Aus der Hautklinik Universitätsklinikum Erlangen Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. G. Schuler

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1 Aus der Hautklinik Universitätsklinikum Erlangen Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. G. Schuler Ex vivo Isolation und Charakterisierung von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen unter spezifischer Immuntherapie bei Typ I-Allergie auf Inhalationsallergene Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Andreas Maronna aus Bayreuth

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Herr Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler Referent: Frau Prof. Dr. med. V. Mahler Korreferent: Herr Prof. Dr. med. G. Schuler Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinen Eltern gewidmet

4 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden (Patienten, Material, Untersuchungsmethoden) Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen Summary Background and aims Methods (patients, material, methods of examination) Results and observations Practical conclusion Einleitung Materialien und Methoden Inklusionskriterien zur Studienteilnahme Puffer und Medien Protein-Extraktion aus Birkenpollen Gel-Herstellung SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) Blotten der Gele auf Nitrocellulose IgE-Immunoblot mit Patientenserum Lymphoprep -Gradient aus Heparin-Vollblut PBMC-FACS CD4-Negativ-Selektions-MACS CD25-Positiv-Selektions-MACS CD4 + CD25 +/- FACS Züchtung dendritischer Zellen Proliferations-Assay Auswertung der Proliferations-Assays mit 3 H-Thymidin Zytokin-ELISA der Überstände und der Serumproben TGF-β-ELISA...39

5 4.18. Bestimmung von Allergen-spezifischen IgE-, IgG- und IgG 4 - Werten gegen Birkenpollenallergene (Gesamtextrakt) und rekombinante Birkenpollenallergene (rbet v 1, rbet v 2, rbet v 4) im Serum im Verlauf der SIT Ergebnisse Charakterisierung der Patienten Ergebnisse der PBMC-FACS-Auswertung Ergebnisse der Proliferations-Assays mit unspezifischer Stimulation (anti-cd3/cd28-antikörper) Ergebnisse der Proliferations-Assays mit spezifischer Stimulation (reife dendritische Zellen unbeladen und mit rbet v 1 beladen) Ergebnisse der Zytokin-Bestimmungen aus dem Serum und aus den Überständen der Zellkulturansätze Ergebnisse der Allergen-spezifischen IgE-, IgG- und IgG 4 - Bestimmungen gegen Birkenpollenallergene (Gesamtextrakt) und rekombinante Birkenpollenallergene (rbet v 1, rbet v 2, rbet v 4) im Serum im Verlauf der SIT Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Ethikkommission Danksagung Lebenslauf...143

6 1 1. Zusammenfassung 1.1. Hintergrund und Ziele Ziel der vorliegenden Arbeit war, Methoden und Versuchsansatz zur ex vivo Untersuchung der Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen bei der Induktion Allergen-spezifischer Toleranz durch spezifische Immuntherapie (SIT) zu etablieren. Es handelte sich um eine experimentelle Studie, bei der der klinische Verlauf der SIT ex vivo bei Birkenpollenallergikern verfolgt wurde Methoden (Patienten, Material, Untersuchungsmethoden) Als Impfstoff wurden tyrosin-adsorbierte, chemisch modifizierte Allergenextrakte der Birke verwendet, wobei als Adjuvans MPL, Monophosphoryl Lipid A, ein detoxifiziertes Lipid aus dem Endotoxin von Salmonella minnesota eingesetzt wird. Das komponentenspezifische Sensibilisierungprofil eines jeden Patienten wurde im IgE-Immunoblot auf aufgetrennten natürlichen Pollenextrakten bestimmt. Zu definierten Zeitpunkten während der SIT wurden den Patienten Blutproben entnommen, um PBMC zu isolieren und mittels MACS weiter aufzutrennen. Aus diesen Proben wurde das Allergen-spezifische (Stimulation durch rbet v 1 beladenen dendritischen Zellen) und unspezifische (Stimulation durch anti-cd3/cd28-antikörper) proliferative Potential von CD4 + bulk T-Zellen, CD4 + CD25 + und CD4 + CD25 - T-Zellen, sowie das inhibitorische Potential von CD4 + CD25 + T-Zellen und die Zytokinsekretionsmuster der Subsets der CD4 + bulk T-Zellen, CD4 + CD25 + und CD4 + CD25 - T-Zellen analysiert. Der Anteil der CD4 + CD25 + T-Zellen an den PBMC wurde mittels FACS-Analysen bestimmt. Das Allergen-spezifische Immunglobulin-Muster (IgE, IgG und IgG 4 ) gegen natürlichen Birkenpollenextrakt und rekombinante Einzelallergene der Birke (rbet v 1, rbet v 2, rbet v 4) wurde bestimmt Ergebnisse und Beobachtungen Es konnte gezeigt werden, dass die Zellpopulationen CD4 + bulk, CD4 + CD25 +, CD4 + CD25 - T-Zellen eine stärkere Proliferation bei Antigen-spezifischer Stimulation mit rbet v 1-beladenen reifen dendritischen Zellen (mature dendritic cells, mdc) zeigen im Vergleich zu unbeladenen reifen dendritischen Zellen. Dies

7 2 kann als Antigen-spezifischer Effekt von rbet v 1 auf die Populationen CD4 + bulk, CD4 + CD25 +, CD4 + CD25 - T-Zellen und deren Proliferationsfähigkeit interpretiert werden. Es konnte ebenso aufgezeigt werden, dass bei der Stimulation mittels reifer dendritischer Zellen (unbeladen oder mit rbet v 1 beladen) die Population der CD4 + CD25 - T-Zellen durchweg deutlich stärker proliferiert als die CD4 + T-Zellen, die den natürlichen Anteil CD4 + CD25 + T-Zellen besitzen. Diese reduzierte Proliferationsrate der CD4 + Zellen bestätigt die Fähigkeit der CD4 + CD25 + Zellen zur Proliferationsinhibition, die selbst kaum proliferieren, was sie ebenfalls als regulatorische CD4 + CD25 + T-Zellen charakterisiert. Des Weiteren kam es zu einem Anstieg des Anteils der CD4 + CD25 + T-Zellen an den Gesamt-PBMC im Verlauf der SIT, wobei dies nur bei den Patienten auftrat, die ausschließlich auf das Hauptallergen der Birke Bet v 1 sensibilisiert waren ( Mono-Sensibilisierte ), nicht bei den Patienten, die zusätzlich auf weitere Minorallergene der Birke sensibilisiert waren ( Poly-Sensibilisierte ). Die Fähigkeit der CD4 + CD25 + T-Zellen zur Proliferationsinhibition der CD4 + CD25 - T-Zellen zeigte sich in den Ansätzen mit unspezifischer Stimulation im Verlauf der SIT bei beiden Patientengruppen konstant. Darüber hinaus zeigte sich, wie in der Literatur vorbeschrieben, ein kurzfristiger Anstieg der IL-10-Werte in den unspezifisch stimulierten Regulationsansätzen aus gleichen Teilen CD4 + CD25 - und CD4 + CD25 + T-Zellen im Verlauf der SIT bei den Mono-Sensibilisierten. Neusensibilisierungen (de novo Allergen-spezifische IgE-Antikörper) auf im Gesamtextrakt enthaltene Allergene, auf die ein Individuum vor Behandlung nicht allergisch war, traten unter SIT nicht auf Praktische Schlussfolgerungen Die Ergebnisse bezüglich des Anstiegs, der Eigenschaften und der Effekte der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen deuten auf deren zentrale Bedeutung bei der Entwicklung und der Behandlung allergischer Krankheiten hin, die in Anschlussuntersuchungen weiter verfolgt werden sollen. Da derzeit in kommerziell erhältlichen Impfstoffen lediglich die Konzentration von Hauptallergenen, bei Birke Bet v 1, standardisiert ist, lässt dies erwarten, dass Patienten, deren individuelles Sensibilisierungsprofil ausschließlich das/die in der Allergie-Vakzine standardisiert vorliegende(n) Allergen(e) umfasst, in höherem Maße von der SIT profitieren. Zukünftige Allergievakzine, die auf rekombinanten Allergenen basieren, bieten die Möglichkeit, standardisiert auch Minorallergene zur peripheren Toleranzentwicklung in Vakzinen einzusetzen.

8 3 2. Summary 2.1. Background and aims Aim of this paper was to establish ex vivo methods to examine the role of CD4 + CD25 + regulatory T cells in induction of allergen-specific tolerance by immunotherapy. This was an experimental study following the clinical course during immunotherapy ex vivo in birch pollen allergic patients Methods (patients, material, methods of examination) Tyrosine-adsorbed, chemically modified allergen extracts of birch pollen were used as vaccines. MPL, Monophosphoryl Lipid A, a detoxified lipopolysaccharide produced from the endotoxin of Salmonella minnesota was used as an adjuvant. The component-specific profile of senzitization of each patient was determined by IgE-immunoblot on blotted natural pollen extracts. At defined points in time during immunotherapy blood was taken to isolate PBMC and sort by MACS. From these specimens the allergen-specific (stimulation with rbet v 1 loaded dendritic cells) and nonspecific (stimulation with anti-cd3/cd28- antibody) proliferative potential of CD4 + bulk T cells, CD4 + CD25 +, and CD4 + CD25 - T cells, as well as the inhibitory potential of CD4 + CD25 + T cells and the released cytokine pattern of the subsets of CD4 + bulk T cells, CD4 + CD25 +, and CD4 + CD25 - T cells were analysed. The fraction of CD4 + CD25 + T cells in PBMC was obtained by FACS. Serum was examined for allergen-specific IgE, IgG und IgG 4 against the allergens contained in natural birch pollen extract and recombinant single allergens of birch (rbet v 1, rbet v 2, rbet v 4) during immunotherapy Results and observations CD4 + bulk, CD4 + CD25 +, and CD4 + CD25 - T cells were more proliferative during antigen-specific stimulation with rbet v 1-loaded mature dendritic cells (mdc) than during antigen-nonspecific stimulation with unloaded mdc. This indicates an antigen-specific effect of Bet v 1 on CD4 + bulk, CD4 + CD25 +, and CD4 + CD25 - T cells and their ability to proliferate. By stimulation with mdc

9 4 (unloaded or loaded with rbet v 1) the CD4 + CD25 - T cells proliferated stronger than the CD4 + bulk T cells still owning the natural fraction of CD4 + CD25 + T cells. The finding of reduced proliferation of CD4 + bulk T cells supports the ability of CD4 + CD25 + T cells to inhibit proliferation. The low proliferative activity of CD4 + CD25 - T cells characterizes them as regulatory T cells. The fraction of CD4 + CD25 + T cells in PBMC increased during immunotherapy occurring only in patients mono-sensitized against Bet v 1 (major allergen of birch) and not in patients also sensitized against minor allergens of birch (poly-sensitized). The ability of CD4 + CD25 + T cells to inhibit proliferation of CD4 + CD25 - T cells was shown to be constant in nonspecifically stimulated approaches during immunotherapy in mono- and poly-sensitized patients. A short-term increase of IL-10 was seen in nonspecifically stimulated approaches of coculturing CD4 + CD25 - and CD4 + CD25 + T cells (1:1) during immunotherapy in mono-sensitized patients. De novo sensitization (allergen-specific IgE) against allergens in natural birch pollen extract which had not been recognized by the respective individual at the beginning of the treatment were not observed during SIT Practical conclusion The results on increase, characteristics and effect of CD4 + CD25 + regulatory T cells emphasize their pivotal meaning in development and treatment of allergic diseases which must be further studied. In commercially available vaccines so far only the concentration of major allergens is standardized. In consequence, patients who are exclusively sensitized against major allergens may have a greater benefit from immunotherapy. Future allergen vaccines based on recombinant allergens will allow the use of standardized minor allergens of clinical relevance in allergen vaccines to induce peripheral tolerance.

10 5 3. Einleitung Allergien vom Typ I nach Coombs und Gell (1963) haben in den letzten Jahrzehnten v.a. in Ländern mit so genanntem westlichem Lebensstil deutlich zugenommen [von Mutius et al. 1992]. Sie basieren nach heutigem Verständnis zumindest teilweise auf einer Störung des immunologischen Gleichgewichts. Typ I-allergische Patienten überreagieren auf an sich harmlose Proteine, die eigentlich vom Immunsystem toleriert werden könnten, da sie keine Bedrohung für den Organismus darstellen [Casolaro et al. 1996, Kay 1997]. In der Effektorphase bei klinisch manifesten Allergien vom Soforttyp dringt ein Allergen in den Körper ein und bindet an membranständiges Allergen-spezifisches IgE, das an den hoch-affinen IgE-Rezeptor von Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden ist. Auf eine Querverbindung der hoch-affinen IgE-Rezeptoren infolge der Bindung an das Allergen hin sezernieren diese Zellen inflammatorische Mediatoren (Histamin, Leukotriene, Prostaglandine), was eine klinisch manifeste allergische Sofortreaktion zur Folge hat [van Neerven 1999b, Segal et al. 1977]. Die spezifische Immuntherapie (SIT) ist die einzige kausal wirksame Therapie bei Typ I-allergischen Erkrankungen. Sie wurde 1911 erstmalig von Freeman und Noon vorgestellt, wobei diese damals von einer Giftwirkung der verwendeten Präparate ausgegangen waren [Freeman et al. 1911]. Durch repetitive Applikation eines Allergens in zumeist ansteigender Dosierung wird eine Allergenspezifische Toleranz mit Reduktion der allergischen Symptome (z.b. Rhinokonjunktivitis allergica, Asthma bronchiale allergicum, orales Allergiesyndrom, anaphylaktischer Schock) erzielt. In vielen doppel-blind placebo-kontrollierten Studien konnte die klinische Wirksamkeit gezeigt werden [Bohle 2008, Akdis M et al. 2007, Kleine-Tebbe et al. 2006, Bousquet et al. 1998, Ortolani et al. 1984, Reid et al. 1986, Frankland et al. 1954, McAllen 1969]. Auch die World Health Organisation (WHO) weist auf den Nutzen der Immuntherapie gegen allergische Erkrankungen bei ausgewählten Patienten hin, die spezifische IgE- Antikörper gegen klinisch relevante Allergene aufweisen [Keine Autoren aufgeführt: Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases (Kongress in Genf, Januar 1997)]. Nach Empfehlungen der Deutschen

11 6 Gesellschaft Allergologie und klinische Immunologie bestehen folgende Indikationen zur Hyposensibilisierung (SIT) mit Allergenen [Kleine-Tebbe et al. 2006]: Nachweis einer IgE-vermittelten Sensibilisierung (mit Hauttest oder Invitro-Diagnostik) und eindeutiger Zusammenhang mit klinischer Symptomatik (ggf. Provokationstestung) Verfügbarkeit von standardisierten bzw. qualitativ hochwertigen Allergenextrakten Wirksamkeitsnachweis der geplanten SIT für die jeweilige Indikation Allergenkarenz nicht oder schwer möglich Des Weiteren bestehen folgende Kontraindikationen: Persistierendes bzw. unzureichend behandeltes Asthma und/oder irreversible Atemwegsobstruktion, d.h. FEV1 trotz adäquater Pharmakotherapie unter 70% Sollwert (außer bei Insektengiftallergie) Kardiovaskuläre Erkrankung mit erhöhtem Risiko von Nebenwirkungen nach Adrenalingabe (außer bei Insektengiftallergie) Behandlung mit Beta-Blockern (lokal, systemisch) und/oder ACE- Hemmern (bei Insektengiftallergie) Schwere Erkrankung des Immunsystems (Autoimmunerkrankungen, Immundefizienzen) Maligne Tumorerkrankungen mit aktuellem Krankheitswert Unzureichende Compliance Schwangerschaft (relative Kontraindikation) Neben der Besserung der Symptomatik der vorliegenden allergischen Erkrankung wird mit der Allergie-Vakzinierung auch das Ziel verfolgt, einer Verschlimmerung der Erkrankung vorzubeugen. Hierbei soll beispielsweise der so genannte Etagenwechsel verhindert werden, bei dem sich die allergische Erkrankung der oberen Atemwege in Form von Rhinokonjunktivitis allergica in die tiefere Etage der tieferen Atemwege in Form von Asthma bronchiale allergicum ausweitet und unabhängig von der Allergenexposition chronifiziert. Auch gibt es Studien dazu, dass durch die Behandlung einer allergischen Erkrankung der Neusensibilisierung auf weitere Allergene vorgebeugt werden kann [Bohle 2008, Akdis M et al. 2007, Kleine-Tebbe et al. 2006, Des Roches et al. 1997], wodurch ein so genannter allergischer Flächenbrand verhindert wird.

12 7 Trotz Jahrzehnte langer Anwendung bei Typ I-allergischen Patienten sind die zugrunde liegenden Wirkmechanismen der SIT nicht vollständig aufgeklärt. Die Aufklärungsbedingungen sind erschwert durch die bisher verabreichten auf Extrakten der natürlichen Allergenquellen basierenden, relativ schlecht definierten Allergengemische, die ausschließlich die Allergenquelle und den Anteil an Hauptallergen(en), nicht aber den Gehalt an Minorallergenen und das Sensibilisierungsprofil der Patienten gegen die einzelnen allergenen Komponenten einer Allergenquelle berücksichtigt [Valenta et al. 1999], wodurch ein Monitoring der kausalen Mechanismen nur bedingt umgesetzt werden kann. Unter der SIT mit subcutaner Injektion oben genannter Allergengemische beschreiben unterschiedliche Arbeitsgruppen teilweise gegensätzliche immunologische Veränderungen. Neben einer Verringerung der Eosinophilen-Zahl während der Pollenflugsaison [Rak et al. 1991, Till et al. 1997] wurden eine reduzierte Mastzellen- und Eosinophilen-Migration beobachtet [Otsuka et al. 1991, Furin et al. 1991, Durham et al. 1996]. Diese Studien zeigen, dass die Anwesenheit der Zellen, die die verzögerte allergische Reaktion bewirken, im Zielgewebe nach einer SIT verringert ist, was die abgemilderten verzögerten Reaktionen bei behandelten Patienten erklären könnte. Des Weiteren kam es zu einer reduzierten Mediatorfreisetzung [Creticos et al. 1985] bei Allergen-Provokation und einer vermehrten Anzahl IgE-modulierender CD8 + Suppressor-T-Zellen im peripheren Blut von Patienten unter einer SIT [Rocklin et al. 1980, Tamir et al. 1987]. Eine erniedrigte IL 4-Produktion Allergen-spezifischer CD4 + T-Zellen konnte bei unveränderter IFN-γ 1 - und IL-2- Produktion [Secrist et al. 1993, Ebner et al. 1997, Ebner 1999] bzw. bei zeitgleich ansteigender IFN-γ-Produktion [Jutel et al. 1995] beobachtet werden, wobei parallel dazu in vitro die Allergen-spezifische T-Zell-Proliferation abnahm [Ebner et al. 1997, Jutel et al. 1995]. Allergen-Stimulation von Lymphozyten- Kulturen aus dem peripheren Blut SIT-behandelter Bienengift-Allergiker führte zu einer reduzierten Produktion aller Th-Zytokine (IL-4, IL-5, IL-13 und IFN-γ) mit Ausnahme von IL-10 [Akdis CA et al. 1998, Bellinghausen et al. 1997]. Wei- 1 IFN-γ induziert Zellen vom Th1-Typ, antagonisiert IL-4 [van Neerven 1999b], unterdrückt IgE, bewirkt die Produktion von IgG 4 -Antikörpern durch B-Gedächtniszellen [Jutel 2003]

13 8 terhin ist die IL und IL Produktion Antigen-präsentierender Zellen erhöht [Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004, Durham et al. 1998, Ebner 1999]. Die Effekte der SIT auf die Zytokinkonstellation lassen sich mit dem Ausdruck des Th2/Th1-Shifts zusammenfassend beschreiben. Hierbei kommt es im Verlauf der Allergenexposition zu einer Verschiebung vom Zytokinsekretionsmuster der Allergen-spezifischen Zellen weg vom Th2-Typ, die große Mengen an IL-4 (IgE-heavy-chain-switching in B-Zellen mit nachfolgender Produktion von Antikörpern) und IL-5 (selektive Differenzierung, Lebensverlängerung und Aktivierung von Eosinophilen [Lopez et al. 1988]) produzieren, hin zu einer Immunantwort vom Th1-Typ, wobei vor allem große Mengen an IFN-γ produziert werden. (Zellen vom Th1-Typ führen auch zu zellvermittelter Immunität, indem sie Makrophagen oder CD8 + zytotoxische Lymphozyten aktivieren [Sakaguchi 2000].) Diese Beobachtungen wurden sowohl unter konventioneller Pollen- Immuntherapie über mehrere Monate hinweg [Durham et al. 1998, Secrist et al. 1993, Varney et al. 1993, Durham et al. 1996, Iliopoulos et al. 1991, van Neerven 1999b, Till et al. 1997] als auch unter schnellen und ultra-schnellen Regimen [Jutel et al. 1995, McHugh SM et al. 1995, Akdis CA et al. 1998] gemacht. IgG 4 -Antikörper werden induziert, die die Rezeptor (CD23 und Fcε-RI)- gebundene Serum-IgE-vermittelte Allergen-Präsentation Antigen-präsentierender Zellen (APC) um Faktor > 100 reduzieren und damit die Aktivierung von CD4 + T-Zellen inhibieren [van Neerven et al. 1999a]. Zu Beginn wird im Rahmen der SIT die Produktion von IL-12 und IL-10 durch Antigen-präsentierende Zellen induziert. Hierdurch kommt es zum vermehrten Auftreten von CD4 + T- Zellen, die ein Th0-Zytokin-Milieu produzieren. Diese Konstellation induziert die Produktion von allen Subklassen von Allergen-spezifischem IgG inklusive IgG 4. Wenn diese Antikörper eine relevante Konzentration erreichen, konkurrieren sie mit IgE darum, Allergene zu binden. Hierdurch wird eine IgE-vermittelte Allergen-Präsentation an CD4 + T-Zellen bei niedrigen Allergen-Konzentrationen verhindert bzw. beeinträchtigt. Es resultiert eine höhere Allergen-Schwelle zur T- Zell-Aktivierung bei unveränderten Konzentrationen an Allergen-spezifischem 2 IL-10 wirkt immunsuppressiv, senkt die IgE- und erhöht die IgG 4 -Produktion in B-Zellen [Akdis CA 1998, Jeannin 1998, Jutel 2003] 3 IL-12 induziert Zellen vom Th1-Typ [van Neerven 1999b]

14 9 IgE im Serum der Patienten, die sich einer SIT unterziehen [van Neerven et al. 1999a]. Man spricht in diesem Zusammenhang von der blocking-antibody -Theorie [Witteman et al. 1996, Golden et al. 1982]. Allerdings stellte es sich als schwierig heraus, die durch die SIT hervorgerufenen Besserungen des klinischen Befundes mit den beobachteten Veränderungen (Abfall des spezifischen IgE nach anfänglichem Anstieg und vermehrte Synthese von spezifischen IgG und IgG 4 ) zeitlich in Einklang zu bringen [Durham et al. 1998, Reid et al. 1986, Lichtenstein et al. 1973, Djurup et al. 1984, Bousquet et al. 1988], zumal sich diese Beobachtungen nicht durchgehend bei allen hyposensibilisierten Patienten einstellen [Heiss et al. 1999]. Inwieweit die unterschiedlichen Mechanismen für unterschiedliche Allergenquellen von Relevanz sind, ist nicht bekannt [Ebner et al. 1997]. Im Thymus exprimieren unreife T-Zellen eine immense Zahl an T-Zell-Antigen- Rezeptoren (TCR), die durch die zufällige Neuanordnung der Gensegmente erreicht wird, die für die α- und die β-kette kodieren. Aber nur jene T-Zellen, die T-Zell-Rezeptoren exprimieren, die den major histocompatibility complex (MHC) mit assoziierten körpereigenen Peptiden mit mäßiger Affinität erkennen, werden vor dem programmierten Zelltod bewahrt, wobei sowohl die T-Zellen, die eine hohe Affinität aufweisen, als auch die mit niedriger Affinität in verschiedenen Entwicklungsschritten eliminiert werden. Diese positive Selektion innerhalb des Thymus stellt das erste Standbein dar, mit dem das Immunsystem autoreaktive Zellen unter Kontrolle hält. Als zweites Standbein ist die negative Selektion im Thymus zu nennen, bei der T-Zellen, deren T-Zell-Rezeptor entweder nicht in der Lage ist, den Komplex aus MHC und körpereigenen Peptiden zu binden, oder diesen zu stark bindet, ebenfalls nicht vor dem programmierten Zelltod bewahrt werden. Es scheint nun aber, dass die negative Selektion im Thymus allein die autoreaktiven T-Zellen nicht ausreichend zu kontrollieren und dadurch Autoimmunerkrankungen vorzubeugen vermag, weshalb autoreaktive T-Zellen, die der negativen Selektion auf irgendeine Weise entkommen sind, weiteren Kontrollen in der Peripherie unterworfen sind, was das dritte Standbein darstellt. Nach der Begegnung mit körpereigenen Antigenen in der Peripherie können die autoreaktiven T-Zellen in einen anergen Zustand versetzt werden, was bedeutet, dass sie funktionell inaktiv sind, ohne dass es zum programmierten Zelltod kommt. Neben diesen drei eher passiven Mechanismen existiert zusätzlich

15 10 noch ein vierter, eher dominanter Kontrollmechanismus: bestimmte T-Zellen sind in der Lage, die Aktivierung und die Proliferation von autoreaktiven T-Zellen aktiv zu unterdrücken [Sakaguchi 2001, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009, Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009]. Diese Vorstellung von einer natürlich vorkommenden T-Zell-Fraktion, die durch ihre supprimierenden Fähigkeiten das Auftreten von autoimmunen Vorgängen, also Vorgängen, die gegen den eigenen Körper gerichtet sind, verhindert beziehungsweise stark limitiert, wurde erstmalig 1975 veröffentlicht [Gershon 1975]. Aufgrund von initialen Ungereimtheiten und Widersprüchen in der anfänglichen Forschung in diesem Gebiet wurde ihre Existenz aber lange Zeit noch weiterhin in Frage gestellt. Dass diese regulatorischen Zellen eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase des Organismus spielen, konnte im Mausmodell vor einiger Zeit überzeugend demonstriert werden. Sie sind in der Lage, aktiv und dominant die Aktivierung und Effektorfunktion anderer T-Zellen zu unterdrücken. Sie stellen einen Teil der peripheren T-Zellen dar, wobei ihre Zahl in der Peripherie im Erwachsenenalter relativ stabil bleibt [Suri-Payer et al. 1999]. Die Existenz der Zellen wird durch kontinuierliche Stimulation über ihr spezifisches (Auto)antigen in der Peripherie aufrechterhalten [Kuniyasu et al. 2000]. Der Beweis dafür, dass die Erhaltung der regulatorischen T-Zellen durch die Gegenwart der Zielorgane gesteuert wird, die sie regulieren, resultiert aus Untersuchungen, in denen periphere CD4 + T-Zellen, die von athyreoiden Ratten stammen, die Entwicklung von Thyreoiditis in TxX-Ratten, die die Zellen erhalten haben, nicht verhindern können, obwohl die Zellen noch in der Lage waren, die Entwicklung von Diabetes zu verhindern [Seddon et al. 1999a]. Der Begriff der regulatorischen T-Zellen stellt hierbei nur eine Art Überbegriff dar, da es einen spezifischen Marker für diese Zellen in ihrer Gesamtheit nicht gibt. Vielmehr existieren einige bereits mehr oder weniger gut beschriebene Untergruppen dieser heterogenen Population der regulatorischen T-Zellen, die sich durch spezifische Merkmale charakterisieren lassen [Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009, Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009, Shevach 2001] (siehe auch Tabelle 1 [modifiziert aus Taylor A et al. 2004]).

16 11 T Reg cells CD4 + CD25 + nt Reg (naturally occuring) (zellkontaktabhängig) CD4 + CD25 + at Reg (adaptive) (zellkontaktabhängig) Tr1 Th3 CD8 + CD25 + CD28 - T Reg Qa-1-dependent CD8 + CD4 - CD8 - T Reg TCR γδ T Reg NKT cells Suppressor mechanism TGF-β, CTLA-4, PD-1, GITR TGF-β, CTLA-4, PD-1, GITR (IL-10) IL-10, TGF-β TGF-β IL-10, TGF-β, CTLA-4, PD-1, GITR Qa-1-specific TCR Induction of apoptosis IL-10, TGF-β IL-10, IFN-γ Tabelle 1: Regulatorische T-Zellen Zu nennen sind hier einerseits die induzierten (sekundären) regulatorischen T-Zellen, nämlich Th3-Zellen und die regulatorischen T-Zellen Typ 1 (= Tr1-Zellen), die beide ihre Fähigkeit zur Suppression nicht kontaktabhängig, sondern über die Sekretion löslicher Zytokine vermitteln, wobei die Tr1-Zellen v.a. IL-10 und die Th3-Zellen v.a. TGF-β 4 produzieren [Jonuleit et al. 2003, Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009, Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004]. Bemerkenswerterweise spielen IL-10 und TGF-β ihrerseits offensichtlich im Zusammenspiel mit weiteren Zytokinen wie IFN-α und IL-4 eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung und Expansion der Th3- und Tr1-Zellen. Die immunsuppressiven Eigenschaften von IL-10 und TGF-β können höchstwahrscheinlich durch ihre Fähigkeit erklärt werden, die Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen zu inhibieren [Ding et al. 1992, Fiorentino et al. 1991, Takeuchi et al. 1998, Kitani et al. 2000, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009] und direkt anti-proliferative Effekte auf T-Zellen zu vermitteln [Letterio et al. 1998, 4 TGF-β (= transforming growth factor β) wirkt immunsuppressiv auf Th1- und Th2-Zellen, führt zur B-Zell-Aktivierung, ist switch factor zur IgA-Produktion, bewirkt Expansion und Überleben der differenzierten CD4 + CD25 + T-Zellen

17 12 Moore KW et al. 2001, Gorelik et al. 2000]. Es spricht vieles dafür, dass diese beiden Zelltypen lediglich einen veränderten Differenzierungszustand ihrer Vorläuferzellen und keine eigene Zelllinie darstellen, wobei als Vorläuferzellen naive natürlich vorkommende CD4 + CD25 - T-Zellen in der Peripherie gesehen werden [Jonuleit et al. 2003, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009]. Des Weiteren scheinen dendritische Zellen in ihrer Eigenschaft als professionelle Antigen-präsentierende Zellen die Differenzierung der naiven CD4 + T-Zellen zu diesen induzierten regulatorischen T-Zellen zu kontrollieren [Jonuleit et al. 2001b]. Inflammatorische Stimuli induzieren die Ausreifung dendritischer Zellen und stellen somit den Schlüsselprozess bei der Differenzierung von naiven CD4 + T-Zellen in Effektor-T-Zellen (Th1 oder Th2) dar. Im Gegensatz dazu scheinen unreife dendritische Zellen im steady state wesentlich tolerogener zu sein und die Entwicklung von regulatorischen T-Zellen zu begünstigen. Dies geschieht möglicherweise als Strategie, um die immunologische Toleranz aufrecht zu erhalten [Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009, Jonuleit et al. 2001b, Jonuleit et al. 2000]. Nach dem derzeitigen Wissensstand besteht somit folgender Zusammenhang zwischen dendritischen Zellen und regulatorischen Tr1- und Th3-Zellen: Aktivierte Tr1- und Th3-Zellen unterdrücken die T-Zell-stimulatorischen Eigenschaften der dendritischen Zellen und induzieren dadurch tolerogene dendritische Zellen, die dann die Differenzierung von naiven CD4 + T-Zellen in Tr1-Zellen fördern [Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009, Jonuleit et al. 2003]. Am besten charakterisiert sind allerdings andererseits die natürlich vorkommenden CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen (CD25 = α-kette des IL-2- Rezeptors), die im Gegensatz zu den oben erwähnten Zellen eine eigenständige Untergruppe darstellen und sich aus Vorläuferzellen der CD4 + T-Zellen direkt entwickeln [Jonuleit et al. 2003, Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009, Akdis M et al. 2007]. Eine direkte in vivo Relevanz wurde nachgewiesen, weil die Depletion der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen im Tiermodell spontane Autoimmunität (z.b. Thyreoiditis, Gastritis und insulin-abhängiger Diabetes), sowie verstärkt Reaktivität gegen Tumoren und Alloantigene bewirkt. Eine Rekonstitution der entfernten Zellpopulation führte wiederum zu einem Schutz vor der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen [Sakaguchi 2000, Jutel et al. 2003, Suri-Payer et al. 1998].

18 13 Beim Menschen konnten kürzlich CD4 + CD25 + T-Zellen nachgewiesen werden, die analog zu murinen Ergebnissen eine immunregulatorische bzw. suppressive Rolle spielen und nicht, wie zuvor angenommen, konventionelle Gedächtniszellen darstellen [Shevach 2001, Taylor PA et al. 2001, Dieckmann et al. 2001, Jonuleit et al. 2001a, Stephens et al. 2001]. Sie stellen durchschnittlich etwa 6 % der CD4 + T-Zell-Population bei gesunden Erwachsenen [Dieckmann et al. 2001]. Sie zeigen einen anergen Phänotyp, d.h. durch Stimulation über ihren T-Zellrezeptor können sie in vitro nur in sehr geringem Ausmaß zur Proliferation gebracht werden, wobei es keine Rolle spielt, ob diese Stimulation durch plattengebundenes Anti-CD3-Antikörper in Kombination mit frei im Medium gelösten Anti-CD28-Antikörper oder durch reife dendritische Zellen hervorgerufen werden sollte; letztere stellen die potentesten natürlich vorkommenden immunstimulatorischen Zellen dar [Dieckmann et al. 2001]. Durch IL-2, IL-4 und IL-15 (allein oder auch in Kombination) kann dieser anerge Zustand (teilweise) wieder aufgehoben werden [Shevach 2001, Dieckmann et al. 2001, Jonuleit et al. 2001a, Thornton et al. 1998]. Durch die Zugabe von neutralisierenden monoklonalen Anti-IL-10-Antikörpern konnte keine Proliferation der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen hervorgerufen werden, was den Schluss zulässt, dass es nicht das IL-10 ist, das auf einem autokrinen Weg den anergen Zustand der CD4 + CD25 + T-Zellen bewirkt [Dieckmann et al. 2001, Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004]. Sie entstammen dem Thymus, wo sie sich sehr wahrscheinlich vergleichbar mit konventionellen CD4 + T-Zellen entwickelt haben. Ausschließlich nach Aktivierung über ihren eigenen T-Zell-Rezeptor sind sie dazu in der Lage, Proliferation von CD4 + und CD8 + T-Zellen zu unterdrücken [Shevach 2002] und tun dies in vitro durch einen dosis- und zellkontaktabhängigen, jedoch APC- und zytokinunabhängigen Mechanismus [Shevach 2001, Dieckmann et al. 2001, Jonuleit et al. 2001a], wobei es wahrscheinlich ist, dass sich die immunsuppressiven Eigenschaften der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen in vivo komplexer darstellen und auf mehreren Mechanismen basieren [Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009, Wing et al. 2006, Akdis CA et al. 2009, Asseman et al. 1999, McHugh RS et al. 2001]. Um aktiviert zu werden und diese Suppressorfunktion auszuüben, reicht ihnen eine wesentlich geringere Antigenkonzentration aus als die, die nötig ist, um naive T-Zellen zu aktivieren. Sind die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen einmal aktiviert, üben sie ihre Suppressorfunktion gänzlich antigen-unspezifisch aus, das heißt, die Sup-

19 14 pression ist unabhängig von der Antigen-Spezifität der zu unterdrückenden T-Zell-Population [Shevach 2000, Thornton et al. 1998], in der es letztlich als Ergebnis der erlittenen Suppression zur Inhibition der IL-2-Transkription kommt [Thornton et al. 1998]. Sie bedürfen, um im aktivierten Zustand zu bleiben, keiner wiederholten Aktivierung über ihren T-Zell-Rezeptor, der sich durch eine mittelmäßig starke Affinität gegenüber körpereigenen Peptiden auszeichnet [Shevach 2001]. Allerdings benötigen die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen einen stetigen Stimulus, um nicht abzusterben und somit ein steady state aufrecht zu erhalten [Akdis CA et al. 1998, Akdis CA et al. 2009]. Die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen produzieren hauptsächlich IL-10 und wenig IL-2, IL-4 und INF-γ [Shevach 2001, Asseman et al. 1999, Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004]. Durch in vitro Versuche, bei denen die Zytokinaktivität neutralisiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Suppression der induzierten regulatorischen T-Zellen im Verlauf der spezifischen Immuntherapie durch IL-10 und TGF-β vermittelt wird. Zusätzlich kam es aber auch zu einer antigen-spezifischen Suppressoraktivität der CD4 + CD25 + T-Zellen der Allergiker [Jutel et al. 2003, Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004]. Es konnte bis jetzt nicht gezeigt werden, dass IL-4, IL-10 oder TGF-β tatsächlich von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen in vivo produziert werden, womit schwer zu sagen ist, ob diese Zytokine wirklich für die supprimierenden Effekte der regulatorischen T-Zellen verantwortlich sind oder ob sie eine Rolle bei der Differenzierung der regulatorischen T-Zellen spielen [Shevach 2001]. Der genaue Mechanismus der Suppressorwirkung durch die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen ist bislang noch nicht vollständig aufgeklärt, wobei aber Einigkeit darüber besteht, dass die Antigen- Erkennung durch die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen die Expression eines zellmembrangebundenen Moleküls induziert, das an Rezeptoren auf den Zielzellen binden kann und eine Unterbrechung des Zellzyklus induziert [Shevach 2001]. Einige in vivo Studien legen nahe, dass die Funktion der CD4 + CD25 + T-Zellen in entscheidendem Maße, aber nicht ausschließlich von einer Signalvermittlung über das CD152-/CTLA (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen)-4-molekül abhängt, das nur auf CD4 + CD25 + T-Zellen konstitutiv exprimiert wird [Read et al. 2000, Salomon et al. 2000, Takahashi et al. 2000, Shevach 2001] und ein co-stimulatorisch wirkendes Molekül bei der T-Zellaktivierung darstellt, wobei intrazellulär eine noch höhere Konzentration dieses Moleküls

20 15 erreicht wird als auf der Zelloberfläche. Es wird inzwischen angenommen, dass eine Bindung von Liganden an CTLA-4 zu einer Down-Regulation der T-Zell- Aktivität führt, wobei aber auch einige spezielle T-Zell-Funktionen möglicherweise aktiviert werden. In diesem Punkt widersprechen sich die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen [Shevach 2001, Takahashi et al. 2000, Chai et al. 2002]. T-Zellen, die über diesen CTLA-4-Rezeptor stimuliert wurden, produzieren vornehmlich TGF-β [Chen et al. 1998, Salomon et al. 2000]. Diese Erkenntnis legt nahe, dass CD4 + regulatorische T-Zellen, die über CTLA-4 aktiviert wurden, andere T-Zellen supprimieren könnten, indem sie TGF-β sezernieren [Sakaguchi 2000] bzw. auf ihrer Zelloberfläche membrangebunden exprimieren [Nakamura et al. 2001]. Dass TGF-β vor der Entwicklung von Autoimmunkrankheiten schützt, hat sich in murinen Experimenten gezeigt, bei denen TGF-β-defiziente oder TGF-β-Rezeptor-inaktivierte Mäuse verschiedene Autoimmunerkrankungen entwickelten [Gorelik et al. 2000]. Diese Erkenntnisse legen die Möglichkeit nahe, dass CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen im Rahmen der natürlichen T-Zell-vermittelten Selbsttoleranz ihre Suppressoraktivität möglicherweise auch dadurch vermitteln, indem sie IL-4, IL-10 oder TGF-β sezernieren. Denn in der Tat hat die Verabreichung von neutralisierenden Antikörpern gegen IL-4 oder TGF-β zur Folge, dass in vivo die autoimmun-präventive und toleranz-induzierende Aktivität der regulatorischen T-Zellen in einigen Untersuchungen aufgehoben werden konnte [Seddon et al. 1999b, Zhai et al. 1999]. Eine andere Arbeit weist auf ein Zusammenwirken von IL-10 und TGF-β bei der Unterdrückung der Immunantwort hin, wobei diese Antigen-spezifische Suppressoraktivität, die sich nach der spezifischen Immuntherapie eingestellt hatte, auf die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen begrenzt war. Hierbei kam es zu einem Anstieg von IgA und IgG 4 und einer Abnahme der T-Zell-Proliferation und der Th2-Zytokine [Jutel et al. 2003]. Es existieren einige weitere Marker (OX40, L-Selectin, GITR), die mehr oder weniger spezifisch für die Fraktion der CD4 + CD25 + immunoregulatorischen T-Zellen sind, deren unmittelbare Bedeutung für die supprimierende Funktion dieser Zellpopulation aber angezweifelt wird bzw. noch weitgehend unbekannt ist [Jonuleit et al. 2003]. Die neueste Art der Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen besteht auf molekularer Ebene, nämlich durch Nachweis der Expression des intrazellulären Transkriptionsfaktors Fox p 3 (forkhead box p 3). Er gehört zur so genannten forkhead family. Die Expression von Fox p 3 spielt bei der Entwicklung der re-

21 16 gulatorischen T-Zellen eine wichtige Rolle, indem Fox p 3 ein genetisches Programm kontrolliert, das zur spezifischen Entwicklung dieser Zellart führt. Die große Mehrheit der Fox p 3-exprimierenden regulatorischen T-Zellen findet sich in der Gruppe der CD4 + T-Zellen, die MHC II-Moleküle auf ihrer Oberfläche tragen und die zusätzlich auch CD25 exprimieren [Campbell et al. 2007, Bacchetta et al. 2007, Allan et al. 2007]. Vor der Identifizierung von Fox p 3 wurde wie bereits ausgeführt - die Expression der beiden Zelloberflächenmoleküle CD4 und CD25 verwendet, um diese Zellpopulation zu definieren, welche folglich als CD4 + CD25 + T-Zellen bezeichnet wurden. Allerdings ist der Gebrauch von CD25 zur Definition von regulatorischen T-Zellen problematisch, da CD25 auch von nicht-regulatorischen T-Zellen exprimiert wird, nämlich beispielsweise bei deren Aktivierung im Rahmen einer Immunantwort gegen Pathogene. Inzwischen ist allerdings auch für Fox p 3 bekannt, dass auch dieser Transkriptionsfaktor von via T-Zell-Rezeptor aktivierten T-Zellen exprimiert wird, obwohl es sich bei diesen um keine regulatorischen T-Zellen handelt. Deshalb ist auch dieser Marker nicht in der Lage, die von ihm markierten Zellen eindeutig als regulatorische T-Zellen zu charakterisieren. Allerdings erreichen die nachgewiesenen Konzentrationen von Fox p 3 in aktivierten T-Zellen nicht das Niveau der Konzentrationen in regulatorischen T-Zellen; auch ist in den aktivierten T-Zellen das Vorhandensein von Fox p 3 nicht von Dauer [Allan et al. 2007, Bacchetta et al. 2007, Campbell et al. 2007]. Nach wie vor ist es ein großes Ziel, Oberflächenmarker zu identifizieren, die spezifisch für regulatorische T-Zellen sind. CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen wurden auch als natürliche regulatorische T-Zellen bezeichnet (Entstehung im Thymus), um sie von weiteren regulatorischen T-Zellen unterscheiden zu können, die in der Peripherie im Lauf des Lebens erzeugt werden (sog. adaptive regulatorische T-Zellen). Tatsächlich ist die natürlich vorkommende CD4 + CD25 + regulatorische T-Zell-Generation eine Untergruppe aller Fox p 3-exprimierenden regulatorischen T-Zellen [Bluestone et al. 2003]. Genetische Mutationen im Fox p 3-Gen, die zu erblichen Krankheiten führten, konnten sowohl beim Menschen als auch bei der Maus identifiziert werden. Dies ist ein klarer Beweis dafür, dass die Fox p 3-exprimierenden regulatorischen T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Immunsystems spielen. Menschen mit Veränderungen im

22 17 Fox p 3-Gen leiden an einer ernsten und bald letal endenden Autoimmunstörung, die als Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy X-linked (IPEX) syndrome bezeichnet wird. Dieses Syndrom ist charakterisiert durch die Entwicklung von systemischen Autoimmunreaktionen innerhalb des ersten Lebensjahres, was zur Trias wässrige Diarrhoe, ekzematöse Dermatitis und Endokrinopathien (meistens Diabetes mellitus Typ I) führt. Häufig treten zusätzlich weitere Autoimmunphänomene wie z.b. Coombs-positive Anämie, Thrombozytopenie, Neutropenie und tubuläre Nephropathie auf. Die Mehrzahl der betroffenen männlichen Individuen stirbt innerhalb des ersten Lebensjahres entweder an metabolischen Störungen oder an Sepsis. Ähnliche Krankheitserscheinungen wurden bei sogenannten scurfy Mäusen beobachtet, die eine spontane Fox p 3-Mutation aufweisen [Shevach 2002, Sakaguchi et al. 2004, Campbell et al. 2007, Bacchetta et al. 2007, Allan et al. 2007]. Über einen oder mehrere der oben genannten Mechanismen haben CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen die Fähigkeit, in höchst effizienter Weise autoreaktive T-Zellen zu kontrollieren, wodurch die Selbsttoleranz aufrechterhalten werden kann. Verglichen mit autoreaktiven T-Zellen, die im gesunden Immunsystem vorkommen und normalerweise einen T-Zell-Rezeptor mit niedriger Affinität für körpereigene Antigene tragen, können regulatorische T-Zellen aufgrund ihrer höheren Affinität und der damit verbundenen rascheren Aktivierung und Migration schneller zum Ort des Geschehens geführt werden und dort leichter aktiviert werden, wodurch sie autoreaktive T-Zellen kontrollieren, die ebenfalls vor Ort gelangt sind. Sogar bei der Konfrontation mit Molekülen, die körpereigenen stark ähneln (Antigenmimikry), reagieren die regulatorischen T-Zellen sensitiver auf dieses Antigen und schneller als die autoreaktiven T-Zellen, die auch auf dieses Antigen ansprechen. Das ist vielleicht der Grund, warum Peptide, die körpereigene Strukturen/Moleküle imitieren, in der Lage sind, autoreaktive T-Zellen in vitro zu aktivieren, nicht aber in vivo Autoimmunerkrankungen auszulösen vermögen [Sakaguchi 2001, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2009]. In den bisherigen in vivo Studien wurde vor allem die Rolle der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen bei der Toleranzinduktion und Suppression von organ-spezifischer Autoimmunität untersucht [Taylor PA et al. 2001], wobei es augenscheinlich ist, dass in vivo die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen und die TGF-β- und IL-10-produzierenden Th3- und Tr1-Zellen nicht nur eng zusammenarbeiten, um autoimmunen Reaktionen im Körper vor-

23 18 zubeugen, sondern sogar direkt die gegenseitige Entwicklung induzieren [Jonuleit et al. 2003, Bluestone et al. 2003], indem sie beispielsweise im Mausmodell ihre suppressiven Eigenschaften auf konventionelle CD4 + T-Zellen übertragen konnten, mit denen sie sich in Kultur befanden [Jonuleit et al. 2003, Zelenika et al. 2001]. In diesem Zusammenhang sind auch die Begriffe der bystander suppression und der infectious tolerance zu nennen, wobei letztere die Fähigkeit beschreibt, die Suppressor-Eigenschaften von regulatorischen T-Zellen auf konventionelle CD4 + T-Zellen zu übertragen. Diese sekundäre Suppressor- Aktivität, die von CD4 + CD25 + T-Zellen via Zell-Zell-Kontakt auf konventionelle CD4 + T-Zellen übertragen wird, ist ihrerseits dann zellkontaktunabhängig und wird über die immunmodulatorischen Faktoren TGF-β und IL-10 vermittelt. Somit lassen sich eventuell die widersprüchlichen Ergebnisse zur Rolle der Zytokine bei dem Mechanismus der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen erklären, über den die Suppression vermittelt wird. Hierbei kommt es nämlich zu einem Transfer der Toleranz-begünstigenden Aktivität von den natürlich vorkommenden CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen, die ihrerseits keine Zytokine in größerem Umfang sezernieren, auf die induzierten sekundären regulatorischen T-Zellen mit einer anderen Antigenspezifität, die im Gegensatz zu den CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen ihre Suppressorfunktion über Zytokine (TGF-β und IL-10) vermitteln. Dieses Ausweiten des suppressiven Effektes mag einer der fundamentalen Mechanismen sein, durch den es zur Induktion und Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz kommt [Jonuleit et al. 2003, Bohle et al. 2007, Blaser et al. 2004]. Vor wenigen Jahren wurde das duale Th1/Th2-Modell um eine 3. Untergruppe von T-Helfer-Zellen erweitert, die sog. Th17-Zellen. Ihre Hauptfunktion besteht in der Induktion von Entzündung im Gewebe sowie dem Schutz des Organismus vor Krankheitserregern, insbesondere Bakterien und Pilze (extrazelluläre Pathogene). Induziert wird ihre Entstehung durch die Zytokine IL-6 und TGF-ß, die in den Vorläuferzellen die Entstehung des Transkriptionsfaktors ROR-γt bewirken. Sie produzieren hauptsächlich IL-17, welches wiederum die Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-α und IL-1ß sowie von Chemokinen, Metalloproteinasen und Prostaglandin E 2 bewirkt, was zur Folge hat, dass Entzündungszellen einwandern ( Neutrophilen-Rekrutierung ) [Bettelli et al. 2008, Awasthi et al. 2009].

24 19 Den Th17-Zellen wird eine relevante Beteiligung bei der Entwicklung einiger Autoimmun-Erkrankungen zugewiesen, so z.b. bei der Rheumatoiden Arthritis, bei der Multiplen Sklerose, bei den chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen sowie bei der Psoriasis, wobei entsprechende Hinweise hierfür sowohl beim Menschen als im Tiermodell gesehen wurden. Beim Vergleich zwischen den CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen und den Th17-Zellen wird ein reziprokes Verhältnis beschrieben: TGF-ß alleine induziert den Transkriptionsfaktor Fox p 3 und somit CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen; in Gegenwart von IL-6 und TGF-ß wird die Entwicklung von CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen inhibiert und Th17-Zellen werden induziert. Es wurde sogar nachgewiesen, dass sich die beiden Transkriptionsfaktoren ROR-γt (für Th17-Zellen) und Fox p 3 (für CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen) gegenseitig binden und dadurch gegenseitig antagonisieren können [Awasthi et al. 2009]. Neben dem großen Feld der Autoimmunität werden CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen auch im Zusammenhang mit Toleranz gegenüber Organtransplantationen beforscht. Von den zahlreichen Arbeiten zu diesem Thema seien an dieser Stelle drei exemplarisch erwähnt [Hara et al. 2001, Taylor PA et al. 2001, Zhai et al. 1999]. Über die Rolle der humanen CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen bei der Toleranzinduktion gegen Inhalationsallergene lagen zum Zeitpunkt des Beginns der vorliegenden Arbeit keine Untersuchungen vor. Die Beteiligung der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen an der Wirkung der spezifischen Immuntherapie wurde im vorliegenden Projekt bei definierter Typ I-Allergie auf Bet v 1, das Hauptallergen der Birke, untersucht. Für die Untersuchung von Patienten mit definiertem Sensibilisierungsprofil ist dieses Modell-Allergen besonders geeignet, da bei 60% der Patienten mit Sensibilisierung auf früh- und mittelblühende Bäume eine ausschließliche Sensibilisierung auf dieses 17-kDa-Allergen vorliegt.

25 20 4. Materialien und Methoden 4.1. Inklusionskriterien zur Studienteilnahme Geeignete Patienten mit positiver Anamnese, Pricktest- und CAP-FEIA- Befunden auf früh- und mittelblühende Bäume wurden in der Allergieambulanz der Hautklinik Universitätsklinikum Erlangen rekrutiert. Die Indikation zur spezifischen Immuntherapie wurde nach den Empfehlungen der WHO und nach positiver nasaler Provokation gestellt. Die Studienteilnehmer wurden mündlich und schriftlich aufgeklärt. Ein positives Votum der Ethikkommision der medizinischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg (Bearbeitungsnummer 2375) liegt vor. Das komponentenspezifische Sensibilisierungprofil wurde im IgE-Immunoblot auf aufgetrennten natürlichen Pollenextrakten nach etablierten Methoden [Furin et al. 1991] bestimmt. Als Einschlusskriterium für die Studie galten neben Indikation zur Hyposensibilisierung und Fehlen entsprechender Ausschlusskriterien nach WHO eine Sensibilisierung auf das Hauptallergen der Birke, Bet v 1. Zusätzliche, aber nicht ausschließliche Sensibilisierungen auf Minorallergene der Birke (z.b. bei 9, 14, 21, 33 und 65 kda) waren erlaubt. Dreizehn den Einschlusskriterien entsprechende Patienten, die nach schriftlicher und mündlicher Aufklärung freiwillig an der Studie teilnahmen, wurden im Verlauf der präsaisonalen Hyposensibilisierungstherapie bezüglich der Rolle der CD4 + CD25 + T-Zellen untersucht. Als Impfstoff wurde Pollinex Quattro (Bencard Allergy GmbH, München, Deutschland) verwendet; hierbei handelt es sich um tyrosinadsorbierte, chemisch modifizierte Allergenextrakte (Allergoide) zur s.c.- Impfung, wobei bei der 1. Impfung 300, bei der 2. Impfung 800 und bei der 3. und der 4. Impfung 2000 SU/ml (SU = Standardised Units) allergene Substanzen verabreicht werden. Als Adjuvans kommt in diesem Impfstoff MPL (= Monophosphoryl-Lipid A), die gereinigte, detoxifizierte Lipid-A-Komponente aus dem Lipopolysaccharid von Salmonella minnesota, in einer Konzentration von 50 µg/ml zum Einsatz [Drachenberg et al. 2001, Drachenberg et al. 2002, Drachenberg et al. 2003].

26 21 Zu definierten Zeitpunkten während der SIT wurden den Patienten Blutproben (160 ml Heparin-Vollblut und 7,5 ml zur Serumgewinnung) durch Punktion einer Vene der Ellenbogeninnenseite zur weiteren Analyse entnommen (Abbildung 1). Abbildung 1: Schema der Spezifischen Immuntherapie (SIT) und Blutentnahmen 4.2. Puffer und Medien 10%-SDS-Lösung (10 g Lauryl Sulfat = Sodiumdodecylsulfat = SDS = C 12 H 25 O 4 SNa (Lot No. 81K0177, EC No , Sigma -Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland), 100 ml Aqua dest.) Lower-Tris-Lösung (363,3 g (= 3-molar) Tris (= Tris(hydroxymethyl)-aminomethan = H 2 NC(CH 2 OH) 3, EC-No.: , Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), 40 ml (= 0,4% w/v) 10%-SDS-Lösung. Aqua dest. ad 1000 ml, ph = 8,85)