RIDA GENE Pneumocystis jirovecii real-time PCR

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1 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii realtime PCR Art. Nr.: PG Reaktionen Für die invitro Diagnostik. 20 C RBiopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D64297 Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 1. Verwendungszweck Für die invitro Diagnostik. RIDA GENE Pneumocystis jirovecii ist eine realtime PCR zum direkten qualitativen und quantitativen Nachweis von Pneumocystis jirovecii DNA aus humaner bronchoalveolären Lavage (BAL). 1,2 Die RIDA GENE Pneumocystis jirovecii realtime PCR soll die Diagnose einer durch Pneumocystis jirovecii verursachten respiratorischen Infektion unterstützen. 2. Erläuterung Pneumocystis jirovecii (ehem. P. carinii) gehört zur Familie der Pneumocystidaceae und kann zu einer interstitiellen Lungenentzündung führen. Opportunistische Infektionen sind ein großes Problem in Patienten mit geschwächtem Immunsystem, zum Beispiel HIV/AIDS Patienten, Krebspatienten und Patienten, die eine Organtransplantation erhalten. Pneumocystis jirovecii führt zu einer respiratorischen Infektion und ist die häufigste opportunistische Erkrankung in HIVinfizierten Menschen. In der gesunden Population ist Pneumocystis jirovecii nicht pathogen und ist in der Bevölkerung weit verbreitet. Immunsupprimierte Menschen jedoch entwickeln eine Pneumonie mit Symptomen wie trockenem Husten, Atemnot, Tachypnoe und Fieber. 3 Obwohl die Einführung der HAART Therapie 1996, die Pneumocystis jirovecii Inzidenz um 3.4 % jährlich reduziert hat, sind immer noch 9 % der hospitalisierten HIV Patienten und 1 % der organtransplantierten Patienten mit Pneumocystis jirovecii infiziert. 4 Laut dem Center for disease control (CDC) liegt die Mortalität bei Patienten ohne Behandlung bei 100 % und bei 5 % 40 % in immunsupprimierten Patienten, die eine Behandlung erhalten haben. 4 Die Mortalitätsrate durch Pneumocystis jirovecii in nichthiv infizierten Patienten kann bis zu 40 % betragen. 5 Der Nachweis von Pneumocystis jirovecii erfolgte bisher durch Immunfluoreszenzfärbung. Diese wird jedoch wegen der geringen Sensitivität durch die PCR ersetzt Testprinzip RIDA GENE Pneumocystis jirovecii ist eine realtime PCR zum direkten quantitativen Nachweis von Pneumocystis jiroveciidna aus bronchoalveolären Lavage (BAL). Nach der DNAIsolation wird (falls vorhanden) das für Pneumocystis jirovecii spezifische Genfragement (LSU; large subunit) amplifiziert. Die amplifizierten Zielsequenzen werden mit HydrolyseSonden, die an einem Ende mit dem Quencher und am anderen Ende mit einem ReporterFluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) markiert sind, nachgewiesen. In Gegenwart einer Zielsequenz hybridisieren die Sonden mit den Amplikons. Während der Extension trennt die 2 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

3 TaqPolymerase den Reporter vom Quencher. Der Reporter emittiert ein Fluoreszenzsignal, das durch die optische Einheit eines realtime PCRGerätes detektiert wird. Das Fluoreszenzsignal steigt mit der Menge der gebildeten Amplikons an. Mit Hilfe der im Kit enthaltenen Standard DNA A, B und C ist eine Quantifizierung der Ergebnisse möglich. Der RIDA GENE Pneumocystis jirovecii Test enthält eine Internal Control DNA (ICD), die eine mögliche PCRInhibition anzeigt, die Integrität der Reagenzien überprüft und eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion bestätigt. 4. Packungsinhalt Tab.1: Packungsinhalt (Die Reagenzien einer Packung reichen für 100 Bestimmungen) Kit Code Reagenz Menge Deckelfarbe 1 Reaction Mix 2x 1100 µl gelb 2 TaqPolymerase 1x 11 µl rot D Internal Control DNA 2x 1800 µl orange N PCR Water 1x 500 µl weiß P Positive Control 1x 100 µl hellblau A Standard DNA A 1x 100 µl dunkelblau B Standard DNA B 1x 100 µl dunkelblau C Standard DNA C 1x 100 µl dunkelblau 5. Reagenzien und ihre Lagerung Alle Reagenzien müssen lichtgeschützt bei 20 C gelagert werden und können bis zum aufgedruckten Verfallsdatum verwendet werden. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Vor dem Gebrauch sollten die Reagenzien schonend aufgetaut werden (z.b. im Kühlschrank bei 2 8 C). Ein wiederholtes Einfrieren/Auftauen bis zu 20 Mal beeinträchtigt die Testeigenschaft nicht (ggf. Aliquots nach dem ersten Auftauen herstellen und die Reagenzien sofort wieder einfrieren). Alle Reagenzien während der PCRVorbereitung geeignet kühlen (2 8 C). RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

4 6. Zusätzlich benötigte Geräte und Materialien DNAExtraktionsysteme für bronchoalveoläre Lavage (BAL) (z.b. NucliSENS easy MAG (biomérieux), MagNA Pure 96 (Roche)) Realtime PCRGerät: Roche: LightCycler 1.5, LightCycler 2.0, LightCycler 480II Cepheid: SmartCycler Applied Biosystems: ABI 7500 Abbott: m2000rt Stratagene: Mx3005P QIAGEN: RotorGene Q BioRad: CFX96 RIDA GENE ColorCompensation Kit II (PG0002) bei Verwendung des LightCycler 1.5 und 2.0 (Roche) Realtime PCR Verbrauchsmaterialien (Platten, Reaktionsgefäße, Folien) Zentrifuge mit Rotor für Reaktionsgefäße, Platten Vortexer Pipetten (0,5 20 µl, µl, µl) Pipettenspitzen mit Filtern Puderfreie Einmalhandschuhe 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die invitro Diagnostik. Eine räumliche Trennung von Extraktion, PCRAnsatz und PCR ist zu beachten, um Querkontaminationen zu vermeiden. Dieser Test ist nur von molekularbiologisch geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Während des Umgangs mit Proben Einmalhandschuhe tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In den Bereichen, in denen mit Proben gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Klinische Proben müssen als potentiell infektiös angesehen werden und müssen wie sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen, entsprechend entsorgt werden. Testkit nach Erreichen des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. 4 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

5 8. Testdurchführung 8.1. DNAIsolation aus bronchoalveolarer Lavage (BAL) Für die DNAPräparation aus bronchoalveolarer Lavage wird ein kommerziell erhältliches DNAExtraktionssystem (z.b. NucliSENS easy MAG (biomérieux)) empfohlen. Die Angaben des Herstellers sind zu beachten. Der RIDA GENE Pneumocystis jirovecii Test enthält eine Internal Control DNA (ICD), die eine mögliche PCRInhibition anzeigt, die Integrität der Reagenzien überprüft und eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion bestätigt. Wird die Internal Control DNA (ICD) als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle verwendet, müssen 20 µl der ICD während der Extraktion eingesetzt werden. Die ICD soll dem ProbenLysispuffer Mix und nicht direkt dem Probenmaterial zugefügt werden. Wird die Internal Control DNA (ICD) nur als Inhibitionskontrolle verwendet, muss 1 µl der ICD dem MasterMix hinzugefügt werden (s. Tab.3). 8.2 Herstellung des MasterMix Die Gesamtzahl der für die PCR benötigten Reaktionen (Proben und Kontrollreaktionen) ist zu berechnen. Bei jedem Testlauf muss eine Positiv und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Es wird empfohlen, den MasterMix mit 10 % zusätzlichem Volumen anzusetzen, um einen Pipettierverlust auszugleichen (s. Tab.2, Tab.3). Vor der Benutzung den Reaction Mix, die TaqPolymerase, die Positive Control, das PCR Water und die ICD auftauen, durchmischen und kurz zentrifugieren. Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen (2 8 C). RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

6 Tab.2: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD als Extraktions und Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) 1 Reaction Mix 19,9 µl 218,9 µl 2 TaqPolymerase 0,1 µl 1,1 µl Gesamt 20 µl 220 µl MasterMix mischen und anschließend kurz abzentrifugieren. Tab.3: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD nur als Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) 1 Reaction Mix 19,9 µl 218,9 µl 2 TaqPolymerase 0,1 µl 1,1 µl D Internal Control DNA 1,0 µl 11 µl Gesamt 21,0 µl 231,0 µl MasterMix mischen und anschließend kurz abzentrifugieren. 8.3 Herstellung des PCRMix Je 20 µl des MasterMix in die jeweiligen Reaktionsgefäße (Gefäße/Platten) pipettieren. Negativkontrolle: Je 5 µl PCR Wasser zum vorgelegten MasterMix als Negativkontrolle pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der ICD als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und die Inhibitionskontrolle je 1 µl der ICD zum PCRMix der Negativkontrolle zu pipettieren. Proben: Positivkontrolle: Je 5 µl DNAExtrakt zum vorgelegten MasterMix der Probenreaktionen pipettieren. Je 5 µl Positive Control zum vorgelegten MasterMix in die dafür vorgesehenen Reaktionsgefäße pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der ICD als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und die Inhibitionskontrolle je 1 µl der ICD zum PCRMix der Positivkontrolle zu pipettieren. 6 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

7 Standard DNA (A, B, C): Je 5 µl Standard DNA (A, B, C) zum vorgelegten Master Mix in die dafür vorgesehenen Reaktionsgefäße pipettieren. Hinweis: Bei der Nutzung folgender Geräte muss bei jedem Lauf eine Standardkurve integriert werden: SmartCycler (Cepheid, geschlossenes System), ABI 7500 (Applied Biosystems), m2000rt (Abbott) und CFX96 (BioRad). Für alle anderen Geräte muss bei jedem neuen Lauf nur ein Punkt der Standardkurve als Kalibrator in das Experiment integriert werden. Die Applikation der Standardkurve ist für diese Geräte nur einmal pro Charge notwendig. Reaktionsgefäße bzw. Platte verschließen, mit wenigen Umdrehungen pro Minute kurz abzentrifugieren und in das realtime PCRGerät überführen. Die PCR entsprechend der Geräteeinstellung starten (s. Tab.4, Tab.5). 8.4 Geräteeinstellungen Tab.4: Realtime PCR Profil für LightCycler 1.5, LightCycler 2.0, LightCycler 480II, SmartCycler und RotorGene Q Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing / Extension 45 Zyklen 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Temperature Transition Rate / Ramp Rate Maximum Bemerkung: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Hinweis: Bei Verwendung des SmartCycler (Cepheid) müssen die Man. Grenzwert Flour. Einheiten für Kanal 1 auf 30.0 und für Kanal 2 auf 5.0 eingestellt werden. In Abhängigkeit des Gerätes kann es sein, dass die Man. Grenzwert Flour. Einheiten individuell eingestellt werden müssen. RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

8 Tab.5: Realtime PCR Profil für Mx3005P, ABI 7500, m2000rt und CFX96 Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing / Extension 45 Zyklen 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Temperature Transition Rate / Ramp Rate Maximum Bemerkung: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Hinweis: Für die Standard DNA A, B und C ist die Gesamtkopienanzahl je Reaktion in das Setup File des Softwaregrogramms des jeweiligen realtime PCR Gerätes einzutragen. Es werden 5 µl DNA eingesetzt, so dass sich folgende Konzentrationen ergeben: Standard DNA A: Standard DNA B: Standard DNA C: 5 x 10 1 Kopien/Ansatz 5 x 10 3 Kopien/Ansatz 5 x 10 5 Kopien/Ansatz Bemerkung: Die Standardkurve kann für jeden Parameter auf dem realtime PCR Gerät abgespeichert werden. Ausgenommen von dem SmartCycler (Cepheid, geschlossenes System), dem ABI 7500 (Applied Biosystems), dem m2000rt (Abbott) und dem CFX96 (BioRad) ist die Applikation der Standardkurve nur einmal pro Charge notwendig. Bei der Nutzung des SmartCycler (Cepheid, geschlossenes System), des ABI 7500 (Applied Biosystems), des m2000rt (Abbott) und des CFX96 (BioRad) muss bei jedem Lauf eine Standardkurve integriert werden. Für alle anderen Geräte muss bei jedem neuen Lauf nur ein Punkt der Standardkurve als Kalibrator in das Experiment integriert werden. 8 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

9 8.5 Detektionskanaleinstellung Tab.6: Auswahl der geeigneten Detektionskanäle Realtime PCR Gerät Roche LightCycler 1.5 Nachweis Detektionskanal Bemerkung Pneumocystis jirovecii F1 RIDA GENE Color Compensation Kit II (PG0002) ICD F2 wird benötigt Roche LightCycler 2.0 Pneumocystis jirovecii 530 RIDA GENE Color Compensation Kit II (PG0002) ICD 560 wird benötigt Roche LightCycler 480II Pneumocystis jirovecii 465/510 ICD 533/580 Color Compensation wird nicht benötigt Cepheid SmartCycler ABI 7500 Pneumocystis jirovecii Kanal 1 ICD Kanal 2 Stellen Sie die Man. Grenzwert Flour. Einheiten für Kanal 1 auf 30.0 und für Kanal 2 auf 5.0 ein Pneumocystis jirovecii FAM Stellen Sie den passiven Referenzfarbstoff ROX ICD VIC auf none Abbott m2000rt Pneumocystis jirovecii ICD FAM VIC Stratagene Mx3005P Pneumocystis jirovecii FAM Stellen Sie den Referenzfarbstoff auf ICD HEX none Qiagen RotorGene Q Pneumocystis jirovecii ICD Green Yellow BioRad CFX96 Pneumocystis jirovecii ICD FAM HEX RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

10 9. Interpretation der Ergebnisse Die Auswertung der Proben erfolgt über die AnalyseSoftware des jeweiligen realtime PCRGerätes nach den Angaben des Herstellers. Negativ und Positivkontrollen müssen die korrekten Ergebnisse zeigen (s. Abb.1). Abb. 1: Korrekter Verlauf der Positiv und Negativkontrolle (Pneumocystis jirovecii) auf dem LightCycler 480II Die Positivkontrolle liegt in einer Konzentration von 10 3 Kopien/µl vor. Sie wird in einer Gesamtmenge von 5 x 10 3 Kopien in jedem PCR Lauf eingesetzt. Die Probenauswertung der Ergebnisse erfolgt nach Tabelle 7. Tab.7: Interpretation der Ergebnisse Nachweis von Pneumocystis jiroveciispezifischem Zielgen Pneumocystis jirovecii ICD Ergebnis positiv negativ positiv/negativ positiv Pneumocystis jirovecii nachweisbar Zielgen ist nicht nachweisbar negativ negativ Ungültig 10 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

11 Pneumocystis jirovecii ist nachweisbar, wenn die ProbenDNA und die Internal Control DNA (ICD) eine Amplifikation im Nachweissystem zeigt. Pneumocystis jirovecii ist ebenfalls nachweisbar, wenn die ProbenDNA eine Amplifikation, jedoch keine Amplifikation für die Internal Control DNA (ICD) im Nachweissystem zeigt. Der Nachweis der Internal Control DNA (ICD) ist in diesem Fall nicht notwendig, da hohe Konzentrationen des Amplikons zu einem schwachen oder fehlenden Signal der Internal Control DNA (ICD) führen können. Pneumocystis jirovecii ist nicht nachweisbar, wenn die ProbenDNA keine Amplifikation, aber die Internal Control DNA (ICD) eine Amplifikation im Nachweissystem zeigt. Eine Inhibierung der PCRReaktion kann durch die Detektion der Internal Control DNA (ICD) ausgeschlossen werden. Eine Probe ist ungültig, wenn die ProbenDNA und die Internal Control DNA (ICD) im Nachweissystem keine Amplifikation zeigen. In der Probe sind PCRInhibitoren vorhanden bzw. es trat ein Fehler im Extraktionsverfahren auf. Die extrahierte Probe sollte 1:10 mit PCR Wasser verdünnt und erneut amplifiziert werden oder es sollte die Isolation und Reinigung der Probe verbessert werden. 9.1 Quantifizierung der Proben Um Pneumocystis jiroveciipositive Proben zu quantifizieren, muss eine Standardkurvenmessung mit Standard DNA A, B und C separat durchgeführt werden. Diese muss separat abgespeichert werden und kann in Folgeläufen bei Produkten der gleichen Chargennummer wieder importiert und genutzt werden. Hinweis: Dies gilt nicht für folgende Geräte: SmartCycler (Cepheid, geschlossenes System), ABI 7500 (Applied Biosystems), m2000rt (Abbott) und CFX96 (BioRad). Hier muss bei jedem Lauf eine Standardkurve integriert werden. Für alle anderen Geräte ist es bei jedem neuen Lauf erforderlich, dass ein Punkt der Standardkurve als Kalibrator in das Experiment integriert wird. Für die Quantifizierung der Proben, bei denen Pneumocystis jirovecii nachweisbar ist, werden die Reaktionen für die Standards (Standard DNA A, B und C), die Positiv und Negativkontrolle sowie die zu quantifizierenden Proben markiert und entsprechend der Auswertungsvorschrift des Geräteherstellers analysiert. Hinweis: Für weitere Informationen zur Quantifizierung der Proben wenden Sie sich bitte an pcr@rbiopharm.de RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

12 10. Testmerkmale 10.1 Klinisches Leistungsmerkmal In einer retrospektiven klinischen Validierungsstudie wurden 154 extrahierte Proben (BAL) mit dem RIDA GENE Pneumocystis jirovecii Test und einer inhouse realtime PCR in einem Institut in Deutschland untersucht. Tab.8 Korrelation der Pneumocystis jirovecii Ergebnisse mit der RIDA GENE Pneumocystis jirovecii realtime PCR und Referenz inhouse realtime PCR. Inhouse realtime PCR Positiv Negativ Insgesamt Bemerkungen RIDA GENE Pneumocystis jirovecii Positiv Sensitivity 83.9 % Negativ 5 a) Specificity 100 % Insgesamt a) Fünf (5) Proben befinden sich unter der Nachweisgrenze des RIDA GENE Pneumocystis jirovecii Tests mit einem CpWert > 35 im Referenz inhouse realtime PCR Test 10.2 Analytische Sensitivität Die RIDA GENE Pneumocystis jirovecii realtime PCR hat eine Nachweisgrenze von 5 DNAKopien/Reaktion für Pneumocystis jirovecii (s. Abb.2). Abb.2: Verdünnungsreihe Pneumocystis jirovecii ( DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II Die Nachweisgrenze des Gesamtverfahrens ist abhängig von der Probenmatrix, der DNAExtraktion und dem DNAGehalt. 12 RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

13 10.3 Analytische Spezifität Die RIDA GENE Pneumocystis jirovecii realtime PCR ist spezifisch für Pneumocystis jirovecii. Es wurden keine Kreuzreaktivitäten zu den folgenden Spezies festgestellt (s. Tab.9). Tab. 9: Kreuzreaktivitätstestung Acinetobacter baumannii Strain 5377 Haemophilus influenzae Rd Human parainfluenza virus 2 strain Greer Neisseria meningitidis Strain FAM18 Adenovirus Zellkulturüberstand Herpes simplex virus 1 strain McIntyre Human parainfluenza virus 4b strain CH19503 Serratia liquefaciens Adenovirus 1, Human, strain Adenoid 71 Adenovirus 7, Human, Strain Gomen Bordetella parapertussis Strain Bordetella pertussis Tohama 1 Herpes simplex virus 2 strain MS Human respiratory syncitial virus strain Long Human respiratory syncitial virus strain 9320 Human parainfluenza virus 1 strain C35 Klebsiella oxytoca Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae strain MGH78578 Legionella pneumophila subsp. Pneumophila Mycoplasma pneumoniae Strain FH of Eaton Agent Staphylococcus haemolyticus SM131 Streptococcus pneumoniae strain NCTC 7465 Acrobacter butzleri Campylobacter upsaliensis Cryptosporidium muris Proteus vulgaris Adenovirus 40, Human, Strain Dugan Candida albicans Cryptosporidium parvum Pseudomonas aeruginosa Adenovirus 41, Human, Strain Tak Citrobacter freundii E. coli (O26:H) Rotavirus Zellkultur Aeromonas hydrophila Citrobacter freundii NCTC 9750 E. coli (O6) Salmonella enteritidis Astrovirus Zellkultur Clostridium difficile E. coli (O157:H7) Shigella flexneri Bacillus cereus Clostridium perfringens Entamoeba histolytica Salmonella typhimurium Bacteroides fragilis Campylobacter coli Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes Staphylococcus Enterobacter cloacae hominis subsp. novobiosepticus R22 Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Campylobacter jejuni Clostridium novyi Giardia intestinalis Portland 1 Vibrio parahaemolyticus Campylobacter fetus subsp. Fetus Clostridium septicum Giardia intestinalis WB Clone C6 Yersinia enterocolitica Campylobacter lari subsp. Lari Clostridium sordellii Giardia lamblia RIDA GENE Pneumocystis jirovecii

14 11. Grenzen des Verfahrens 1. Das Ergebnis der molekularbiologischen Untersuchung sollte nicht allein zur Diagnose führen, sondern immer im Zusammenhang mit der Anamnese und Symptomatik des Patienten betrachtet werden. 2. Dieser Test ist nur für bronchoalveolare Lavage (BAL) validiert. 3. Unsachgemäße Probenentnahme, transport, lagerung und handhabung oder eine Erregerlast unterhalb der analytischen Sensitivität des Tests können zu falsch negativen Ergebnissen führen. 4. Die Anwesenheit von PCRInhibitoren kann zu nicht auswertbaren Ergebnissen führen. 5. Mutationen oder Polymorphismen in den Primer oder Sondenbindungsregion können den Nachweis neuer oder unbekannter Varianten beeinträchtigen und mit RIDA GENE Pneumocystis jirovecii zu falsch negativen Ergebnissen führen. 6. Wie bei allen auf PCR basierenden invitrodiagnostischen Tests können äußerst niedrige Konzentrationen der Zielsequenzen, die unter dem Detektionslimit (LoD) liegen, nachgewiesen werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind nicht immer reproduzierbar. 12. Literatur 1. Linssen CF et al. Interlaboratory comparison of three different realtime PCR assays for the detection of Pneumocystis jirovecii in bronchoalveolar lavage fluid samples 2006, 55: Tia T et al. A highly sensitive novel PCR assay for the detection of Pneumocysits jirovecii DNA in bronchoalveolar lavage specimens from immunocompromised patients 2012, 18: Borde JP et al. Aktuelle Diagnostik und Therapie der Pneumocystisjirovecii Pneuomonie. Dtsch Med Wochenschr 2011, 136: Centers for Disease Control and Prevention. Pneumocystis pneumonia Statistics Krajicek BJ et al. Pneumocystis pneumonia: current concepts in pathogenesis, diagnosis, and treatment. Clin Chest Med 2009, 30: RIDA GENE Pneumocystis jirovecii