Untersuchung der Quartärstruktur

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1 Untersuchung der Quartärstruktur Analyse von Protein-Netzwerken In vitro Hydrodynamische Verfahren (z.b. Gelfiltration) Spektroskopische Verfahren (z.b. FRET) Kreuzvernetzung ( Crosslinking ) Immunologische Verfahren (Far-Western Blot) Pulldown -Verfahren ( Tagging, Immunpräzipitation) In vivo Tagging -Verfahren Hefe 2-Hybrid Verfahren (Y2H) Quantitative immuno-precipitation combined with knockdown

2 Gelfiltrationsanalyse Elution Protein 1 Protein 2 Komplex Schnell und einfach. Nicht destruktiv.

3 Fluoreszenz-Resonanz Energietransfer (FRET) Direkter Energietransfer, keine Emission/Absorption.

4 Fluoreszenz-Resonanz Energietransfer (FRET) Voraussetzung: Spektrale Überlappung zwischen Donor- Emission und Akzeptor-Absorption.

5 Fluoreszenz-Resonanz Energietransfer (FRET) E - FRET-Effizienz r - Distanz Donor-Akzeptor R 0 - Distanz bei der E = 0.5 (charakteristische Größe für ein Donor-Akzeptor-Paar) Stark abhängig vom Abstand Donor-Akzeptor.

6 Fluoreszenz-Resonanz Energietransfer (FRET) Abhängig von der relativen Orientierung.

7 Kreuzvernetzung

8 Kreuzvernetzungsreagenzien

9 Reaktionsschemata

10 Reaktionsschemata

11 Crosslinks? Crosslinks?

12 Analyse der Vernetzungen 1. SDS-PAGE (Säulengel) 1. SDS-PAGE (Flachgel) 2. Inkubation mit Spaltreagenz Ursprünglich vernetzte Species laufen nicht auf der Diagonalen. 2. SDS-PAGE (Flachgel) 3. SDS-PAGE (Flachgel)

13 IEF Far-Western-Blot SDS Electroblotting Inkubation mit vermuteten Interaktionspartner ( 35 S-Met markiert oder mit einem "Tag") Immunoblot mit Ab gegen Tag

14 Ko-Immunopräzipitation Protein A Sepharose Ab Peptid-Epitop Protein A Sepharose SDS-PAGE Identifikation

15 Kontrollen Niht-spezifischerAb Spezifischer Ab Kontrolle Co-IP SDS-PAGE Identifikation

16 Pulldown von Proteinen über Tags Protein Tag N-terminal C-terminal Tags bieten Markierungsmöglichkeiten durch Genfusion. GST (Glutathion-S-Transferase), Maltose- Bindeprotein, His 6 -Tag, STREP-Tag TAP-Tag

17 GST-Pulldown

18 GST Pulldown im Zellextrakt Zellextrakt Glutathion Glutathion Sepharose Glutathion Sepharose

19 Wichtig: Kontrollexperimente Glutathion Sepharose Glutathion Sepharose Glutathion Sepharose Positiv Bestätigung Negativ

20 Kontrolle (z.b. Tag allein) Pulldown Komplex Hintergrund

21 In vivo Pulldown: Transiente Transfektion Markierte Variante des Proteins auf einem Vektor. Wildtyp Gen auf dem Chromosom.

22 In vivo Pulldown: Stabile Zelllinie Einbau des markierten Proteins ins Chromosom

23 Tags für in vivo Pulldown c-myc-tag (EQKLISEEDL) Flag-Tag (DYKDDDDK) Spezifische Antikörper HA-Tag (YPYDVPDYA) (Influenza Hämagglutinin Epitope) Anreicherung an Protein A-Sepharose

24 Proteomweite Interaktionsmuster

25 TAP (Tandem Affinity Purification)-Tag Strategie (B. Seraphin, M. Wilm, EMBL)

26 Eukaryontische Transkriptionsfaktoren (z.b. GAL4)

27 Hefe 2-Hybrid Verfahren (Y2H) (Fields und Song, 1989) Prey GAL4 Transaktivierungsdomäne Bait GAL4 DNA-Bindungsdomäne

28 Reporter Ein einfach zu detektierendes Enzym, z.b. β-galactosidase. Ein Selektionsmarker.

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30 Y2H kann auf dem gesamten Proteom durchgeführt werden Uetz, P. et al. (2000) Nature 403, 623 Z.B. alle ca ORF der Hefe.

31 Vor- und Nachteile Y2H Einfache in vivo Methode. Hochdurchsatz-tauglich. Analyse der interagierenden Domänen möglich. Es kann sich um eine indirekte Interaktion handeln (z.b. weiteres Brückenprotein). Die Proteine müssen in den Kern gelangen. Falsch-Negative: z.b. Membranproteine. Falsch-Positive: z.b. Transkriptionsfaktoren.

32 SILAC - "stable isotope labeling with amino acids in cell culture" Ong, S.E. et al. (2002) Mol. Cell. Proteomics 1, 376

33 Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK) Selbach, M. & Mann, M. (2006) Nat. Methods 3, 981

34 Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK)