescence Mounting Medium, wurden spezifisch für die Verwendung zusammen mit diesem Kit formuliert. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Laborreagenzien Destilliertes oder entionisiertes Wasser Ethanol, 96 % Xylol oder Xylol-Ersatz Laborausstattungen-/geräte Saugfähige Wischtücher Einstellbare Pipetten Kalibriertes Thermometer für die teilweise Immersion (Messbereich: C) Kalibriertes Oberflächenthermometer (Messbereich: C) Deckgläser (22 mm x 22 mm) Pinzette Abzugshaube Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450 oder S2451)* Objektträger, Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, oder mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (siehe Abschnitt zur Probenvorbereitung) Färbeschalen oder -bäder Kurzzeitwecker (auf Zeitabstände zwischen 2 15 Minuten ausgelegt) Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, eine Temperatur von 65 C bis 99 C aufrechtzuerhalten) Mikrowellenherd mit Temperatursensor, falls Vorbehandlung mit Mikrowellenherd erfolgt (siehe B3. Färbeprotokoll. Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B) * Heizblock oder Hybridisierungsofen für die Denaturierung (82 (±2) C) und Hybridisierung (45 (±2) C), zusam men mit einer feuchten Hybridisierungskammer können alternativ zum Dako Hybridizer verwendet werden. Mikroskopausstattungen und zubehör Filter für das Fluoreszenzemikroskop: DAPI- und FITC/Texas Red-Doppelfilter oder FITCund Texas Red-Monofilter weitere Einzelheiten siehe Anhang 3. Es wird ein Fluoreszenzemikroskop mit einer 100 Watt Quecksilberdampflampe empfohlen Mappe für Mikroskop-Objektträger (Halter aus Pappe für 20 Objektträger mit beweglicher Klappe o.ä.). Vorsichtsmaßnahmen - Magenkarzinom 1. Zur In-vitro-Diagnostik. 2. Nur für Fachpersonal bestimmt. 3. Flasche 1, Pre-Treatment Solution (20x), enthält 1-<20 % 2-Morpholinethansulfonsäure; Flasche 2, Pepsin, enthält 5 10 % Propan-2-ol; Flasche 4, Stringent Wash Buffer (20x), enthält 1-<5 % Octoxinol und Flasche 6, Wash Buffer (20x), enthält 1-<20 % Trometamol. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen benötigen diese Substanzen keine Warnhinweise. Von fachlich qualifizierten Anwendern können Sicherheitsdatenblätter angefordert werden. 4. Flasche 2, Pepsin, enthält Pepsin A, das eine allergische Reaktion hervorrufen kann. 5. Flasche 3, HER2/CEN-17 Probe Mix, enthält 45 % Formamid und ist wie folgt gekennzeichnet: Giftig. R61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen. S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). ( ) K /EFG/ULH/ p. 125/148

126 Magenkarzinom S53 Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. S60 Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. In der Regel ist es Personen unter 18 Jahren nicht gestattet, mit diesem Produkt zu arbeiten. Benutzer müssen sorgfältig in die richtigen Arbeitsverfahren eingewiesen und über die gefährdenden Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsvorschriften informiert werden. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. 6. Coverslip Sealant enthält %, durch Hydrotreating leicht eingestelltes Naphtha (Benzin) und ist wie folgt gekennzeichnet: Hoch entzündlich. Umweltgefährlich. R11 Leicht entzündlich. R51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. S9 Behälter an einem gut belüfteten Ort aufbewahren. S16 Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen. S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden. S57 Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt geeigneten Behälter verwenden. S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/ Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. 7. Proben müssen ebenso wie alle ihnen ausgesetzten Materialien vor und nach dem Fixieren in einer Weise behandelt werden, als seien sie zum Übertragen von Infektionen befähigt. Außerdem muss die Entsorgung unter Beachtung der korrekten Vorsichtsmaßnahmen erfolgen (16). Reagenzien nie mit dem Mund pipettieren und Haut- bzw. Schleimhautkontakt mit Reagenzien und Proben vermeiden. Empfindliche Bereiche nach Kontakt mit den Reagenzien mit reichlich Wasser waschen. 8. Mikrobielle Kontamination von Reagenzien vermeiden, da dies falsche Ergebnisse hervorrufen könnte. 9. Von den angegebenen Spezifikationen abweichende Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden können zu fehlerhaften Resultaten führen. 10. Verfahren der Gewebefixierung und Schnittdicken, die von den gemachten Angaben abweichen, können die Gewebemorphologie und/oder die Signalintensität beeinträchtigen. 11. Während der Hybridisierung ein Verdunsten des HER2/CEN-17 Probe Mix vermeiden, indem für ausreichende Feuchtigkeit in der Hybridisierungskammer gesorgt wird. 12. Die Reagenzien wurden zur Verwendung mit dem Eridan Staining System optimal verdünnt. Eine weitergehende Verdünnung kann zu einem Leistungsverlust führen. 13. Um einen Kontakt mit Augen und Haut zu vermeiden, ist angemessene persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen. 14. Aufgrund der Heterogenität von Magenkrebsproben muss unbedingt die gesamte Probe gründlich untersucht werden, um die Signalverteilung zu bewerten, bevor der Bereich für die Auszählung festgelegt wird. 15. Die Bewertung sehr kleiner Proben wird nicht empfohlen (d.h. die Proben müssen eine intakte Morphologie und genügend Nuclei zur Auszählung aufweisen). 16. Um eine zuverlässige Bestimmung des HER2-Status zu erhalten, wenn die Analyse einer Biopsieprobe mit dem HER2 FISH-Verfahren durchgeführt wird, ist es erforderlich, mehrere (7 8) Biopsien aus verschiedenen Regionen des Tumors zu analysieren. 17. Zur Identifizierung aller Gewebekerne in einer Biopsieprobe ist es wichtig, den mit dem H&E- Verfahren angefärbten Objektträger zu untersuchen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 126/148

127 Magenkarzinom Aufbewahrung - Magenkarzinom Im Dunklen bei 2 8 C lagern. Alle Reagenzien könne n für die Lagerung tiefgekühlt werden. Tiefgefrieren und Auftauen der Reagenzien für jede Analyse führt nicht zu einer Leistungsbeeinträchtigung. Pepsin, HER2/CEN-17 Probe Mix und Fluorescence Mounting Medium (Flaschen 2, 3 und 5) können durch Aussetzung zu Hitze beeinträchtigt werden. Diese Kit-Komponenten dürfen nicht Raumtemperatur ausgesetzt werden. HER2/CEN-17 Probe Mix und Fluorescence Mounting Medium (Flaschen 3 und 5) können durch Aussetzung zu Hitze beeinträchtigt werden. Die Lagerung dieser Komponenten oder die Durchführung des Färbeverfahrens darf nicht unter intensiver Lichteinstrahlung, wie z. B. direktem Sonnenlicht, erfolgen. Der Kit darf nicht nach dem auf dem Außenkarton angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den in der Packungsbeilage beschriebenen aufbewahrt werden, so muss die Reagenzienleistung vom Anwender verifiziert werden (13). Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Folglich ist es wichtig, dass die im untersuchten Gewebeschnitt vorliegenden normalen Zellen bewertet werden. Wenn ein unerwartetes Fluoreszenzmuster beobachtet wird, welches durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem HER2 FISH pharmdx Kit besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen. Probenvorbereitung - Magenkarzinom Proben von Magen-Adenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs aus Biopsien, Exzisionen oder Resektionen müssen so gehandhabt werden, dass die Gewebe für die FISH-Analyse erhalten bleiben. Für alle Proben sollten Standardmethoden der Gewebeverarbeitung für das immunzytochemische Anfärben genutzt werden (14). Gewährleisten Sie bei der Untersuchung von Biopsieproben mit sehr wenig Gewebe eine intakte Tumormorphologie und das Vorliegen einer ausreichenden Anzahl an Nuclei für die Auszählung. Um eine zuverlässige Bestimmung des HER2-Status zu erhalten, wenn die Analyse einer Biopsieprobe mit dem HER2 FISH-Verfahren durchgeführt wird, ist es erforderlich, mehrere (7 8) Biopsien aus verschiedenen Regionen des Tumors zu analysieren. Paraffineingebettete Schnitte Für die Verwendung sind nur in neutralem gepuffertem Formalin konservierte und paraffineingebettete Schnitte geeignet. Die Proben sollten z.b. auf eine Dicke von 3 oder 4 mm geschnitten und in neutral gepuffertem Formalin Stunden lang fixiert werden. Biopsieproben wurden in der ToGA-Studie 6-8 Stunden lang fixiert. (Literaturverzeichnis zur Studie, siehe (26)). Die Dehydrierung der Gewebeschnitte erfolgt dann in einer abgestuften Reihe von Ethanol und Xylol, gefolgt von der Infiltration mit geschmolzenem Paraffin, das auf einer Temperatur von nicht mehr als 60 C gehalten wird. Sachgemäß fixierte und eingebettete Gewebe sind vor dem Anfertigen der histologischen Schnitte und dem Aufziehen auf Objektträgern bei kühler Lagerung (15 25 C) unbegr enzt haltbar (14, 15). Andere Fixative sind nicht geeignet. Von den Gewebeproben werden Schnitte von 3 6 µm angefertigt. Die für die Analyse der HER2-Genamplifikation wie auch für die Verifikation des Vorliegens des Tumors benötigten Objektträger werden zur gleichen Zeit vorbereitet. Es wird empfohlen, mindestens 2 Serienschnitte von Gewebeproben anzufertigen: 1 Schnitt wird zum Tumornachweis mit Hämatoxylin und Eosin (H&E-Anfärbung) angefärbt und 1 Schnitt dient für die Analyse der HER2-Genamplifikation. Es wird empfohlen, die histologischen Schnitte auf Dako Silanized Slides, Code S3003, oder auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern aufzuziehen. Proben sollten bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur (20 25 C) innerhal b von 4 6 Monaten nach Anfertigen der Schnitte analysiert werden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 127/148

128 GEBRAUCHSANWEISUNG - Magenkarzinom Magenkarzinom A. Vorbereitung der Reagenzien - Magenkarzinom Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen: A.1 Pre-Treatment Solution In Flasche 1 kann Kristallbildung auftreten, Kristalle werden sich jedoch bei Raumtemperatur auflösen. Vor Ansetzen des Reagenzes muss sichergestellt werden, dass keine Kristalle vorliegen. Aus Flasche 1 (Pre-Treatment Solution 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Getrübte verdünnte Lösung entsorgen. A.2 Stringent Wash Buffer Aus Flasche 4 (Stringent Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.3 Wash Buffer Aus Flasche 6 (Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.4 Ethanol-Reihe Aus einer 96%igen Ethanol-Lösung drei Gefäße mit jeweils 70%igem, 85%igem und 96%igem Ethanol ansetzen. Abgedeckte Gefäße bei Raumtemperatur oder 2 8 C aufbewahren und für maximal 200 Objektträger verwenden. Angesetzte Lösungen mit getrübtem Aussehen müssen entsorgt werden. B. Färbeverfahren - Magenkarzinom B.1 Verfahrenshinweise Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit allen Kit-Komponenten vertraut machen (siehe Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen ). Werden Kit-Komponenten tiefgekühlt gelagert, dann wird empfohlen, am Tag vor der Durchführen der Analyse die Reagenzien bei 2 8 C a ufzubewahren, damit eine korrekte Temperaturangleichung erzielt wird. Alle Reagenzien sind vor ihrer Verwendung wie folgt auf die jeweilige Temperatur zu bringen: Flasche 1: Die verdünnte Pre-Treatment Solution wird auf C erwärmt, falls die Vorbehandlung in einem Wasserbad erfolgt (B3. Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode A). Falls ein Mikrowellenherd mit Temperatursensor für die Vorbehandlung verwendet wird (B3. Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B), sollte die Pre-Treatment Solution auf Raumtemperatur C erwärmt werden. Flasche 2: Pepsin ist bei 2 8 C aufzubringen und muss ständig gekühlt gehalten werden. Flasche 3: HER2/CEN-17 Probe Mix kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden. Flasche 4: Verdünnter Stringent Wash Buffer ein Gefäß sollte vor Verwendung auf Raumtemperatur und ein Gefäß auf 65 C gebracht werden. Flasche 5: Fluorescence Mounting Medium kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 128/148

129 Magenkarzinom Flasche 6: Der verdünnte Diluted Wash Buffer sollte auf Raumtemperatur C gebracht werden. Coverslip Sealant kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 2 25 C aufgebracht werden Alle Schritte müssen bei den angegebenen Temperaturbereichen durchgeführt werden. Das Verfahren schließt eine Reihe von Entwässerungsschritten ein, an die sich das Trocknen der Gewebeschnitte anschließt. Das vollständige Trocknen der Gewebeschnitte muss sichergestellt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Während weiterer Schritte des Färbeverfahrens dürfen Gewebeschnitte nicht austrocknen. Muss das Färbeverfahren unterbrochen werden, können Objektträger nach dem Entwachsen bis zu 1 Stunden lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in Waschpuffer aufbewahrt werden, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der Färberesultate kommt. B.2 Behandlung der Gewebeproben vor dem Färben Entparaffinieren und Rehydrierung: Vor Durchführen der Analyse müssen Objektträger mit Gewebeschnitten zum Entfernen des Einbettmediums entwachst und rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettungsmediums können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei Raumtemperatur (20 25 C) durchführen. 1. Objektträger in ein Xylolbad einlegen und 5 (±1) Minuten lang inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 96%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 3. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 2 (±1) Minuten in 70 %iges Ethanol eintauchen. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 4. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 2 Minuten lang in verdünnten Waschpuffer geben (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.3). Das Färbeverfahren wie in Abschnitt B.3, Schritt 1, Vorbehandlung, erläutert beginnen. Xylol- und Alkohollösungen sind nach 200 Objektträgern oder weniger zu erneuern. Es kann Xylol-Ersatz verwendet werden. HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und bei den technischen Verfahren im Labor des Benutzers können die Ergebnisse des Assays hinfällig machen. B.3 Färbeprotokoll TAG 1 Schritt 1: Vorbehandlung Die Vorbehandlung kann entweder in einem Wasserbad erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ durch Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor, wie unter Methode B) beschrieben. Methode A) Vorbehandlung mit Wasserbad: Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Färbeschalen, mit verdünnter Pre-Treatment Solution befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.1). Pre-Treatment Solution enthaltende Färbeschalen in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Pre-Treatment Solution auf C erwärmen. Temperatur innerhalb der Schale mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur sicherzustellen. Schalen mit Deckeln versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die auf Raumtemperatur gebrachten entwachsten Schnitte in die vorgewärmte Pre-Treatment Solution in die Färbeschalen einlegen. Temperatur erneut messen und 10 (±1) Minuten lang bei C inkubieren. ( ) K /EFG/ULH/ p. 129/148

130 Magenkarzinom Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Deckel abnehmen und die Objektträger 15 Minuten lang in der Pre-Treatment Solution bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in eine Färbeschale mit verdünntem Wash Buffer transferieren (siehe GEBRAUCHSANLEITUNGEN, Abschnitt A.3). Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Methode B) Vorbehandlung durch Mikrowellenherd mit Temperatursensor: Ein Plastikgefäß mit verdünnter Pre-Treatment Solution füllen (Raumtemperatur, C). Die entparaffinierten Schnitte in Pre-Treatment Solution tauchen, das Gefäß mit einem punktierten Deckel abdecken und in den Mikrowellenherd stellen. Kochtemperatursensor auswählen und ein Programm, das nach Erreichen der Kochtemperatur 10 Minuten lang weiterläuft*. Nach der 10-minütigen Inkubation das Gefäß mit den Objektträgern aus dem Herd nehmen, den Deckel entfernen und 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Objektträger in ein Gefäß mit verdünntem Wash Buffer transferieren und 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. * Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor heißt, der Herd muss mit einem Sensor ausgestattet sein sowie mit einem Programm, das die Pre-Treatment Solution zunächst auf den Siedepunkt erhitzt, und danach die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 ºC) beibehält, bis die voreingestellte Restzeit (10 (±1) Minuten) abgelaufen ist. Einige Mikrowellenherdmodelle mit Temperatursensor bieten unter Umständen nicht die Möglichkeit, eine beliebige Restzeit einzustellen. Falls das Modell lediglich voreingestellte Programme bietet, ist darauf zu achten, ein Programm auszuwählen, das die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 ºC) mindestens 10 (±1) Minuten lang beibehält und das Programm nach 10 (±1) Minuten manuell zu stoppen. HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist ausschließlich für den Einmalgebrauch ausgelegt. Nicht wiederverwenden. Schritt 2: Pepsin, gebrauchsfertig Die Pepsin-Inkubation kann entweder bei Raumtemperatur (20 25 C) erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ bei 37 C, wie unter Methode B) beschrieben. Überschüssigen Puffer abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (wie z. B. einem saugfähigen Labortuch oder Gazetupfer) vorsichtig rund um die Probe alle verbleibende Flüssigkeit abwischen und dafür sorgen, dass Reagenzien innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs verbleiben. 5 8 Tropfen (250 µl) kaltes (2 8 C) Pepsin (Flasch e 2) zum Bedecken der Probe aufbringen. Pepsin immer bei 2 8 C lagern. Methode A) Inkubation bei Raumtemperatur 5 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren (20 25 C). Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 10 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in einer Färbeschale mit verdünntem Wash Buffer weichen lassen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNGEN, Abschnitt A.3). Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitt weitere 3 Minuten lang einweichen. Weiter mit Dehydrierung. Methode B) Inkubation bei 37 C; Probe mit Pepsin auf einen Heizblock bei 37 C stel len z.b. Dako Hybridizer und 3 Minuten inkubieren. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 3 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Pepsin durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte in verdünntem Wash Buffer 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Dehydrierung. In einer abgestuften Reihe von Ethanol-Bädern die Gewebeschnitte dehydrieren: 2 Minuten in 70%igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96%igem Ethanol. ( ) K /EFG/ULH/ p. 130/148

131 Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Schritt 3: HER2/CEN-17 Probe Mix, gebrauchsfertig Der folgende Schritt sollte unter einer Abzugshaube durchgeführt werden. Magenkarzinom 10 µl HER2/CEN-17 Probe Mix (Flasche 3) auf der Mitte des Gewebeschnitts aufbringen. Sofort über dem Probe Mix ein Eindeckglas von 22 mm x 22 mm Größe auflegen und Probe Mix sich gleichmäßig unter dem Deckglas ausbreiten lassen. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Sollten Luftblasen festgestellt werden, werden sie mit der Pinzette vorsichtig aus dem Gewebe herausgeklopft. Deckglas mit Coverslip Sealant absiegeln, indem das Abdichtmittel rund um die Peripherie des Deckglases aufgetragen wird. Den Coverslip Sealant das Deckglas und den Objektträger so überlappen lassen, dass er eine Abdichtung rund um das Deckglas bildet. Der Coverslip Sealant muss die gesamte Kante des Deckglases abdecken. Dako Hybridizer* (Code-Nr. S2450 oder S2451) für einen Hybridisierungslauf vorbereiten. Humidity Control Strips (Code-Nr. S2452) müssen gesättigt und optimal für den Gebrauch sein. Hybridizer starten und ein Programm wählen, das bei 82 C 5 Mi nuten lang denaturiert, und über Nacht (14 20 Stunden) bei 45 C hybridisieren (weitere Ei nzelheiten siehe Dako Hybridizer Gebrauchsanweisung). Objektträger in den Hybridizer legen, dabei muss der Deckel richtig geschlossen sein, und das Programm starten. *Für Denaturierung und Hybridisierung können Geräte eingesetzt werden, die Bedingungen bereitstellen, die den oben beschriebenen ähnlich sind: Objektträger auf eine ebene Metall- oder Keramikfläche (Heizblock oder Block eines Hybridisierungsofens) legen, die auf 82 (±2) C vor geheizt wurde. Fünf Minuten lang denaturieren lassen und gewährleisten, dass die Temperatur des Blocks zu keinem Zeitpunkt unter 80 C abfällt. Objektträger in eine vorgeheizte befeuchtete Hybridisierungskammer legen. Kammer mit einer Abdeckung versehen und über Nacht (14 20 Stunden) bei 45 (±2) C inkubieren. Bitte beachten: Zusammen mit den in diesem Kit bereitgestellten Sonden ist eine Hybridisierungstemperatur von 37 C ungeeignet. TAG 2 Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash Zwei Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Färbeschalen, mit verdünntem Stringent Wash Buffer befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.2). Für jede Schale wird ein Mindestvolumen von 100 ml oder von 15 ml pro Objektträger empfohlen. Eine Färbeschale mit verdünntem Stringent Wash Buffer bei Raumtemperatur unter eine Abzugshaube und die andere Färbeschale in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und den verdünnten Stringent Wash Buffer auf 65 C erwärmen. Die Temperatur muss sich stabilisiert haben. Schale mit Deckel versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Temperatur innerhalb der Schale im Wasserbad mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Der Stringent Wash Buffer enthält ein Detergenz, das bei 65 C ein getrübtes Aussehen annehmen kann. Die Leistung wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Mit einer Pinzette oder mit den durch Handschuhe geschützten Händen die Objektträger aus der Hybridisierungskammer nehmen. Vorsichtig Coverslip Sealant ebenso wie das Deckglas entfernen und die Objektträger jeweils einen nach dem anderen in die Raumtemperatur aufweisende Schale für den Vorwaschschritt geben. Sobald alle Deckgläser entfernt wurden, werden die Objektträger aus der für den Vorwaschschritt genutzten, Raumtemperatur aufweisenden Schale in die im Wasserbad (65 C) befindliche Schale transferiert. Waschen mit Stringent Wash Buffer genau 10 Minuten lang bei 65 C durchführen. Objektträger aus dem verdünnten Stringent Wash Buffer herausheben und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wa sh Buffer einweichen. Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitte 3 weitere Minuten lang einweichen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 131/148

132 Magenkarzinom In einer abgestuften Reihe von Ethanol-Bädern die Gewebeschnitte dehydrieren: 2 Minuten in 70%igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96%igem Ethanol. Gewebeschnitte vollständig trocknen lassen. Schritt 5: Fixierung Auf dem Targetbereich des Objektträgers 15 µl Fluorescence Mounting Medium mit DAPI (Flasche 5) aufbringen und mit einem Deckglas eindecken. HINWEIS: Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger kann nach 15 Minuten oder innerhalb von 7 Tagen nach dem Präparateinschluss erfolgen. Es kommt allerdings zu Verblassen, falls die Objektträger Licht oder hohen Temperaturen ausgesetzt werden. Um ein Verblassen auf dem Minimum zu halten, sind die Objektträger bei 2 8 C im Dunkeln aufzubewahren. Qualitätskontrolle - Magenkarzinom 1. Signale müssen hell, distinkt und leicht zu bewerten sein. 2. Normale Zellen dienen als interne Positivkontrolle für den Färbungsdurchgang. Normale Zellen sollten 1 2 deutlich sichtbare grüne Signale geben und darauf hinweisen, dass die CEN-17 PNA-Sonde erfolgreiche Anlagerung an die Centromer-Region von Chromosom 17 erreicht hat. Normal Zellen sollten außerdem 1 2 deutlich sichtbare rote Signale erbringen und darauf hinweisen, dass erfolgreiche Anlagerung der HER2 DNA-Sonde an das HER2-Amplicon stattfand. Durch das Mikrotomieren bedingt werden einige normale Zellen weniger als die für jede Farbe erwarteten 2 Signale erbringen. Werden bei normalen Zellen keine Signale nachgewiesen, verweist dies auf Assay- Versagen und die Ergebnisse müssen als ungültig angesehen werden. 3. Bei der Bewertung mit einem DAPI-Filter muss die Nucleus-Morphologie intakt sein. Zahlreiche schemenhafte Schattenzellen und eine generell schlechte nukleäre Morphologie verweisen auf übermäßige Andauung der Probe, die in Signalverlust oder -fragmentierung resultiert. Solche Proben müssen als ungültig angesehen werden. 4. Die Mindestanzahl bewertbarer Tumorzellen beträgt Unterschiede bei der Gewebefixierung und -einbettung im Labor des Anwenders können Variationen der Resultate hervorrufen und eine regelmäßige Evaluation der laborinternen Kontrollen erforderlich machen. Interpretation des Anfärbens - Magenkarzinom Bewertbares Gewebe Den Tumor innerhalb des Kontextes des mit dem HE-Verfahren angefärbten Objektträgers lokalisieren und den gleichen Bereich auf dem mit dem FISH-Verfahren verarbeiteten Objektträger (im DAPI-Filter) bewerten. Es sollten nur Proben von Patienten mit Magen-Adenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs ausgewertet werden. In Fällen mit intestinaler Metaplasie und Adenokarzinom in derselben Probe sollte nur die Karzinomkomponente ausgewertet werden. Stark entzündete und nekrotische Bereiche sowie Bereiche, in denen die nukleären Säume mehrdeutig sind, sind zu vermeiden. Es dürfen keine Nuclei einbezogen werden, bei denen ein subjektives Urteil gefällt werden muss. Nuclei mit schwacher Signalintensität und nicht spezifischer Hintergrundanfärbung dürfen nicht einbezogen werden. Zu Beginn den gesamten mit dem FISH-Verfahren angefärbten Objektträger und den auf dem H&E-Gewebeschnitt bestimmten Bereich mikroskopisch untersuchen. Vor der Auszählung eines mit dem FISH-Verfahren angefärbten Objektträgers die Gesamt-Signalverteilung (homogen oder heterogen) auf dem Auszählungsblatt beachten. Achten Sie bei einer heterogenen Verteilung darauf, ob eine fokale Amplifikation oder eine Einzel-Zell-Amplifikation (mosaikartig) vorliegt. ( ) K /EFG/ULH/ p. 132/148

133 Magenkarzinom 1) Homogene Signalverteilung Bei homogener Signalverteilung ermitteln Sie jeweils die Anzahl der Centromere der Chromosomen (grüne Signale) und die Anzahl der HER2-Gene (rote Signale) von 20 Zellen in 1-2 repräsentativen Tumorbereichen. 2) Heterogene Signalverteilung Bei heterogener Signalverteilung werden insgesamt 20 Zellen aus ausgewählten Bereichen ausgezählt, wie im Folgenden beschrieben: A) Bei Vorliegen einer fokalen Amplifikation müssen Bereiche mit amplifizierten Zellen ausgewählt werden. B) Bei Vorliegen einer mosaikartigen Verteilung oder amplifizierter, polysomaler und disomaler Zellen muss in Bereichen mit amplifizierten Zellen gezählt werden. In diesen Bereichen sollten nicht nur amplifizierte Zellen, sondern auch angrenzende nicht-amplifizierte Zellen gezählt werden, bis die Gesamtzahl von 20 Zellen erreicht ist. Wählen Sie möglichst keine überlappenden Bereiche aus. Vernachlässigen Sie dabei die Färbung bakterieller DNA. Eine Reihe spezialisierter Zellen (Mastzellen und Makrophagen), die verstreut im Magengewebe vorhanden sind, weisen aufgrund des Vorhandenseins bakterieller DNA eine starke Färbung durch die HER2-Sonde auf. Das führt zu stark rot fluoreszierenden Zellen, die sich deutlich von Tumorzellen mit einer hohen HER2 Genamplifikation unterscheiden. Auszählung Nachdem ein Bereich für die Auszählung ausgewählt wurde, beginnen Sie bei einem der 20 ausgewählten benachbarten Nuclei mit der Analyse und zählen dann Zelle für Zelle, wobei nur solche Nuclei ausgelassen werden, die die Qualitätsanforderungen nicht erfüllen. Zählen Sie die Anzahl der Signale innerhalb des nukleären Saums jedes bewerteten Nucleus nach den unten angeführten Leitlinien aus (siehe auch Anhang 7). - Auf- und abwärts fokussieren, um alle Signale im jeweiligen Nucleus ausfindig zu machen. - Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die geringer als der Durchmesser des Signals ist (oder ihm entspricht). Die Distanz muss mindestens so groß sein wie der Durchmesser eines Signals normaler Größe, damit zwei einzelne Signale gezählt werden können. Wenn die Distanz zwischen zwei Signalen geringer ist als der Durchmesser eines Signals, müssen diese als ein Signal gezählt werden. - Bei Nuclei mit hohen Niveaus der HER2-Genamplifikation können die HER2-Signale sehr nahe aneinander liegen und einen Signal-Cluster bilden. In diesen Fällen kann die Anzahl der HER2-Signale nicht ausgezählt werden und es muss eine Schätzung erfolgen. Besondere Aufmerksamkeit muss den grünen Signalen gewidmet werden, da Cluster von roten HER- Signalen die grünen Signale verdecken können, sodass sie nicht sichtbar sind. Im Zweifelsfall sind die grünen Signale mithilfe eines spezifischen FITC-Filters zu kontrollieren. Nuclei ohne Signale oder mit nur eine Farbe aufweisenden Signalen dürfen nicht in die Zählung einbezogen werden. Nur solche Nuclei bewerten, die ein oder mehrere FISH-Signale jeder Farbe zeigen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 133/148

134 Leitfaden für die Signalzählung Magenkarzinom 1 Nicht in die Zählung aufnehmen. Nuclei überlappen einander, nicht alle Bereiche der Nuclei sichtbar. 2 Zwei grüne Signale; Nuclei mit nur einer Signalfarbe dürfen nicht in die Zählung einbezogen werden. 3 Als 3 grüne und 12 rote Signale zählen (Cluster-Schätzung). 4 Als ein grünes und 1 rotes Signal zählen. Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die dem Durchmesser des Signals entspricht oder weniger als diesen ausmacht. 5 Nicht in die Zählung aufnehmen (übermäßige oder oder zu geringe Andauung der Nuclei). Fehlende Signale in der Mitte der Nuclei (ringförmige Nuclei). 6 Als 2 grüne und 3 rote Signale zählen. Als nur ein Signal werden zwei Signale gewertet, die die gleiche Größe aufweisen und durch eine Distanz voneinander getrennt sind, die dem Durchmesser des Signals entspricht oder weniger als diesen ausmacht. 7 Als ein grünes und 5 rote Signale zählen. 8 Als 3 grüne (1 grünes Signal mit verschwommenem Fokus) und 3 rote Signale zählen. 9 Cluster roter Signale kaschieren grüne Signale. Grüne Signale mit einem spezifischen FITC-Filter überprüfen oder nicht in die Zählung aufnehmen. Zählungen wie in Anhang 5 und 6 verdeutlicht in einer Tabelle aufzeichnen. Pro Gewebeprobe werden 20 Nuclei ausgezählt, und zwar wo möglich von deutlich erkennbaren Tumorbereichen. Das HER2/CEN-17-Verhältnis wie folgt berechnen: Dividieren der Gesamtzahl roter HER2-Signale durch die Gesamtzahl grüner CEN-17-Signale. Für Proben mit einem HER2/CEN-17-Verhältnis über oder gleich 2 ist die Amplifikation des HER2-Gens anzunehmen (27). Ergebnisse am oder nahe des Cut-off-Wertes (1,8 2,2) sind mit Vorsicht zu interpretieren. Liegt das Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8 2,2) sind 40 weitere Nuclei auszuzählen, und das Verhältnis wird auf der Basis von 40 Nuclei berechnet. Liegt die Auszählung weiterhin im grenzwertigen Bereich, gilt das Ergebnis der zweiten Bewertung. Für eine bessere Orientierung während der zweiten Auszählung sollte, falls verfügbar, eine HER2-immunhistochemische Färbung einbezogen werden. Im Zweifelsfall ist eine erneute Bewertung des Objektträgers vorzunehmen. Bei Fällen im Borderline-Bereich sollte eine Konsultation zwischen dem Pathologen und dem behandelnden Arzt stattfinden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 134/148

135 Magenkarzinom Beschränkungen - Magenkarzinom 1. Als zahlreiche Schritte umfassender diagnostischer Prozess erfordert das FISH-Verfahren spezielle Schulung und Ausbildung in der Auswahl der angemessenen Reagenzien, in der Selektion, Fixierung und Verarbeitung von Geweben, der Vorbereitung des FISH-Objektträgers und in der Interpretation der Färberesultate. 2. Mit dem FISH-Verfahren erhaltene Resultate sind von der Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor dem Färbeschritt abhängig. Unsachgemäßes Fixieren, falsches Waschen, Trocknen, Erwärmen, Schneiden oder Kontamination mit anderen Geweben oder Flüssigkeiten können die Sondenhybridisierung beeinflussen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein. 3. Die auf Objektträger aufgezogenen Gewebe müssen für optimale und reproduzierbare Ergebnisse vollständig entwachst werden. Diese Paraffinentfernung muss zu Beginn des gesamten Färbeverfahrens abgeschlossen worden sein. (Siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt B.2.) 4. Es sind ausschließlich Wasserbäder, Heizblöcke und Hybridisierungsöfen mit geeichten Einrichtungen für die Temperaturregelung zu verwenden. Die Verwendung anderer Gerätetypen muss vom Anwender validiert werden, da es hierbei während der Hybridisierung zu Verdunsten des HER2/CEN-17 Probe Mix kommen kann. Leistungsmerkmale - Magenkarzinom Hintergrund Die Sicherheit und Effizienz von Trastuzumab (Herceptin ) ist in einer klinischen Studie (der ToGA-Studie) nachgewiesen worden (26). Die Studie wurde als randomisierte multizentrische Open Label-Studie der Phase III an HER2-positiven Patienten mit inoperablem, lokal fortgeschrittenem, rezidivem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens oder ösophagogastralen Übergangs durchgeführt. In der ToGA-Studie wurde ermittelt, dass die HER2- Positivität entweder IHC-positiv (3+) (HercepTest, Dako) und/oder positiv durch das HER2 FISH-Verfahren (HER2/CEN ) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako) ist. Nachdem die Patienten in die Studie aufgenommen waren, wurde per Zufallsprinzip bestimmt, welche Patienten Chemotherapie (5-FU oder Capecitabine und Cisplatin) und welche Chemotherapie plus Trastuzumab erhielten. Diese Studie zielte auf das Gesamt-Überleben (OS) ab. In der Studie wurden insgesamt 594 Patienten randomisiert, und 584 Patienten erhielten das Prüfmedikament und wurden in das Full Analysis Set (FAS) aufgenommen. Bezüglich des Gesamt- Überlebens erwies sich die Kombination aus Chemotherapie und Trastuzumab im Vergleich zur Chemotherapie allein als statistisch überlegen. Das mittlere Gesamt-Überleben stieg von 11,1 auf 13,8 Monate (p = 0,0046) bei einer Hazard Ratio von 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Die Kaplan-Meier- Kurven für das Gesamt-Überleben sind in Abbildung 2 dargestellt. ( ) K /EFG/ULH/ p. 135/148

136 Magenkarzinom Überlebenswahrscheinlichkeit 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-Test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Zeit (Monate) verbleibende Anzahl Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Behandlungsgruppe Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Abbildung 2. Kaplan-Meier-Kurve für das Gesamt-Überleben (n=584). Als die Daten vorlagen, wurden vorher bestimmte diagnostische Untergruppenanalysen gemäß HER2-Status durchgeführt und zusätzlich auf Grundlage der IHC-Bewertung post hoc zwei neue HER2-Untergruppen definiert: Gruppe 1 ( schwach HER2 exprimierende Gruppe ): Gruppe 2 ( stark HER2 exprimierende Gruppe ): IHC 0/FISH+ und IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ und IHC 3+ (FISH+ oder FISH oder FISH ergebnislos) (n=446) Als die Primäranalyse zum Gesamt-Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe (n=446) post hoc wiederholt wurde, war der Vorteil zugunsten der kombinierten Behandlung noch stärker. Das mittlere Gesamt-Überleben bei der Patientengruppe, der Chemotherapie zusammen mit Trastuzumab verabreicht wurde, stieg auf 16,0 Monate im Vergleich zu 11,8 Monaten bei den Patienten, bei denen die Chemotherapie allein angewendet wurde. Der Hazard Ratio sank bei dieser Analyse auf 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Die Kaplan-Meier-Kurven für das Gesamt- Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe sind in Abbildung 3 dargestellt. ( ) K /EFG/ULH/ p. 136/148

137 Magenkarzinom Überlebenswahrscheinlichkeit 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Zeit (Monate) verbleibende Anzahl Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Behandlungsgruppe Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Abbildung 3. Kaplan-Meier-Kurve für das Gesamt-Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe (n=446). In der BO18255-Studie wurde der klinische Nutzen sowohl des HercepTest als auch des HER2 FISH pharmdx Kit zur Bestimmung des HER2-Status bei Patienten mit inoperablem, lokal fortgeschrittenem, rezidivem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens oder ösophagogastralen Übergangs nachgewiesen. Analytische Empfindlichkeit Bei der Untersuchung der analytischen Empfindlichkeit des HER2/CEN-17 Probe Mix wurden 18 Magen-Adenokarzinom-Proben verwendet. Auf der Grundlage des Auszählens von 20 Nuclei von normalen Zellen um den Tumor herum wurde das Verhältnis zwischen der Anzahl von HER2- Signalen und CEN-17-Signalen berechnet. Für das HER2/CEN-17-Verhältnis wurde ein Wert zwischen 0,91 und 1,09 berechnet, der im vorher festgelegten Akzeptanzbereich lag. Analytische Spezifizität Zur Bestätigung einer Gesamtabdeckung von 218 kb einschließlich des HER2-Gens wurden die HER2-DNA-Sonden im HER2/CEN-17 Probe Mix der Endsequenzierung und Kartierung unterzogen. Die CEN-17-PNA-Sonden im HER2/CEN-17 Probe Mix wurden einzeln und in Kombination miteinander getestet, um ihre spezifische Hybridisierung der Centromer-Region von Chromosom 17 zu bestätigen. Um eine Kreuz-Anlagerung an andere Chromosome als an Chromosom 17 auszuschließen, wurden Studien an Metaphasen-Spreads durchgeführt. Insgesamt 250 Metaphasen- Ausdehnungen wurden auf die spezifische Hybridisierung der HER2-DNA und CEN-17 PNA Probe Mixes bewertet. In allen 250 Fällen erwies sich die Anlagerung als für Chromosom 17 spezifisch. In keinem der 250 Fälle wurde eine Kreuz-Anlagerung an Loci anderer Chromosome beobachtet. Studien zur Robustheit Testung der Robustheit des HER2 FISH pharmdx Assays erfolgte anhand von unterschiedlichen Vorbehandlungszeiten und -temperaturen, Pepsin-Inkubationszeiten, Denaturierungstemperaturen, Hybridisierungszeiten und -temperaturen sowie Zeiten und Temperaturen des Waschschritts mit adstringierendem Puffer und Pufferkonzentrationen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 137/148

138 Magenkarzinom Unter den folgenden Experimentalbedingungen wurde keine signifikante Differenz bei den Resultaten erhalten: Vorbehandlung 7, 9, 10, 11 und 13 Minuten lang bei ºC Vorbehandlung bei 89, 92 und C 10 Minuten l ang. Pepsin-Inkubationszeiten von 2, 2½, 3 und 4 Minuten bei 37 C. Denaturierungstemperaturen von 72, 77, 82, 87 und 92 C 5 Minuten lang. Hybridisierungszeiten 10, 12 und 14 Stunden. Hybridisierungstemperaturen von 40, 45 und 50 C. Stringenzwaschung 5, 10 und 15 Minuten lang bei 65 C Stringenzwaschung 10 Minuten lang bei 60, 65 und 70 C Pufferkonzentration bei der Stringenzwaschung von 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 und 1:40 Hinweis: Bei den Robustheitstests wurde beim Färbeverfahren jeweils nur ein Parameter geändert, während alle anderen Parameter konstant blieben. Es wird empfohlen, die im Färbeverfahren angegebene Zeit und Temperaturen einzuhalten. Wiederholbarkeit Mit dem HER2 FISH pharmdx Kit wurde die Wiederholbarkeit des HER2/CEN-17- Verhältnisses an 3 konsekutiven histologischen Schnitten von 9 verschiedenen Magen- Adenokarzinom-Proben untersucht. Der Variationskoeffizient lag bei 1 5 % im vorher festgelegten Akzeptanzbereich. Die Wiederholbarkeit bei konsekutiven Gewebeschnitten von Magen-Adenokarzinom-Proben (IHC HER2 2+) mit unterschiedlicher Dicke (2 7 µm) wurde mit dem HER2 FISH pharmdxtm Kit getestet. In dieser Studie betrug der Variationskoeffizient des HER2/CEN-17-Verhältnisses 2 6 %, d. h. der Koeffizient lag im selben Bereich wie bei Geweben gleicher Dicke und im vorher festgelegten Akzeptanzbereich. Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Tagen, in verschiedenen Studienzentren und bei verschiedenen Untersuchern wurde mit dem HER2 FISH pharmdx Kit überprüft. Gewebeschnitte von 24 verschiedenen Magenkrebsproben aus Magengewebe (75 %) oder dem ösophagogastralen Übergang (25 %) wurden an fünf nicht aufeinanderfolgenden Tagen von zwei Untersuchern an drei Studienzentren eingefärbt und analysiert. Daraus ergaben sich 720 Signalauszählungen des HER2/CEN-17-Verhältnisses (siehe Tabelle 10). Die Proben stammten aus chirurgischen Resektionen (70 %) und Biopsien (30 %) mit einer gleichen Anzahl nicht amplifizierter, IHC 2+ (bestimmt durch HercepTest ) und amplifizierter Proben. Tabelle 10. HER2/CEN-17 Verhältnisbestimmungen aus 720 Signalauszählungen Studienzentrum Eins Untersucher Studienzentrum Zwei Untersucher Studienzentrum Drei Untersucher A B C D E F Gesamt Tag Tag Tag Tag Tag Gesamt ( ) K /EFG/ULH/ p. 138/148

139 Magenkarzinom Der durchschnittliche VK (Standardabweichung / Durchschnitt x 100) für das HER2/CEN-17- Verhältnis, der für jeden Untersucher aus den acht Proben in jeder Kategorie bestimmt wurde (fünf Untersuchungen pro Block) ist in Tabelle 11 zu sehen. Die gesamten durchschnittlichen VK für jeden Untersucher betrugen jeweils 5,4 %, 3,8 %, 12,0 %, 11,9 %, 4,7 % und 24,4 % (Tabelle 11). Die durchschnittlichen VK für jede Kategorie für alle kombinierten Untersuchungen (Tage, Studienzentren, Untersucher) betrugen 22,8 %, 16,5 % und 25,2 % jeweils für die nicht amplifizierte, IHC 2+ und amplifizierte Kategorie. Tabelle 11. Der durchschnittliche VK zwischen verschiedenen Tagen (%) für jeden Untersucher und der durchschnittliche VK (%) für alle Auszählungen in den drei Kategorien. Durchschnittliche VK (%) Studienzentrum Eins Untersucher Studienzentrum Zwei Untersucher Studienzentrum Drei Untersucher Alle Studienzentren Alle Untersucher A B C D E F Nicht amplifiziert 5,4 4,7 8,1 16,3 3,1 20,6 22,8 IHC 2+ 6,2 3,9 8,9 7,5 4,5 17,2 16,5 Amplifiziert 4,7 2,9 19,1 11,9 6,6 35,3 25,2 Alle Kategorien 5,4 3,8 12,0 11,9 4,7 24,4 21,5 Tabelle 11 zeigt den durchschnittlichen VK (%) für jeden Untersucher an den drei Studienzentren (Variation zwischen verschiedenen Tagen) für Bestimmungen des HER2/CEN-17-Verhältnisses. In der letzten Spalte wird der durchschnittliche VK (%) für alle Bestimmungen für jede Probe in den drei Kategorien angegeben. Durch Verwendung statistischer Variationskoeffizientenmodelle ergab sich, dass die Variationen bei den eigentlichen Proben zum Großteil der Variationen zwischen verschiedenen Tagen, verschiedenen Studienzentren und verschiedenen Untersuchern beigetragen haben. Hybridisierungseffizienz Die Hybridisierungseffizienz des HER2 FISH pharmdx Kit wurde im Rahmen der Reproduzierbarkeitsstudie untersucht. Aus den gesamten 360 formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten, die an den drei Studienzentren untersucht wurden, konnten 358 gemäß den Produktrichtlinien ausgezählt werden. Daraus ergab sich eine Hybridisierungseffizienz von 99,4 %. ( ) K /EFG/ULH/ p. 139/148

140 Fehlersuche - Magenkarzinom Magenkarzinom Problem Wahrscheinliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Signale oder schwache Signale 2. Keine grünen Signale 3. Keine roten Signale 1a. Kit wurde während Transport oder Lagerung hohen Temperaturen ausgesetzt 1b. Funktionsstörung des Mikroskops - Unangemessener Filtersatz - Falsche Lampe - Quecksilber- damfpflampe zu alt - Verschmutzte und/oder gesprungene Sammellinsen - Ungeeignetes Immersionsöl 1c. Abgeschwächte Signale 1d. Falsche Vorbehandlungsbedingungen 1e. Verdunsten des Probe Mix während der Hybridisierung 2a. Falsche Bedingungen beim Waschschritt mit Stringent Wash 3a. Falsche Vorbehandlungsbedingungen 1a. Lagerungsbedingungen überprüfen. Bei Entgegennahme der Lieferung muss Trockeneis vorhanden gewesen sein. Flaschen 2, 3 und 5 müssen bei maximal 2 8 C und Flaschen 3 und 5 lichtgeschützt gelagert worden sein. 1b. Mikroskop überprüfen und gewährleisten, dass die genutzten Filter für die Kitfluorochrome geeignet sind und dass die Quecksilberdampflampe angemessen ist und ihre Nutzungszeit nicht überschritten wurde (siehe Anhang 7). Im Zweifelsfall mit Kontakt mit dem Mikroskop-Lieferanten aufnehmen. 1c. Lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und Aussetzung zu starkem Licht auf einem Minimum halten. 1d. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. 1e. In der Hybridisierungskammer muss ausreichend Feuchtigkeit vorhanden sein. 2a. Für den Waschschritt mit Stringent Wash muss die korrekte Temperatur und Zeit genutzt werden und vor diesem Waschschritt müssen die Deckgläser entfernt werden. 3a. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. ( ) K /EFG/ULH/ p. 140/148

141 Magenkarzinom Problem Wahrscheinliche Ursache Empfohlene Maßnahme 4. Bereiche ohne 4a. Zu geringes Signal Sondenvolumen 5. Übermäßige Hintergrundanfärbung 6. Schlechte Gewebemorphologie 4b. Einschluss von Luftblasen während des Auftragens von Probe Mix oder beim Aufziehen 5a. Falsche Gewebefixierung 5b. Paraffin nicht vollständig entfernt 5c. Zu niedrige Temperatur der Stringent Wash-Lösung 5d. Verlängerte Aussetzung des hybridisierten Abschnitts zu starkem Licht 6a. Falsche Pepsin- Behandlung 6b. Falsche Vorbehandlungsbedingungen können zu unklarem oder getrübtem Aussehen führen 6c. Zu lange Pepsin- Behandlung oder sehr dünne Schnitte können zum Auftreten von Schattenoder bikonkaven Doughnut -Zellen führen 4a. Das Sondenvolumen muss zum Abdecken des Bereichs unter dem Deckglas ausreichen. 4b. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Falls vorhanden, vorsichtig mit Pinzette wegklopfen. 5a Es dürfen nur formalinfixierte paraffineingebettete Schnitte verarbeitet werden. 5b. Den Verfahren für Entwachsen und Rehydrieren in Abschnitt B.2 folgen. 5c. Die Temperatur der Stringent Wash-Lösung muss 65 (±2) C betragen. 5d. Lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und Aussetzung zu starkem Licht auf einem Minimum halten. 6a. Die empfohlenen Pepsin-Inkubationszeiten befolgen. Siehe Abschnitt B.3., Schritt 2. Pepsin muss bei der korrekten Temperatur gehandhabt werden. Siehe Abschnitt B.1 6b. Die empfohlene Vorbehandlungstemperatur und -zeit müssen genutzt werden. 6c. Pepsin-Iinkubationszeit verkürzen. Siehe Abschnitt B.3., Schritt 2. Die Schnittstärke muss 3 6 µm betragen. HINWEIS: Sollte das Problem nicht auf eine oder mehrere der oben angeführten Ursachen zurückzuführen sein oder wenn das Problem durch die vorgeschlagene Abhilfemaßnahme nicht ausgeräumt werden kann, wird gebeten, den Technischen Kundendienst von zu verständigen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 141/148

142 Magenkarzinom Anhang 4 - Magenkarzinom HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Protokoll-Checkliste Datum (Tag 1) des Färbelaufs: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Charge: Proben-ID: Geräte-ID: Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des 1 x Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20): / Logbuch-ID des Färbelaufs: Fixierung des Gewebes in neutralem gepuffertem Formalin Ja Nein TAG 1 Schritt 1: Vorbehandlung Datum des Ansetzens / Verfallsdatum der Pre-Treatment Solution (Flasche 1, Verdünnung 1:20): Gemessene Temperatur der Pre-Treatment Solution (95 99 C), falls im Wasserbad erhitzt wird Vorbehandlung (10 Minuten) und Abkühlen (15 Minuten) Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Schritt 2: Pepsin Dauer der Behandlung mit Pepsin (Flasche 2) bei 37 C oder Dauer der Behandlung mit Pepsin (Flasche 2) bei Raumtemperatur Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Entwässern der Objektträger (3 x 2 Minuten) in abgestufter Reihe von Ethanol- Bädern und Lufttrocknung Schritt 3: HER2/CEN-17 Probe Mix Auftrag von Probe Mix (Flasche 3), Eindecken und Abdichten mit Coverslip Sealant / C Minuten Minuten Gemessene Denaturierungstemperatur (82 ± 2 C) C Denaturierung über einen Zeitraum von 5 Minuten Gemessene Hybridisierungstemperatur (45 ± 2 C) C Hybridisierung über Nacht (lichtgeschützt) TAG 2 Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des Stringent Wash Buffer (Flasche 4, Verdünnung 1:20) Gemessene Temperatur des Stringent Wash Buffer (65 C) C Waschen mit Stringent Wash Buffer (10 Minuten) nach Entfernen der Deckgläser Waschen in Wash Buffer (Flasche 6, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten) Entwässern der Objektträger (3 x 2 Minuten) in abgestufter Reihe von Ethanol- Bädern und Lufttrocknung Schritt 5: Fixierung 15 µl Fluorescence Mounting Medium (Flasche 5) aufbringen und eindecken Anmerkungen: / Stunden Datum und Unterschrift Laborant/in: ( ) K /EFG/ULH/ p. 142/148

143 Magenkarzinom Anhang 5 - Magenkarzinom HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Bewertungsschema HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Charge: Logbuch-ID des Färbelaufs: Datum (Tag 1) des Färbelaufs: Proben-ID: Charakterisierung der Signalverteilung im Gewebe: Homogen: Heterogen fokal: oder Heterogen mosaikartig: Signale von 20 Nuclei auszählen Nuclei Nr. rot (HER2) grün (CEN-17) Nuclei Nr. rot (HER2) grün (CEN-17) Gesamt 1-10 Gesamt Zum Ermitteln des HER2/CEN-17-Verhältnisses wird bei den gleichen 20 Nuclei die Anzahl der HER2-Signale und die Anzahl der CEN-17-Signale gezählt, woraufhin dann die Gesamtzahl der HER2-Signale durch die Gesamtzahl der CEN-17-Signale dividiert wird. Liegt das HER2/CEN-17- Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8 2,2), werden 40 weitere Nuclei ausgezählt und das Verhältnis erneut berechnet (siehe Bewertungsschema für Neuauszählung). HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-Verhältnis GESAMTSCORE (1-20) Verhältnis < 2: HER2-Genamplifikation wurde nicht beobachtet Verhältnis 2: HER2-Genamplifikation wurde beobachtet Datum und Unterschrift Laborant/in: Datum und Unterschrift Pathologe/Pathologin: Leitlinien für die Punktvergabe: siehe Interpretation des Anfärbens. ( ) K /EFG/ULH/ p. 143/148

144 Anhang 6 - Magenkarzinom Magenkarzinom HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Bewertungsschema für Neuauszählung HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Charge: Datum (Tag 1) des Färbelaufs: Logbuch-ID des Färbelaufs: Proben-ID: Signale in weiteren 40 Nuclei (1-40) Nuclei rot grün Nuclei rot grün Nuclei rot grün Nuclei Nr. HER2 CEN-17 Nr. HER2 CEN-17 Nr. HER2 CEN-17 Nr rot HER2 grün CEN Gesamt Gesamt Gesamt Gesamt Zum Ermitteln des HER2/CEN-17-Verhältnisses wird bei den gleichen 40 Nuclei die Anzahl der HER2- Signale und die Anzahl der CEN-17-Signale gezählt, woraufhin dann die Gesamtzahl der HER2-Signale durch die Gesamtzahl der CEN-17-Signale dividiert wird. Geben Sie den Gesamtscore der Nuclei 1-40 in der Tabelle weiter unten an. HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-Verhältnis GESAMTSCORE (1-40) Verhältnis < 2: HER2-Genamplifikation wurde nicht beobachtet Verhältnis 2: HER2-Genamplifikation wurde beobachtet Datum und Unterschrift Laborant/in: Datum und Unterschrift Pathologe/Pathologin: Leitlinien für die Punktvergabe: siehe Interpretation des Anfärbens. ( ) K /EFG/ULH/ p. 144/148

145 Magenkarzinom Anhang 7 - Magenkarzinom HER2 FISH pharmdx Kit, Code K5331 Spezifikationen des Fluoreszenzmikroskops Dako empfiehlt für die Verwendung zusammen mit dem HER2 FISH pharmdx Kit, K5331, die folgenden Ausstattungen: 1. Mikroskop - Ausführung Epifluoreszenz-Mikroskop. 2. Lampe Quecksilberdampflampe, 100 Watt (es sind Aufzeichnungen über die Einschaltzeit zu führen). 3. Objektive Für ein Screening des Gewebes: Frontoptik für trockene Betrachtung, 10X-Objektiv, oder Frontoptik für Ölimmersion, 16X-Objektiv. Für hochauflösende Vergrößerung und für die Punktbewertung der Signale werden nur Frontlinsen für Ölimmersion, z. B. 100X, empfohlen. 4. Filter Filter werden jeweils für spezifische Fluorochrome konzipiert und müssen entsprechend ausgewählt werden. Dako empfiehlt die Verwendung eines spezifischen DAPI-Filters in Kombination mit einem qualitativ hochwertigen Texas Red-/FITC-Doppelfilter. DAPI-Filter, z. B. Chroma -Filter Nr Texas Red-/FITC-Doppelfilter, z. B. Chroma -Filter Nr Texas Red- und FITC-Einzelfilter können für die Bestätigung genutzt werden. Fluorochrom Anregungswellenlänge Emissionswellenlänge FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter sind für jeden Mikroskoptyp spezifisch und für die Interpretation ist die Nutzung der jeweils angemessenen Filter unerlässlich. Ausführlichere Informationen können vom Hersteller des Mikroskops oder vom zuständigen Dako-Repräsentanten eingeholt werden. 5. Öl Nicht fluoreszierendes Öl. Vorsichtsmaßnahmen Eine Quecksilberdampflampe von 50 Watt wird nicht empfohlen. Rhodamin-Filter können nicht verwendet werden. Dreifachfilter werden nicht empfohlen. Ein nicht optimiertes Mikroskop kann Probleme beim Lesen der Fluoreszenzsignale verursachen. Große Bedeutung kommt der Tatsache zu, dass die Lichtquelle nicht ihren Nutzbarkeitszeitraum überschritten hat und korrekt ausgerichtet und fokussiert wurde. Hinsichtlich der Quecksilberdampflampe ist die Leistungsüberprüfung nach den Herstelleranleitungen durchzuführen. Vor einer Interpretation der Ergebnisse muss das Mikroskop gewartet und die korrekte Ausrichtung der Quecksilberdampflampe sichergestellt werden. Damit eine Abschwächung der Fluoreszenz vermieden wird ist sicherzustellen, dass die Probe so wenig Anregungslicht als möglich ausgesetzt wird. Vor dem ersten Durchführen der FISH-Technik wird empfohlen, das Einrichten des im Labor genutzten Mikroskops mit dem Hersteller zu diskutieren oder auf die Literatur Bezug zu nehmen. ( ) K /EFG/ULH/ p. 145/148

146 References/ Références/ Literatur 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43(1): Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): ( ) K /EFG/ULH/ p. 146/148

147 23. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): ( ) K /EFG/ULH/ p. 147/148

148 Explanation of symbols/ Explication des symboles/ Erläuterung der Symbole C atalogue number R éférence du catalogue Bestellnumm er Temperature limitation Limites de température Zulässiger Tem peraturbereich Batch code Code du lot Chargenbezeichnung Toxic Toxique Giftig In vitro diagnostic medic al device D ispos itif médical de diagnostic in vitro In-Vitro-Diagnostikum Keep away from sunl ight (consult s torage secti on) Protéger de la lum ière du soleil (voir section Stock age) Lichtgeschützt lagern (siehe Abschnitt zur Lagerung) Use by Utilis er jusqu à Verw endbar bis Extrem ely flammable Extrêm em ent inflam mable Hochentzündlich C onsult ins truc tions for us e C onsulter les instructions d utilisation Gebrauchsanw eis ung beachten Contains s ufficient for <n> tests Contenu suffisant pour <n> tes ts Inhalt ausreichend für <n> Ansätze Manufac turer Fabric ant Hersteller Dangerous for the environm ent Dangereux pour l environnement Umw eltgefährlich Manufactured by/ Fabriqué par / Hergestellt von: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax ( ) K /EFG/ULH/ p. 148/148