Protein purification. First Enrichment / Purification step is a successful expression

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1 Protein purification First Enrichment / Purification step is a successful expression

2 General aim:3 STEP Purification Under normal conditions you lose at each purification step ca 20%, 1.Step capture 2. Step purify 3. Step polish Each step should be a different type of separation, has different capacities and different performance. E.g. capacity decreases from step1 to 3, performance increases step 1-3.

3 General rules Until you don t know better -Use protease inhibitors -Work fast (prepare buffers, SDS PAGE, Blots etc) -Keep cold protein (slower denaturation and less proteolysis) -Do NOT freeze in between; if necessary shock freeze with glycerol. -Start with high amounts of protein -Make small scale tests prior large scale preparations

4 Column self made / or ready-to-use Depends on material Kind of separation Prize of material Knowledge / experience of experimentator

5 Principles of Protein Separation Ion exchange (IEX, cation / anion exchange) Hydrophobic interaction (HIC) Reversed phase (RP) Size exclusion (SEC, gelfiltration) Affinity (IMAC, MBP, GST)

6 Ion exchange Suited as capture, purification, or polishing step Two types: Anion exchange and Cation exchange + Anion exchange: Matrix has positive charge Protein is negative charged Protein stick to matrix; elution with a anion, e.g. Cl -, SO 2-4, PO 3-4 the more neg. charges the better binding +

7 ph dependence of IEX separation Three proteins : blue acidic pi, green neutral pi, red basic pi

8 Different materials Anion exchange DEAE Di Ethyl Amino Ethyl; weak and mild anion exchanger, Separation is satisfying C 2 H + 5 R-C 2 H 5 NH C 2 H 5 Q, TMAE Quaternary Nitrogen, Tri Methyl Amino Ethyl Strong an.ex., not so mild, for some proteins to hard, good to excellent separation CH 3 R-C 2 H 5 N + CH3 CH 3

9 Different media /columns Separation prize DE-52 (Whatman) DEAE on Cellulose matrix DEAE (Amersham; on sepharose matrix) Q-sepharose [fast flow] [Re -] Source Q30 [Re -] Source Q15 MonoQ MiniQ

10 Comparison 150 Euro 650 to 1000 Euro 250 Euro Euro

11 Cation exchange Carboxymethyl, CM, weak, mild, etc R-C-O-CH 3 O Sulfonicacid S, strong, harsh R-SO - 3 Hydroxyapatite (neither anion nor cation exchange) CaPO 4 matrix, proteins can bind as cations but also as anions Elution with PO 4 3- or Cl -

12 General aspects IEX Very Fast flow (e.g. Source30, 1 cm diameter up to 20 ml/min) High chemical stability High mechanical stability High capacity High perfomance Easy upscaling

13 Hydrophobic interaction Suited as capture step or purification step

14 Different HIC media

15 Strong influence of matrix on separation influence not predictable!

16 General aspects HIC Fast flow High chemical stability mechanical stability High capacity Good - high perfomance Easy upscaling

17 Size exclusion

18 Different types have different pore size => different media according to size of proteins

19 Pitfalls in SEC Wrong material, not suited for proteins to separate

20 Cloggy sample, closes pores of material Top of column is not even => smear, bad separation Application of to large volume Large dilution of sample Long duration

21 General aspects SEC slow flow (required for good separation) chemical stability in some cases not that high low mechanical stability! Overpressure can ruin the column Medium - low capacity High perfomance Upscaling not so easy. You have to buy columns for best perfomance.

22 Tags His 6 -tag (1 kda) GST-tag (26 kda) MalE-tag (40 kda) CBP-tag (4 kda) Strep-tag (1 kda)

23 His-tag Immobilized Metal ion Adsorption Chromatography (IMAC) Prinzip Protein mit N- oder C-terminaler Fusion an 6 His bis 10 His Reste His-Reste koordinieren immobilisiertes Metal-Ion auf Säulenmatrix Elution mit Imidazol Metallionen: Ni 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+ Matrix: GE-Healthcare, Quiagen, BioRad, TALON

24 Säulenmatrix His-tag

25 His-tag Vorteile Sehr gute Bindung Kleiner Tag Detergenzien stören nicht Benötigte Technik gering

26 His-tag Nachteile Unspezifische Bindung

27 His-tag (1 kda) Nachteile EDTA kann nicht benutzt werden EDTA komplexiert Metalionen der Säulenmatrix

28 His-tag (1 kda) Nachteile DTT kann nicht benutzt werden DTT komplexiert Metalionen der Säulenmatrix

29 His-tag Nachteile Ni 2+ als Verunreinigung in Proteinpräperation Oxidation von Met und Cys durch Ni 2+

30 GST-tag (26 kda) Glutathion-S-transferase Prinzip Protein mit N- oder C-terminaler Fusion von GST GST bindet an glutathion an Säulenmatrix Elution mit Glutathion Verschiedene Anbieter

31 Matrix GST-Tag

32 GST-tag Vorteile Protein Tag Spezifische Bindung Batch- wie Säulenverfahren möglich

33 GST-tag Nachteile Sehr großer tag Bindung sehr, sehr langsam Elution mit Glutathion -> kann Disulfide reduzieren GST dimerisiert => artifizielles Dimer

34 MalE / MBP-tag (40 kda) maltose binding protein Prinzip Protein meist mit N-terminaler Fusion von MalE MalE bindet an Amylose an Säulenmatrix Elution mit Maltose Verschiedene Anbieter (NEB, GE-Healthcare, etc)

35 MBP-tag Vorteile Protein Tag Spezifische Bindung Batch- wie Säulenverfahren möglich

36 MBP-tag Nachteile Sehr großer tag Bindung langsam Keine denaturierende Isolation möglich Viele Proteine bleiben in Lösung mit tag, aber präzipitieren, wenn der tag abgespalten wird.

37 CBP-tag (4 kda) Calmodulin binding peptide Prinzip Protein mit Fusion von Peptid der Myosin Light Chain Kinase (MLCK) Peptid bindet an Calmodulin an Säulenmatrix Bindung in Gegenwart von Ca 2+ Elution mit EDTA

38 Matrix CBP-tag

39 CBP-tag Vorteile Protein Tag Bindung schnell Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden

40 CBP-tag Nachteile Säulenmatrix ist Calmodulin Bindung schnell Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden

41 Prinzip Strep-tag (4 kda) Streptavidin von Streptomyces avidinii, Protein mit Fusion von Peptid Asn-Trp-Ser-His-Pro- Gln-Phe-Glu-Lys- Bindung an Strepavidin Elution mit Biotin / Desthiobiotin

42 Strep-tag Matrix Minimal Strepavidin

43 Strep-tag Vorteile Protein / Peptid tag Sehr spezifische Bindung Kleiner Tag

44 Strep-tag Nachteile Detergenzien nur bedingt möglich Saurer ph nicht möglich Protein auf Säulenmatrix (Cleaning of column etc)

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