Bestimmung von Glyphosat in Wasser mittels Online SPE-LC-MS/MS-Kopplung

Transkript

1 Bestimmung von Glyphosat in Wasser mittels Online SPE-LC-MS/MS-Kopplung Einführung Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin, C 3 H 8 NO 5 P) ist eine chemische Verbindung aus der Gruppe der Phosponate und das weltweit am meisten eingesetzte Herbizid. Es wurde 1950 zum ersten Mal hergestellt und von Monsanto 1971 als Herbizid zum Patent angemeldet. Der Wirkmechanismus beruht auf der Blockade des Enzyms EPSPS, das zur Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin benötigt wird. Der ADI-Wert (acceptable daily intake) von Glyphosat beträgt 0,3 mg/kg Körpergewicht, der Grenzwert in Trinkwasser bei 0,1 µg/l. Glyphosat wird im Wesentlichen über Mikroorganismen umgesetzt, der Abbau verläuft über die Verbindung Aminomethylphosphonsäure (AMPA), die daher auch analytische Relevanz erhält. Geräteaufbau Abbildung 1: Online-SPE-System zur Kopplung mit MS-Systemen AS-Applikationsnote 1309 Seite 1 von 8

2 Schon seit langen wird die Online-SPE in Kopplung mit einem LC-MS/MS-System zur Analyse von Glyphosat angewendet. Dabei wird vor der Festphasenextraktion eine Derivatisierung mit Hilfe von FMOC-CL (9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid) durchgeführt, die die chromatographische Analyse deutlich vereinfacht. Die Online-SPE bietet zwei wesentliche Nutzen: Erstens verbessert die sie durch einen Anreicherungsschritt die erreichbaren Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. Zweitens entfernt die Methode Matrixbestandteile und reduziert damit korrespondierende Effekte wie Ionensuppression. Dies ist besonders für die LC-MS-Kopplung ein gravierender Vorteil. Wie bei allen analytischen Methoden spielt auch bei der SPE die Automatisierung eine große Rolle, denn immer weniger Laborpersonal muss immer höheren Anforderungen gerecht werden. Da liegt es nahe, die arbeitsintensiven Schritte der Probenvorbereitung zu automatisieren. Die Automatisierung dieser Schritte hat neben Effizienzüberlegungen den Vorteil einer besseren Reproduzierbarkeit sowie dem deutlich geringeren Kontaminationsrisiko im Vergleich zur manuellen Handhabung. Automatisierung verbessert die analytische Leistungsfähigkeit und Analysenqualität. Um eine robuste Automatisierung zu ermöglichen, kommen bei der Online-Methode spezielle SPE- Kartuschen zum Einsatz. Die miniaturisierten Hochdruck-SPE-Kartuschen sind mit SPE-Material besonders kleiner Körnung gepackt und um ein Vielfaches effizienter als herkömmliche SPE-Anreicherungseinheiten. Durch den Einsatz dieser bis zu 300 bar druckfesten Kartuschen ist es möglich, die Förderung von Probe und Elutionsmittel mit Hilfe einer Hochdruckspritzenpumpe vorzunehmen. Dies stellt eine präzise und reproduzierbare Förderung sicher. Ein weiterer Vorzug in der Verwendung dieser miniaturisierten Hochdruckkartuschen liegt in der Möglichkeit, automatisch für jede Probe eine frische Kartusche zu verwenden. Insbesondere bei komplexen Probenmatrices, wie beispielsweise Urin oder Serum, oder bei besonders niedrigen Nachweisgrenzen kann man so Kontaminationen und Verschleppungen sicher vermeiden. Die Analytik von Glyphosat wird in der DIN ISO definiert, im Folgenden soll die Anwendung der DIN auf ein Online-SPE-System mit LC-MS/MS-Detektion beschrieben werden. AS-Applikationsnote 1309 Seite 2 von 8

3 Messparameter und Ergebnisse Die Probenvorbereitung wurde wie folgend beschrieben in Anlehnung an die DIN beschrieben durchgeführt. Dazu wurde ein Probevolumen von 5 ml in ein 12 ml-glasvial überführt. Die Probe wurde dann mit 10 ng Internem Standard (Glyphosat 1,2-13 C 2, 15 N) versetzt. Zur Pufferung auf ph-wert 9,0-9,5 wurden der Probe 100 µl EDTA-Na 2 (0,1 mol/l) und 2000 µl Na-Borat-Puffer (0,05 mol/l) zugesetzt. Durch Zugabe von 4 µl FMOC-CL (50 g/l) erfolgte die Derivatisierung der Analyten durch Schütteln über Nacht bei 150 Umdrehungen/min. Nach Abschluss der Derivatisierung erfolgte die Neutralisation durch 30 %-ige Salzsäure. Abschließend wurden die Proben über 0,45 µm-filter filtriert. Bei der Berechnung der Endergebnisse muss eine Volumenkorrektur berücksichtigt werden. Zur Kalibration der Methode wurden Standards im Konzentrationsbereich von 4 µg/l bis 0,4 ng/l angesetzt. Die angesetzten Kalibrationsstandards wurden jeweils mittels Direktmessung von 50 µl und mittels Online-SPE von 1000 µl analysiert. Die Analytik wurde unter folgenden Parametern durchgeführt: Massenspektrometer: AB Sciex QTrap 6500 Polarität: negativ Ionisation: ESI CUR: 30 psi TEM: 350 C GS1: 40 psi GS2: 60 psi IS: V CAD: medium EP: -10 V MRM Q1 Q3 DP CE CXP AMPA-FMOC Glyphosat-FMOC Glyphosat-ISTD- FMOC AS-Applikationsnote 1309 Seite 3 von 8

4 Flüssigchromatographie: Spark Holland Symbiosis Pico Trennsäule: Kinetex 2,6u 50 mm x 2,1 mm (Phenomenex) Temperatur: 40 C Kanal A: 0,1 % Triethylamin ph 9,5 Kanal B: Acetonitril Gradient: Zeit: % B 00: : : :01 5 Online-Anreichung: Kartusche: Elutionsmodus: Elution time: Spark Holland Symbiosis Pico Spark Holland HySphere C mm x 1 mm Gradient Elution 8 min Lösemittel Volumen Flussrate Konditionierung Methanol 2 x 650 µl 1000 µl/min Equilibrierung 0,1 % Ameisensäure 2 x 650 µl 1000 µl/min Extraktion Wasser 1500 µl 500 µl/min Waschen Wasser 1000 µl 1000 µl/min AS-Applikationsnote 1309 Seite 4 von 8

5 Analyte / ISTD Analyte / ISTD AS-Applikationsnote Direktmessung Im Rahmen der Quantifizierung von Glyphosat und AMPA mittels ISTD-Kalibration wurden für die Direktmessung von 50 µl die folgenden Kalibrationsdaten ermittelt y = 0.489x R² = µg/l Abbildung 2: Kalibration Glyphosat 4 µg/l bis 0,04 µg/l via Direktmessung (n=1) 1.40 y = 0.328x R² = µg/l Abbildung 3: Kalibration AMPA 4 µg/l bis 0,04 µg/l via Direktmessung (n=1) AS-Applikationsnote 1309 Seite 5 von 8

6 Glyphosat-ISTD AMPA S/N=5 S/N=9,5 Glyphosat Abbildung 4: Chromatogramm 0,04 µg/l Direktmessung Glyphosat: Linearer Kalibrationsbereich: 4 µg/l bis 0,04 µg/l NWG (S/N=3) 13 ng/l BG (S/N=6) 26 ng/l AMPA: Linearer Kalibrationsbereich: 4 µg/l bis 0,04 µg/l NWG (S/N=3) 24 ng/l BG (S/N=6) 48 ng/l AS-Applikationsnote 1309 Seite 6 von 8

7 Analyte / ISTD Analyte / ISTD AS-Applikationsnote Online-SPE Im Rahmen der Quantifizierung von Glyphosat und AMPA mittels ISTD-Kalibration wurden für die Online- Anreicherung von 1000 µl die folgenden Kalibrationsdaten ermittelt y = 0.520x R² = µg/l Abbildung 5: Kalibration Glyphosat 4 µg/l bis 0,004 µg/l via Online-Anreicherung (n=3) y = x R² = µg/l Abbildung 6: Kalibration AMPA 4 µg/l bis 0,004 µg/l via Online-Anreicherung (n=3) AS-Applikationsnote 1309 Seite 7 von 8

8 Glyphosat-ISTD AMPA S/N=3,5 Glyphosat S/N=3,3 Abbildung 7: Chromatogramm 0,004 µg/l Online-SPE Glyphosat: Linearer Kalibrationsbereich: 4 µg/l bis 0,004 µg/l NWG (S/N=3) 3,4 ng/l BG (S/N=6) 6,8 ng/l AMPA: Linearer Kalibrationsbereich: 4 µg/l bis 0,004 µg/l NWG (S/N=3) 3,6 ng/l BG (S/N=6) 7,2 ng/l Zusammenfassung Die in der Norm beschriebenen Bestimmungsgrenzen von etwa 30 ng/l können mit der hier vorgestellten Methode erfüllt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass mittels Online-Anreicherung die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen im Vergleich zur Direktmessung wesentlich verbessert werden konnten. Die berechnete mittlere Abweichung der Einzelwerte (n=3) untereinander von < 6 % spricht für eine gute Reproduzierbarkeit der automatisierten Online-Anreicherung. AS-Applikationsnote 1309 Seite 8 von 8