Versuch Fluoreszente Proteine

Transkript

1 Versuch 1. Worum geht es bei diesem Versuch? Nachdem inzwischen die Genome wichtiger Modellorganismen (Hefe, Aspergillus, Arabidopsis, Reis, Drosophila, Caenorhabditis, Maus, Mensch) durchsequenziert wurden, geht es im inzwischen angebrochenen postgenomischen Zeitalter darum, die Funktion all dieser unzähligen Gene zu verstehen. Dabei spielt die gewebespezifische oder subzelluläre Lokalisierung der entsprechenden Proteine eine wichtige Rolle. Diese Fragen können durch den Einsatz fluoreszenter Proteine untersucht werden und sollen in dem Versuch exemplarisch vorgestellt werden. Bevor man die fluoreszenten Proteine, wie z.b. GFP oder RFP, beobachten kann, müssen die entsprechenden Gene mit z.b. dem GFP Gen fusioniert und die DNA-Konstrukte in die Zellen eingeführt werden. Dies kann entweder stabil erfolgen oder aber nur vorübergehend (transient). In dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans wird die Protoplastentransformation verwendet, um stabile Transformanden herzustellen. Dazu werden die Zellwände verdaut, die Protoplasten isoliert und mit der zu transformierenden DNA inkubiert. Die DNA wird in Gegenwart von Polyethylenglycol in die Zellen aufgenommen, gelangt in den Zellkern und wird dort meistens nicht-homolog in das Genom integriert. Dadurch wird die Fremd-DNA bei jeder DNA-Replikation mit dupliziert und damit weitervererbt. 2. Wie ist der Versuch aufgebaut? GFP und mcherry werden als Reporter verwendet. Das α-tubulin Gen wurde in einem Plasmid mit mcherry fusioniert und VipA mit GFP. In unserem Versuch wird das Plasmid mit dem vipa Gen in A. nidulans transformiert und die Lokalisierungen untersucht. Die Abbildung 2a zeigt mcherry-markierte Mikrotubuli und das GFP-markierte Protein (2b), das aufgrund der NLS in die Zellkerne importiert wird und so dieses Organell anfärbt. 1) Scheme of constructed vector 2) Localization of mcherry on Microtubules (a) and GFP (b) in the nuclei of A. nidulans hyphae. (c) Double-labeling of Microtubules (mcherry) and nuclei (GFP).

2 Zeitplan Erste Woche (je nach Feiertag) Dienstag / Donnerstag: Spore inoculation in liquid culture media. Incubation overnight Mittwoch / Freitag: Introduction, Preparation of media, Protoplast transformation Zweite Woche (je nach Feiertag) Dienstag: Spore inoculation for microscopy (your transformants and our stock strains) Mittwoch und Donnerstag: Microscopy (1 group for 1,5 hours) A. nidulans strain SSH62: alca (p) -mcherry-tuba (pyrg89) Plasmid Konstrukte: alca (p) -GFP-vipA Marker auf Plasmid: pyr4 Transformation SSH62 + alca (p) -GFP-vipA

3 Arbeitsanweisungen und Protokolle Protoplastentransformation Medien und Medienzusätze Liquid culture media (200 ml per group) 10 ml Salt stock solution 200 µl Microelement stock solution 4 g Glucose 0.2 g Uridine 0.2 g Uracil fill up to 200 ml adjust to ph 6.5 using 10 N NaOH. MMR*** (500 ml) 25 ml Salts stock solution 500 µl Microelement stock solution 10 g Glucose 171 g Sucrose adjust to ph 6.5 using 10 N NaOH. 7,5 g Agar fill up to 500 ml ***To make plates, put a rotator in the bottle. Make plates in the clean bench (Two kinds plates, each 2 plate per group) MMUU (500 ml) 25 ml Salts stock solution 500 µl Microelement stock solution 10 g Glucose 0.2 g Uridine 0.2 g Uracil adjust to ph 6.5 using 10 N NaOH. 7,5 g Agar fill up to 500 ml

4 MMR-TOP (200ml) 10 ml Salts stock solution 200 µl Microelement stock solution 68 g Sucrose adjust to ph 6.5 using 10 N NaOH 1.2 g Agar fill up to 200 ml Microscopy Minimal medium (MM Gly 1L) 50 ml Salt stock solution 1 ml Microelement stock solution 20 ml Glycerol adjust to ph 6.5 using 10 N NaOH Ready-made 20 x Salt stock solution 120 g NaNO3; 10.4 g KCl; 10.4 g MgSO4 x 7H2O; 30.4 g KH2PO x Microelement stock solution: 22 g ZnSO4 x 7H2O; 11 g H3BO3; 5 g MnCl2 x 4H2O; 5 g FeSO4 x 7H2O; 1.6 g CoCl2 x 5H2O; 1.6 g CuSO4 x 5H2O; 1.1 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O;50 g Na4 EDTA; adjust to ph using KOH Sterile miracloth, sterile Zahnstocher Puffer und Lösungen für die Protoplastentransformation Solution 2 (50ml): 14,9 g MgSO4 x 7H2O 1,8 ml Na2HPO4 0,2M 0,7 ml NaH2PO4 0,2M ph 5,5 Sterilize by filtration (store at 4ºC) Solution 5 (100ml): 10,9 g Sorbitol (0.6 M) 10 ml TrisCl 1M ph 7.5 (0.1 M)

5 Solution 6 (100ml): 18,22 g Sorbitol (1 M) 1 ml TrisCl 1M ph 7.5 Solution 7 (100ml): 18,22 g Sorbitol (1 M) 1 ml TrisCl 1M ph ml CaCl2 1M Solution 8 (50ml): 30 g PEG4000 0,5 ml TrisCl 1M ph 7.5 0,5 ml CaCl2 1M Making Protoplasts Scratch up spores from the plate of SSH62 by platinum loop Inoculate spores to liquid medium (200 ml) and incubate overnight (12-16 h) at 30 C. Filter the culture through sterile miracloth using funnel. Wash the mycelium with sterile water. Remove excess water by paper. Collect the mycelium with a little spoon to 50 ml Falcon tube. Add 10 ml of solution 2 in the 50 ml sterile Falcon and vortex Add 150 mg GlucanX vortex and incubate at 30 C (waterbath) for 1h 30min with gentle shaking (100 rpm). After this time, check the protoplasts at the microscope. If you don t have enough, incubate longer. Overlay 10 ml Solution 5, with a sterile pipette carefully and slowly close to the surface of the liquid. Do not disturb the surface of buffer separation. Centrifuge 15 minute to 5000 rpm (up and down slowly), 4 C If you see a bands of protoplast collect they with a sterile Pasteur pipette and transfer to a sterile 50 ml Falcon tube (5 ml). Keep on ice Add the 2 times volume of pre-cold solution 6 (10 ml) Centrifuge 2800 g, 4 C for 15 minutes Remove the supernatant by decantation and add 1 ml of pre-cold solution 6. Resuspend the pellet and transfer to 1,5 ml Eppendorf Centrifuge 2800 g, 4 C for 5 minutes and remove the supernatant

6 Resuspend the pellet in 400 µl pre-cold solution 7. Check one drop under microscope Transformation Add 200 µl protoplasts in 15 ml Falcon tube (x 3) 1-5 µl of DNA (approx. 10 µg of DNA) 50 µl of solution 8 (viscous liquid) Mix carefully, and 20 minutes incubation on ice Heat MMR-TOP by microwave and cool down at room temperature Prepare MMR plates (2 plates for each transformation). Add 1 ml of PEG. Mix and roll the tube until it looks homogeneous 5 minutes incubation at room temperature Add 3-4 ml (more or less until total volume is 5 ml) of pre-cold solution 7 Add MMR-TOP up to 15 ml and spread different volumes on two plates Incubate 2-3 days 37 C.

7 Microscope analysis Flamed and sterile cover slips, add 0.5 ml MM glycerol media on top. Pick the colonies with sterile toothpicks from the transformation-plate and our stock strain (positive control), and put some spores into media. Incubate over night at 28 C. Fluorescent protein spectra Schematic of a fluorescence microscope