Ruhr Universität Bochum PD Dr. med. S. Langer Dienstort: Krankenhaus Gerresheim Abteilung für Plastische Chirurgie und Ästhetische Chirurgie

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1 Ruhr Universität Bochum PD Dr. med. S. Langer Dienstort: Krankenhaus Gerresheim Abteilung für Plastische Chirurgie und Ästhetische Chirurgie Modell zur intravitalen fluoreszenzmikroskopischen Langzeitanalyse von Mikrozirkulation, Leukozyten-Endothelzell-Interaktion und Angiogenese nach Erfrierung Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Stefan Bärreiter aus Stuttgart 2009

2 Dekan: Referent: Ko-Referent: Prof. Dr. med. G. Muhr PD Dr. med. S. Langer Prof. Dr. med. H.-W. Duchna Tag der mündlichen Prüfung: 3. Dezember 2009

3 Gewidmet: Meinen Eltern

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Die Erfrierung Pathophysiologie der Erfrierung Aktuelle Therapieempfehlungen Material und Methoden Die haarlose Maus Die Anatomie des Ohres der haarlosen Maus Intravitale Fluoreszenzmikroskopie Mikroskop Kameras Fluorochrome Versuchsdurchführung Narkose Vorbereitung des Ohrs Lokalisation eines geeigneten Ortes für die Erfrierung Injektion der Fluoreszenzfarbstoffe Anfertigung der Basisaufnahmen Auswahl der Regions of Interest (ROI) und Basisaufnahmen Erzeugung der Erfrierung Aufzeichnung der Veränderungen Evaluierung der Erfrierung Messung der Mikrozirkulationsparameter Nicht perfundiertes Areal (NPA) Funktionelle Gefäßdichte (FGD) Gefäßdurchmesser Erythrozytenflussgeschwindigkeit (RBCV) Ödembildung Rollende Leukozyten (Roller) Adhärierende Leukozyten (Sticker) Dokumentation Statistische Auswertung Abbruchbedingungen Nullhypothese Genehmigung der Versuche Ergebnisse Makroskopische Veränderungen nach Erfrierung Intravitalmikroskopische Beobachtungen Nicht perfundiertes Areal und Angiogenese Funktionelle Gefäßdichte Gefäßdurchmesser...33 i

5 3.2.4 Erythrozytenflussgeschwindigkeit (RBCV) Ödembildung Rollende Leukozyten Adhärierende Leukozyten Diskussion Diskussion des Erfrierungsmodells Diskussion von Material und Methoden Das Ohr der haarlosen Maus Narkose Fluoreszenzmikroskopie Erzeugung und Evaluierung der Erfrierung Messmethoden CapImage Mikrozirkulatorische Parameter Diskussion der Ergebnisse Nicht perfundiertes Areal/Angiogenese Funktionelle Gefäßdichte Gefäßdurchmesser Erythrozytenflussgeschwindigkeit (RBCV) Ödembildung Rollende und adhärierende Leukozyten Vergleich der Ergebnisse mit dem im Haus entwickelten Verbrennungsmodell Makroskopische Veränderungen Fotografische Verlaufsdokumentation Nicht perfundiertes Areal Funktionelle Gefäßdichte Gefäßdurchmesser Flussgeschwindigkeiten (RBCV) Ödembildung Leukozytenanzahlen Fazit Literaturverzeichnis Anhang... 1 Danksagung... 2 Lebenslauf... 3 ii

6 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Klinisches Fallbeispiel... 2 Abbildung 2: Haarlose Maus SKH-1/hr... 9 Abbildung 3: Das Ohr der haarlosen Maus Abbildung 4: Histologischer Aufbau des Ohrs der haarlosen Maus Abbildung 5: Schematischer Aufbau des intravitalmikroskopischen Arbeitsplatzes Abbildung 6: Ohr der haarlosen Maus in zehnfacher Vergrößerung mit Erfrierungswunde Abbildung 7: Basisaufnahme direkt vor Erfrierung bei 50facher Vergrößerung Abbildung 8: Veranschaulichung der Auswahl der ROI Abbildung 9: Skizze des Versuchsaufbaus Abbildung 11: Übersichtsaufnahmen zur Dokumentation der makroskopisch sichtbaren Veränderungen am Mausohr Abbildung 12: Post-traumatischer Verlauf in den ersten Minuten Abbildung 13: Nicht perfundiertes Areal Abbildung 14: Fotografische Daten des NPA bei 50-facher Vergrößerung Abbildung 15: Fotografische Dokumentation des NPA bei 120-facher Vergrößerung Abbildung 16: Funktionelle Gefäßdichte Abbildung 17: Gefäßdurchmesser der Arteriolen Abbildung 18: Gefäßdurchmesser der Venolen Abbildung 19: RBCV in Arteriolen Abbildung 20: RBCV in Venolen Abbildung 21: Ödembildung Abbildung 22: Rollende Leukozyten Abbildung 23: Adhärierende Leukozyten Abbildung 29: Entwicklung des NPA bei Erfrierung und Verbrennung Abbildung 30: Ödembildung bei Erfrierung und Verbrennung Abbildung 31: Adhärierende Leukozyten bei Erfrierung und Verbrennung iii

7 Anhang Tabelle A-1: Messwerte der mikrozirkulatorischen Untersuchungen iv

8 Abkürzungsverzeichnis A D dne dve FITC FGD H kda KG KOF L LEI MAK MAP ml MW MZV ne NPA RBCV Rh6G ROI s V VD ve VK Arterie Durchmesser direkt nach Erfrierung direkt vor Erfrierung Fluoro-Iso-Thio-Zyanat funktionelle Gefäßdichte Stunde Kilo Dalton Körpergewicht Körperoberfläche Leukozyten Leukozyten-Endothelzell-Interaktion minimale alveolare Konzentration mittlerer arterieller Druck Milliliter Molekulargewicht (molecular weight) Mikrozirkulationsveränderungen nach Erfrierung nicht perfundiertes Areal Erythrozytengeschwindigkeit (red blood cell velocity) Rhodamin-6-G Region of interest Sekunde Geschwindigkeit (velocity) Vasodilatation vor Erfrierung Vasokonstriktion v

9 Zusammenfassung Angesichts des mangelhaften Wissensstandes und einer weithin beobachteten Zunahme der Prävalenz von Erfrierungen, insbesondere unter Obdachlosen, bei in Kühlhäusern Arbeitenden und unter Risikosportlern, soll in der vorliegenden Arbeit ein Versuch unternommen werden, neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie der Erfrierung anhand eines Tiermodells zu gewinnen. In Ermangelung eines geeigneten Erfrierungsmodells entwickelten wir ein neues, an einem etablierten Verbrennungsmodell unserer Gruppe orientiertes Modell am Ohr der haarlosen Maus. Die Erfrierung sollte kontaktlos erzeugt werden, innerhalb von 14 Tagen ausheilen und reproduzierbar sein. Das Ziel der Arbeit war eine intravitale fluoreszenzmikroskopische Beobachtung der Mikrozirkulationsveränderungen (MZV), der Leukozyten- Endothelzell-Interaktion (LEI) und der Angiogenese über den kompletten Entstehungsund insbesondere den Heilungsprozess hinweg. An neun männlichen haarlosen Mäusen wurden die MZV und LEI über den Zeitraum von 14 Tagen anhand der folgenden sieben Messparameter beobachtet: 1 nicht perfundiertes Areal (NPA) in mm 2, 2 funktionelle Gefäßdichte (FGD) in cm/cm 2, 3 Gefäßdurchmesser von Arteriolen und Venolen in mm, 4 Flussgeschwindigkeit in Arteriolen und Venolen (RBCV) in mm/s, 5 Ödembildung in Form der relativen Leakage, 6 Anzahl rollender Leukozyten (Roller), und 7 Anzahl an der Gefäßwand adhärierender Leukozyten (Sticker). In Form digitaler Video- und Fotoaufnahmen wurden die Beobachtungen aufgezeichnet und die gewonnenen Erkenntnisse mittels intra- und interindividueller Vergleiche der Messwertveränderungen statistisch ausgewertet. Die Erzeugung der Erfrierung war zuverlässig und gut reproduzierbar bei äußerst geringer Stressbelastung der Tiere. Weitere Vorteile sind der geringe materielle Aufwand und die unkomplizierte Tierhaltung. Die sowohl intraindividuellen, anhand der Basiswerte jedes einzelnen Tieres, als auch interindividuellen Vergleichsmöglichkeiten zwischen den einzelnen Tieren der Versuchstiergruppe gestatten eine verlässliche Interpretation der Messwerte bei vergleichsweise geringer Versuchstierzahl. 1

10 Nach den gewonnenen Ergebnissen führt eine tiefe Erfrierung, wie sie im Modell erzeugt wurde, zum vollständigen Zusammenbruch der Mikrozirkulation im Läsionsareal. Diese regeneriert innerhalb des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen komplett durch Angiogenese vom Rand der Läsion her. Die Änderungen der Gefäßdurchmesser ließen klare Tendenzen erkennen. In Arteriolen erfolgte die reaktive Dilatation früher und bildete sich bereits nach Tag 1 wieder zurück, die Venolen reagierten langsamer und wiesen bis Tag 7 eine Dilatation auf. Die intravasale Flussgeschwindigkeit (RBCV) wies sowohl im arteriellen als auch im venösen Bereich statistische Signifikanzen auf, die sich von Tag 1 an plateauförmig weit über dem Ausgangswert hielten, lassen auf einen auch an Tag 14 noch bestehenden reaktiven Endothelschaden schließen. Die Zahl der rollenden Leukozyten als ein Marker für aktive Entzündungsprozesse blieb im posttraumatischen Beobachtungszeitraum auf konstant hohem Niveau und lag deutlich über dem Ausgangswert. Die Anzahl der adhärierenden Leukozyten kehrte an Tag 14 nahezu zum vor der Erfrierungssetzung gemessenen Wert zurück, eine anfangs gesteigerte Migration der immer noch in erhöhter Zahl vorhandenen Leukozyten ins Gewebe findet zu diesem Zeitpunkt anscheinend nicht mehr statt. Nach Auswertung unserer Resultate kommen wir zu dem Schluss, dass bei Erfrierungsverletzungen auch nach makroskopischer Abheilung und erfolgter Neovaskularisation noch Entzündungsprozesse im Sinne von LEI ablaufen und der Endothelschaden persistiert. Dies kann eine Erklärung für die klinisch häufig beobachteten Spätfolgen schwerer Erfrierungen sein, welche noch Monate nach der primären Verletzung zu Amputationen führen können [8, 22, 24, 94, 97]. Das vorgestellte Modell stellt eine neuartige Möglichkeit zur Erforschung mikrovaskulärer Prozesse in Erfrierungswunden dar und unsere Gruppe plant, es in naher Zukunft für weiterführende Studien zu verwenden, um die gewonnenen Kenntnisse zu vertiefen und das Feld der Erforschung der Pathophysiologie der Erfrierung zu erweitern. Auf mikrovaskulärer Ebene wie auch im makroskopisch sichtbaren Verletzungs- und Heilungsprozess weisen die beobachteten Veränderungen erhebliche Unterschiede zu von unserer Gruppe an ähnlich gestalteten Verbrennungsmodellen beobachteten Werten auf und eine Gleichsetzung der pathophysiologischen Vorgänge sollte daher neu überdacht werden. Hier werden weiterführende Studien an diesem Modell sicherlich noch einen bedeutsamen Wissenszuwachs erbringen. 2

11 1 Einleitung Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Kriterien für die zu erzeugende Erfrierung: Kontaktlose Erzeugung Lokal begrenzte Läsion mit geeigneten Dimensionen für eine Beobachtung der kompletten Wunde Hohe Reproduzierbarkeit durch konstante Dimensionen und Tiefe Vollständige Abheilung der Läsion innerhalb des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen Geringe Stressbelastung der Tiere zur Vermeidung systemischer Einflüsse auf die zu messenden Parameter Etablierung des Modells: Anwendung des bekannten Tiermodells des Ohrs der haarlosen Maus auf ein Erfrierungsmodell Verlässliche Beobachtung und Messung der Mikrozirkulationsparameter und der LEI im Verlauf der Wundheilung per intravitaler Fluoreszenzmikroskopie Kälteverletzungen und insbesondere ihre schwerste lokale Form, die Erfrierung, wurden in der Vergangenheit als typisch für Kriegszeiten und Angehörige des Militärs angesehen. Heutzutage steigt allerdings auch ihre Prävalenz in der Zivilbevölkerung signifikant an [29, 70]. Das sozusagen typische Profil für ein Erfrierungsopfer ist aktuell das eines obdachlosen Alkoholabhängigen. Allerdings spielen zunehmend Freizeitbeschäftigungen im Outdoorsport eine wichtige Rolle [37, 80, 83]. Hinzu kommen eher seltenere, aber nicht zu vernachlässigende Arbeitsunfälle in Kühlhäusern und Laboren [69, 89] und die unsachgemäße Anwendung von medizinischen Kühlpacks [48] und Eissprays. Auch Erfrierungen als Folge von Unfällen mit Flüssiggas werden in der Literatur beschrieben [71] 1

12 Abbildung 1: Klinisches Fallbeispiel Erfrierungen am vierten und fünften Finger der rechten Hand bei einem Kühlhausarbeiter Bis heute sind die pathophysiologischen Prozesse der Erfrierungsentstehung noch nicht gänzlich geklärt. In Konsequenz daraus kann daher aktuell nur eine symptomatische Therapie, jedoch keine zielgerichtete, den langfristigen Schaden eindämmende Behandlung erfolgen [46, 70, 80]. Die weitere Erforschung der pathophysiologischen Vorgänge scheint daher große Möglichkeiten zur Verbesserung der Therapie von Erfrierungspatienten zu bieten. Unserer Auffassung nach können die bisher existierenden Tiermodelle [63, 75, 84, 93, 101] nicht für Studien der pathophysiologischen Grundlagen der Erfrierung mittels Beobachtung der hierfür relevanten MZV und der LEI in Betracht gezogen werden. Hauptkritikpunkt an den etablierten Formen der Traumasetzung ist hierbei der in nahezu allen uns bekannten Modellen vorhandene direkte mechanische Kontakt zum Kälteelement, der verhindert, dass der entstandene Gewebsschaden in seiner Totalität auf die Kälteverletzung zurückführbar ist. In Ermangelung existierender Modelle zur Erzeugung einer solchen reproduzierbaren kontaktlosen Erfrierung entwickelten wir daher ein neues Modell in Anlehnung an ein bereits in unserer Arbeitsgruppe entwickeltes Verbrennungsmodell. Die 2

13 hierbei erzeugte Verletzung sollte innerhalb der Beobachtungsdauer von 14 Tagen vollständig abheilen. Es lag in unserer Absicht, eine tiefe, schwere Erfrierung entstehen zu lassen, die mit einer drittgradigen Verbrennung vergleichbar wäre. Dies gelang uns mit dem in dieser Arbeit vorgestellten Gasstrommodell unter Verwendung eines 1,5s langen Stickstoffdampfimpulses. Die Beobachtung der Mikrozirkulationsparameter und LEI erfolgte direkt vor Setzen des Traumas und an vier posttraumatischen Zeitpunkten an den Tagen 1, 3, 7 und 14. 3

14 1.1 Die Erfrierung Kälteverletzungen resultieren entweder aus dem direkten Gefrieren von Gewebe oder sie entstehen unter länger einwirkenden, nicht den Gefrierpunkt unterschreitenden Kältebedingungen. Beim direkten Gefrieren des Gewebes kommt es zur echten Erfrierung, zur Congelatio. Frostbeulen (Perniones) und auch der so genannte Fußbrand (engl. trench foot) stellen hingegen Mischformen eines Schadens aufgrund tiefer aber oberhalb des Gefrierpunkts liegender Temperaturen in Kombination mit hoher Feuchtigkeit dar [34, 46]. Die Erfrierung ist die schwerwiegendste Form der lokalen Kälteschädigung. Sie bildet sich, wenn Gewebe Temperaturen unter Null Grad Celsius ausgesetzt ist und es zum tatsächlichen Gefrieren desselbigen kommt. Zu Beginn entsteht der Schaden im Gewebe durch Bildung von Eiskristallen auf zellulärem Niveau. Dies führt zur Dehydrierung der Zelle und extrazellulär zu mikrovaskulären Okklusionen. Die existierenden Theorien zur Pathophysiologie werden in einem eigenen Abschnitt genauer erläutert (siehe 2.2). Die traditionelle Einteilung der Erfrierung kannte ursprünglich vier Schweregrade in Abhängigkeit der Präsentation der Wunde nach Wiedererwärmung [21]. Sie wurde von einigen Autoren aufgrund fehlenden prognostischen Nutzens und identischen Therapieansatzes unabhängig vom initial vermuteten Grad des Schadens durch ein simples System der Unterscheidung zwischen tiefen und oberflächlichen Erfrierungen ersetzt [65, 70{Patel, 2008 #201, 76]. In der vorliegenden Arbeit wird ebenfalls diese klinisch orientierte Art und Weise der Einteilung verwendet: Hiernach weisen oberflächliche Erfrierungen eine mehr oder weniger prominente Hyperämie und auch Ödembildung auf. Es können auch große, mit klarer Flüssigkeit gefüllte Blasen entstehen. Folgeschäden sind nicht zu erwarten und der Heilungsprozess verläuft schnell und unkompliziert. Bei schweren Erfrierungen hingegen kommt es zur Nekrose in Haut und subkutanem Gewebe. Die sich hierbei bildenden hämorrhagischen Vesiculae unterscheiden sich durch ihre dunkelrote Färbung und ihren im Allgemeinen kleineren Durchmesser von den Blasen der leichten Erfrierung, oft tritt zusätzlich ein Gangrän auf. Zu Beginn präsentiert sich der erfrorene Körperteil meist hart, kalt und weiß und es besteht eine Anästhesie. Das Resultat kann ein vollständiger Gewebsverlust sein [34, 46]. 4

15 1.2 Pathophysiologie der Erfrierung Bisherige Beobachtungen lassen auf zwei verschiedene Komponenten der Erfrierungsverletzung schließen. Es handelt sich um die initiale Verletzung, die durch den Prozess des Gefrierens entsteht und um den später nach Wiedererwärmung auftretenden Reperfusionsschaden[70]. Die erste Antwort des Gewebes auf eine Unterkühlung ist die Vasokonstriktion (VK) und hiermit verbunden die Bildung arteriovenöser Shunts. Die VK wird intermittierend von einer Vasodilatation (VD) abgelöst. Dieser Prozess wird auch als Hunting-Response bezeichnet [25]. Die physiologische Funktion dieser alternierenden Zyklen besteht darin, eine ausreichende Durchblutung des betroffenen Areals zu ermöglichen, ohne einen Abfall der Körperkerntemperatur zu riskieren. Bei längerer Kälteexposition dagegen versagt dieser Prozess. Während des Wiedererwärmungsprozesses bilden sich Aggregate von Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten und führen zu einer so genannten patchy thrombosis der Mikrozirkulation. Man nimmt an, dass die Akkumulation dieser Blutkörperchen eine Freisetzung von toxischen freien Sauerstoffradikalen, Arachidonsäuremetaboliten wie PGF 2α und Thromboxan A 2 und anderen Mediatoren bewirkt. Hierdurch werden sowohl die bestehende VK als auch die Aggregation von Thrombozyten und Leukozyten intensiviert [34, 70, 75]. Der exakte Mechanismus, der schließlich zum Gewebstod nach Erfrierung führt, bleibt jedoch unzureichend erforscht und definiert. Gefäßverletzungen traten in bisherigen Untersuchungen hauptsächlich in Form von Endothelzellschädigung und daraus resultierendem interstitiellem Ödem auf, aber nicht als Gefäßthrombosen, die den Ausgangspunkt des Wiedererwärmungsschadens darstellen könnten [63, 105]. Experimente mit monoklonalen Antikörpern, die die Neutrophil-Endothelzell-Interaktion und die Neutrophil-Neutrophil- Interaktion beeinflussen, lassen darauf schließen, dass ein wichtiger Teil der schweren Kälteverletzung durch Neutrophilen-Mediatoren bewirkt werden könnte [63]. Die Schlussfolgerung aus diesen Beobachtungen ist, dass ein Grossteil der Schädigung bei einer schweren Erfrierung im Verlauf des Wiedererwärmungs- und Reperfusionsprozesses entsteht und vor allem, dass noch viele Unklarheiten bestehen bleiben und genauere Beobachtungen der tatsächlich stattfindenden pathologischen Prozesse unabdingbar sind. 5

16 Zudem gibt es zur klinischen Anwendung dieser Erkenntnisse zum jetzigen Zeitpunkt keine Untersuchungen. Aktuelle Therapieansätze werden im folgenden Absatz beschrieben. 1.3 Aktuelle Therapieempfehlungen Initial sollte der Patient aus der widrigen Umgebung entfernt und die betroffenen Körperteile vor weiterem Schaden geschützt werden. Reiben oder Beüben des geschädigten Gewebes verbessert die Durchblutungssituation nicht und erhöht nur das Risiko weiterer Kälteschädigung oder kann zu mechanischen Traumata führen. Da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Gewebsschädigung verstärkt [66], sollte der Patient bevorzugt definitiven Schutz und sofortige Behandlung suchen und das Gewebe nicht in widriger Umgebung aufwärmen, wenn das Risiko einer erneuten Kälteexposition besteht [12]. Die Notfallbehandlung muss sich zuerst auf die grundlegenden ABC-Maßnahmen konzentrieren. Eine systemische Hypothermie sollte diagnostiziert und behandelt werden. Die Rehydrierung mit warmen Flüssigkeiten ist einen wichtigen Teil der Erstversorgung. Da der Wiedererwärmungsprozess äußerst schmerzhaft sein kann, empfiehlt es sich Wert auf eine ausreichende Anästhesierung zu legen. Eine adäquate Methode ist das Eintauchen des verletzten Gewebes in ein C warmes Wasserbad. Der Wiedererwärmungsprozess sollte zwischen 30 und 45min dauern und ist abgeschlossen, wenn eine deutliche Rötung der betroffenen Region als Zeichen einer wiederhergestellten Durchblutung zu beobachten ist. Betroffene Hautareale sollten sorgfältig gereinigt und an der Luft getrocknet werden. Eine Hochlagerung der betroffenen Extremität ist notwendig, um Ödembildung zu vermeiden. Bei nicht bestehendem Impfschutz ist eine Tetanusauffrischung angebracht. Um einer Marzerierung der Haut vorzubeugen, sollten sterile Baumwollpads zwischen Fingern und Zehen platziert werden. Eine Infektion der Wunden oder weitere Abrasion sowie Druckläsionen sind unter allen Umständen zu vermeiden [34]. Eine Antibiotikatherapie wird erst bei tatsächlich vorhandener Infektion empfohlen [77]. Zahlreiche Substanzen wurden bereits erprobt, um Thrombosen und Gefäßwandverletzungen vorzubeugen mit dem Ziel, den im Laufe des Wiedererwärmungsprozesses entstehenden Gewebeschaden zu minimieren. Leider waren bisher nahezu alle Versuche erfolglos. Kürzlich veröffentlichte Studien scheinen allerdings den Nutzen einer frühen thrombolytischen Therapie zur Verhinderung beziehungsweise Minimierung weiteren Gewebsscha- 6

17 dens zu belegen. Die Behandlung mit tpa (tissue plasminogen activator) führte in einer von Bruen et al. durchgeführten Studie zu einer signifikanten Reduzierung der Amputationsrate [22, 94]. Andere Versuche mit der intraarteriellen Applizierung von vasodilatatorisch wirksamen Substanzen führten nicht zu signifikanten Verbesserungen der natürlichen Entwicklung der Erfrierung. Ebenso gibt es bisher keinen Beleg in Form prospektiver randomisierter Studien für die oft postulierte Wirksamkeit eines Sympathikusblocks oder einer chirurgischen Sympathektomie [17]. Einige Studien deuten sogar auf negative Auswirkungen dieser Therapieversuche hin, die unter Umständen zu einer weiter proximal erfolgenden Demarkierung führen können [68]. Nach Beendigung des Wiedererwärmungsprozesses ist ein Therapieziel die Verhinderung weiterer Verletzungen, während die Demarkierung des irreversibel geschädigten Gewebes abgewartet werden muss. Im Allgemeinen wird ein stationärer Aufenthalt empfohlen. Das betroffene Gewebe sollte ein- bis zweimal am Tag in warmen Bädern (38 C) gesäubert werden. Unverletzte Blasen sollten intakt belassen werden, da sie für die Dauer von sieben bis zehn Tagen einen sterilen biologischen Verband und damit Schutz für die darunter stattfindende Epithelisierung bieten. Nach Abschwellen des Ödems können betroffene Extremitäten beübt werden. Die Physiotherapie sollte ebenfalls im warmen Wasserbad beginnen. Das Rauchen ist aufgrund seiner vasokonstriktorischen Wirkung absolut kontraindiziert [76]. Die therapeutische Nutzung von Aloe Vera (ein Thromboxanhemmer) und nonsteroidalen Entzündungshemmern hat einen theoretischen Hintergrund, denn es wurden Metaboliten der Arachidonsäure in den Blasen von Erfrierungswunden gefunden [39]. In Studien konnte unter Anwendung von Pentoxifilin und Aloe Vera ein positiver Effekt auf Gewebsverlust und Dauer des Krankenhausaufenthaltes nachgewiesen werden [64]. Da die tatsächliche Tiefe des Gewebeschadens bei Kälteverletzungen sehr schwer zu bestimmen ist, wird zur Behandlung eine konservative Herangehensweise empfohlen [34, 77]. Eine allgemeine Regel empfiehlt in Abwesenheit von Infektionen verbunden mit Sepsis eine eventuell notwendige Amputation erst nach zwei bis drei Monaten durchzuführen. Die natürliche Entwicklung einer tiefen Erfrierung an den Extremitäten beinhaltet eine graduelle Demarkation des Wundrandgebietes mit trockenem Gangrän oder Mumifizierung, welche das nekrotische Gewebe klar abgrenzt. Häufig ist der definitive Gewebsverlust wesentlich geringer als zu Beginn erwartet. In einer Serie von Patienten aus Alaska 7

18 benötigten nur 10,5% der Patienten tatsächlich eine Amputation. Die Notwendigkeit eines Notfalleingriffs besteht nur selten, allerdings sollte eine enge Überwachung während des Wiedererwärmungsprozesses beibehalten werden um bei einem eventuell auftretenden Kompartmentsyndrom rechtzeitig eine Fasziotomie einleiten zu können. Offene Amputationen sind bei Patienten mit persistierenden Infektionen und therapierefraktärer Sepsis indiziert. Mills et al. zeigten 1993 [67], dass übereilte Amputationen bei weitem den größten Beitrag zu schlechten Therapieergebnissen leisten. Technetium 99m-Methylen-Biphosphat-Knochen-Scans haben viel versprechende Ergebnisse bei der Nekrosenfrüherkennung in Knochen und Weichteilgewebe gezeigt. Dies gilt ebenso für die Magnetresonanztomographie [8, 24, 59]. Erfrorenes Gewebe erholt sich nur selten vollständig. Eine graduelle Kältesensibilität bleibt konstant bestehen. Häufige Folgeerscheinungen sind weiterhin: Hyperhidrose (bei bis zu 72% der Patienten), Neuropathie, verminderter Nagel- und Haarwuchs und ein persistierendes Raynaud-Phänomen in der betroffenen Region [81]. Einmal betroffenes Gewebe besitzt ein erhöhtes Risiko für neuerliche Kälteschädigung und sollte bei nicht zu vermeidender Kälteexposition sorgfältig geschützt werden [34]. Nur wenige Therapien führen zu einer signifikanten Besserung der häufig beobachteten chronischen Symptome nach Kälteverletzung. Adrenerge Alpha- und Beta-Blocker, Kalzium-Kanal-Blocker, tropische und systemische Steroidapplikation sowie eine große Anzahl von Hausmittelchen konnten nur in Einzelfällen deutliche Verbesserungen bewirken, ohne jedoch ihre Wirksamkeit in klinischen Studien unter Beweis stellen zu können [46]. 8

19 2 Material und Methoden 2.1 Die haarlose Maus Die haarlose Maus (SKH-1/hr), wurde 1926 per Zufall in einem Londoner Zoo entdeckt. Ihr genetischer Defekt beschränkt sich auf ihr Erscheinungsbild. Bei Jungtieren setzt ab dem zehnten Tag post partum der Ausfall der ursprünglich normal anmutenden Behaarung ein. Innerhalb der folgenden Woche verlieren sie ihr Haarkleid vollständig, die leeren Haarfollikel bleiben erhalten. Die Ursache ist ein Defekt auf Chromosom 14. Abbildung 2: Haarlose Maus SKH-1/hr (mit freundlicher Genehmigung von Dr. med. Ole Goertz) Für unseren Versuch wurden männliche Tiere im Alter von vier Wochen mit einem durchschnittlichen Gewicht von 16g (14g-18g) vom Züchter bezogen (Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld). Die Erfrierung wurde bei einem Gewicht von ca. 19g (18,5-20,1g) gesetzt und die Beobachtungsdauer betrug 14 Tage. Die Basisaufnahmen und das Setzen der Erfrierung wurden an Tag 0 durchgeführt, die intravitalmikroskopischen Messungen an den Tagen 1, 3, 7 und 14 nach Erfrierung. Während der Versuchsdauer waren die Tiere, um Bisswunden und somit eventuelle Verfälschungen der Wundheilungsparameter zu vermeiden in Einzelhaltung untergebracht. Diese erfolgte in Standard-Polycarbonat-Käfigen (45 cm x30 cm, Ebeco, Castrop-Rauxel) und bei Zugang zu Nahrung (SSNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest) und Trinkwasser ad libitum. Der 12-Stunden-Tagesrhythmus der Tiere wurden eingehalten. Da eine kontinuierliche Gewichtszunahme beziehungsweise deren Ausbleiben als guter Stressindikator bei Versuchstieren angesehen wird, wurden unsere Tiere täglich gewogen. Wir verglichen die Gewichtsentwicklung mit Tieren aus einer Kontrollgruppe. Die Gruppe der Versuchstiere und die der Kontrollgruppe, deren zugehörige Tiere außer des täglichen Wiegevorgangs keinerlei Manipulation ausgesetzt waren, zeigten bis auf einen geringen initialen Wachs- 9

20 tumsrückstand der Tiere aus der Versuchsgruppe kaum Unterschiede. Eine kontinuierliche Gewichtszunahme war auch bei den Versuchstieren jederzeit zu beobachten. 2.2 Die Anatomie des Ohres der haarlosen Maus Abbildung 3: Das Ohr der haarlosen Maus Oben: Basisaufnahme vor dem Trauma. Unten: Aufnahme direkt nach dem Trauma mit deutlich sichtbarer Gefäßdilatation in der Peripherie und Vasokonstriktion im Erfrierungsareal (schwarzer Kreis) Als Versuchsobjekt diente das Ohr der haarlosen Maus (SKH-1/hr). Aufgrund seiner prominenten Gefäße und der vor allem bei jungen Tieren sehr transparenten Haut, eignet es sich hervorragend für fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zur qualitativen und quantitativen Messung der Mikrozirkulation der Haut [6, 7, 15, 16, 28, 33, 47, 51]. 10

21 Die Ohrfläche entspricht ca. 6-7% der Körperoberfläche der Tiere [7, 35]. Versorgt wird das Ohr über drei bis vier aus jeweils Arteriole, Venole und Nerv bestehende Gefäßnervenbündel. Diese treten an der Basis ein- bzw. aus. Der Verzweigung und Verjüngung der Arteriolen folgend entsteht eine Einteilung in Gefäße erster bis vierter Ordnung. Die basisnahen Arteriolen erster Ordnung messen am Ohransatz im Durchmesser 50-60µm, die präkapillären, peripher gelegenen Arteriolen vierter Ordnung nur 10-15µm. Die Venolen werden nach demselben Prinzip eingeteilt. Der postkapillär beobachtete Durchmesser von Venolen vierter Ordnung von etwa 15µm steigt in deren Verlauf auf Durchmesser von 130µm an der Ohrbasis an. Arteriöses und venöses Gefäßsystem werden von Kapillaren mit einem Durchmesser von ca. 4-8µm verbunden. Im Korium entsteht so ein die Haarfollikel umspinnendes Netzwerk [35]. In der Subkutis liegt der aus Lipochondrozyten aufgebaute Ohrknorpel. Er stellt ein Stützgerüst dar und gibt dem Ohr seine dorsal konvexe Form. Er weist einen von einer dünnen Plasmamembran umhüllten Lipidtropfen auf und wird in seinem Verlauf von Fettzellen und Gefäßen unterbrochen [6]. Abbildung 4: Histologischer Aufbau des Ohrs der haarlosen Maus Querschnitt bis zur Knorpelschicht (Mitte des Ohres) eines physiologischen Ohres der haarlosen Maus in HE-Färbung. (C = Chondrozyt, D = Dermis, E = Epidermis, G = Gefäß, M = Muskulatur) (verwendet mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ole Goertz) 11

22 2.3 Intravitale Fluoreszenzmikroskopie Mikroskop Unsere intravitalmikroskopischen Untersuchungen wurden mit Hilfe eines Zeiss Materialmikroskops (Axiotech Vario 100, Zeiss, Göttingen) durchgeführt. Dieses war mit einer stufenlos regelbaren Quecksilberdampf-Kurzbogen-Lampe ausgestattet (HBO 103 W/2, Zeiss, Göttingen). Für die Fluoreszenzmikroskopie nutzten wir zwei verschiedene Filtersets, die in den Reflektorschieber eingebracht wurden und je nach verwendetem Fluoreszenzfarbstoff in den Strahlengang geschoben werden konnten. Filterset 1 bestand aus einem Standardfilterset für FITC (Zeiss Filterset 9, nm, FT 510, LP 520, Zeiss, Göttingen), Filterset 2 aus einem Standardfilterset für Rhodamin-6-G (Zeiss Filterset 15, BP 546, FT 580, LP 590). Der Objektivrevolver des Mikroskops war mit vier Objektiven bestückt. Für die Übersichtsaufnahmen verwendeten wir ein Objektiv mit vierfacher Vergrößerung (4x/0.10, Achroplan, Carl Zeiss, Göttingen). Ausgehend von der Übersicht nutzten wir je nach Fragestellung Wasserimmersionsobjektive mit verschiedenen Vergrößerungen: Für die Untersuchung und Aufnahmen der Mikrozirkulation entweder eines mit zehnfacher Vergrößerung (10x/0.30 W, Achroplan, Ph1, Zeiss, Göttingen) oder mit 20facher Vergrößerung (20x/0.50 W, Achroplan, Ph2, Zeiss, Göttingen) und für die Untersuchung der Thrombozyten bzw. der LEI eines mit 40facher Vergrößerung (40 x/0.75 W, Achroplan, Ph2, Zeiss, Göttingen). Für die Fotoaufnahmen konnte mit Hilfe einer Schubstange am Fototubus von visueller Beobachtung durch das binokulare Okular auf Mikrofotografie umgeschaltet werden. Über verschiedene Adapter konnte am Fototubus wahlweise die im folgenden Absatz beschriebenen digitalen Spiegelreflex- bzw. Videokameras angekoppelt werden Kameras Video Über einen speziellen Adapter (Mikro-Adapter 0,5x, 1/2-1/3 C-Mount/CZ-Schnittstelle, AVT Horn, Aalen) mit einer 0,5fachen Vergrößerung war eine sehr lichtsensitive und hochauflösende Schwarz-Weiß-CCD-Videokamera (AVT-BC 71, AVT Horn, Aalen; CCD=charge coupled device) an unser Mikroskop gekoppelt. Die Bilder wurden direkt auf einem Monitor (12, PVM-1453 MD, HR Trinitron Color-Videomonitor, Sony, Köln) sichtbar gemacht. Zur digitalen Speicherung und Analyse der Bilder war an die Kamera ein 12

23 Analog/Digital-Wandler (MovieBox DV, Pinnacle Systems, Mountain View, California) angeschlossen und dieser an einen Computer (Acer Extensa Laptop, Acer, Ahrensburg, Deutschland). Als digitales Speichermedium diente eine externe USB-Festplatte. Zur Aufnahme und zur Bearbeitung der Videos nutzten wir das Programm Pinnacle Studio (Version 8.3, Pinnacle Systems, Mountain View, California). Fotografie Sämtliche Fotografien wurden mit einer digitalen Spiegelreflexkamera aufgenommen (Canon 30 D, Canon, Krefeld, Deutschland). Die Kamera wurde für die intravitalmikroskopischen Aufnahmen über einen geeigneten Adapter an das Mikroskop gekoppelt. Abbildung 5: Schematischer Aufbau des intravitalmikroskopischen Arbeitsplatzes Fluorochrome Für die intravitale Fluoreszenzmikroskopie nutzt man die physikochemischen Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorochrome). Diese können von Licht mit einer für den Farbstoff charakteristischen Wellenlänge zum leuchten bzw. fluoreszieren gebracht werden. Durch die Bestrahlung mit Licht absorbiert das Fluorochrom Energie, wird angeregt und damit auf eine höhere Energieebene gehoben. In diesem angeregten Zustand verbleiben die Moleküle nur für den Millionstel Bruchteil einer Sekunde und kehren dann unter Aussendung eines Photons wieder in den Ausgangszustand zurück. Fluoreszenzfarbstoffe erlauben in der Mikrozirkulationsforschung durch Kontrastierung eine direkte, intravitale Beurteilung vieler mikrozirkulatorischer Parameter, der Hämodynamik und der Zell-Zellund Zell-Endothelzell-Interaktionen. 13

24 FITC-Dextran Als Fluoreszenzfarbstoff wurde für die Messung der mikrozirkulatorischen Parameter Fluoreszein Isothiozyanat (FITC) verwendet, mit dessen Hilfe eine Kontrastanhebung zwischen Intra- und Extravasalraum erzielt wurde. FITC-Dextran ist aus zwei Molekülen aufgebaut: dem eigentlichen Fluoreszenzfarbstoff FITC und Dextran. Dextrane sind hochmolekulare, neutrale Biopolysaccharide auf der Basis von Glucose-Monomeren. Sie werden von Bakterien der Gattung Leucostonoc mesenteroides durch enzymatische Spaltung von Saccharose gebildet. FITC ist zufällig an die Hydroxylgruppen des Dextrans konjugiert und über eine Thiocarbamoylbindung praktisch irreversibel gebunden. Da FITC- Dextran eine gute Wasserlöslichkeit besitzt und fast keine Interaktionen mit körpereigenen Proteinen eingeht ist es für intravitalmikroskopische Untersuchungen sehr gut geeignet [85]. Es besitzt ein Exzitationsmaximum bei 490 nm und ein Emissionsmaximum von 520 nm. In unseren Versuchen verwendeten wir einprozentiges FITC-Dextran (Sigma, Deisenhofen) mit einem Molekulargewicht von 150 kd, gelöst in 0,9% NaCl-Lösung, welches bei -20 C lichtgeschützt aufbewahrt wurde. Als vermutlich nicht toxisch wird 0,15 mg FITC- Dextran/kg KG angegeben [87]. Rhodamin-6-G Zur Darstellung der Leukozyten verwendeten wir Rhodamin-6-G (Sigma, Deisenhofen). Dieser Farbstoff wurde 1941 erstmals beschrieben [45]. Nach intravasaler Gabe kommt es zu einer Anfärbung von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten [4]. Rhodamin-6-G liegt bei physiologischem ph-wert positiv geladen vor und ist leicht lipophil. Diese Eigenschaften begünstigen die Aufnahme in die Zelle. Bei Konzentrationen bis zu 10-7 mmol/l akkumuliert die Substanz in den Mitochondrien während bei höheren Konzentrationen auch die Membranen des endoplasmatischen Retikulums angefärbt werden [11]. Die Anreicherung von Rhodamin-6-G in den Mitochondrien lässt sich durch die negative Ladung innerhalb der mitochondrialen Matrix erklären. Auch die Bildung unlöslicher Salze mit lipophilen Anionen innerhalb der Mitochondrienmembran unterstützt diese Annahme [78]. Rhodamin-6-G besitzt ein Exzitationsmaximum bei 525 nm und ein Emissionsmaximum bei 555 nm. Zur Färbung quasi aller Granulozyten und Monozyten ist eine Konzentration von 0,3 mg/kg KG notwendig [4]. In unseren Versuchen verwendeten wir eine 0,5- prozentige Rhodamin-6-G-Lösung, die lichtgeschützt bei -20 C aufbewahrt wurde. 14

25 2.4 Versuchsdurchführung Übersicht 1. Narkose 2. Vorbereitung des Ohrs 3. Lokalisation eines geeigneten Ortes für die Erfrierung 4. Injektion der Fluoreszenzfarbstoffe 5. Basisaufnahmen bei 50facher Vergrößerung 6. Auswahl der Regions of Interest (ROI) und Basisaufnahmen 7. Erzeugung der Erfrierung 8. Dokumentation der Veränderungen Narkose Für die Narkotisierung der Tiere wurde ein Verdampfer (Vapor 19.3, Drägerwerk, Lübeck) verwendet. Zunächst wurde das Tier zur Einleitung der Narkose unter ein herkömmliches transparentes Plastikgefäß gesetzt und über ein Loch in dessen Decke mit Hilfe des Silikonschlauches das Gasgemisch eingeleitet. Die Isoflurankonzentration betrug bis zum Eintreten der Bewusstlosigkeit 5% des ausströmenden Gasvolumens bei einem Luftstrom von 2,0ml/min für den Sauerstoff und 0,5ml/min N 2 O. Dem narkotisierten Tier wurde im Verlauf des Versuches über eine durch einen Silikonschlauch mit dem Narkosegerät verbundene Atemmaske [33, 91] ein Gemisch aus Isoflurane (Flurene, Abbot, Wiesbaden), N 2 O und Sauerstoff (Air Liquide, Düsseldorf, Germany) zugeführt. Während der Versuchsdurchführung wurden Sauerstoff- und N 2 O-Zufuhr konstant gehalten und die Isoflurankonzentration abhängig von der Reaktion des Tiers auf 1,5 bis 2,5 Volumenprozent herabgesetzt. Die Narkosetiefe wurde vor dem Setzen der Erfrierung durch Beobachtung der Atemregelmäßigkeit und Reaktionen auf Schmerzreize (wie zum Beispiel Pieksen in die Schwanzvene) kontrolliert. Um die Körpertemperatur der Tiere während der etwa 90-minütigen Narkosezeit aufrechtzuerhalten wurde eine unter der Plexiglasplatte befindliche Heizmatte verwendet und die Tiere wurden mit je zwei herkömmlichen Wattetupfern von ca. 5cm 2 bedeckt Vorbereitung des Ohrs Das Ohr des Versuchstiers musste vor Versuchsbeginn ausgelagert werden. Dazu wurden zunächst unter einem Operationsmikroskop (Leica M 651, Leica Mikrosysteme Vertrieb 15

26 GmbH, Bensheim) bei 6-facher Vergrößerung mit mikrochirurgischen Instrumenten (Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) an beiden Seiten der Ohrbasis mit mikrochirurgischem Nahtmaterial (10/0 Ethilon, Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt) Halteschlaufen gelegt. Durch diese wurden monofile Fäden (5/0 Prolene, Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt) gezogen und unter leichtem Zug mit Klebeband auf einer speziellen Acrylglasplatte fixiert, so dass das Ohr plan auflag. Um leichte Unebenheiten des Ohres v. a. im Randbereich zu minimieren, unterspritzten wir es mit einer geringen Menge isotonischer NaCl-Lösung und saugten die Flüssigkeit mit chirurgischen Absorptionsschwämmchen (Art.Nr.: , Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) ab, wodurch sich das Ohr der ebenen Oberfläche der Acrylglasplatte noch besser anlegte. Die Halteschlaufen wurden nach jedem Versuch entfernt, da sich in früheren Versuchsreihen gezeigt hatte, dass die Tiere sich die Schlaufen beim Putzen herausreißen, was zu Entzündungen führte. Dies hätte die von uns gemessenen Parameter stören können Lokalisation eines geeigneten Ortes für die Erfrierung Unter zehnfacher Vergrößerung wurden Fotoaufnahmen des Ohrs gemacht und geeignete Areale für die Traumasetzung bestimmt. Die Läsion wurde ausschließlich im äußeren kaudalen Quadranten des Ohrs gesetzt. Hier weist das Ohr die geringste Dicke auf und gewährleistet so zum einen eine gute Bildqualität und zum anderen eine gute Anpassung an die Oberfläche der Acrylglasplatte. Durch die Wahl der immer gleichen Ohrregion sollten auch zwischen den einzelnen Tieren eventuell auftretende Varianzen in der Ohrdicke minimiert werden. Abbildung 6: Ohr der haarlosen Maus in zehnfacher Vergrößerung mit Erfrierungswunde Links: Erfrierung im Zentrum des roten Kastens. Rechts: in 50facher Vergrößerung das Erfrierungsareal unter dem Fluoreszenzmikroskop. Beide Aufnahmen sind von Tag 1 nach der Erfrierung 16

27 2.4.4 Injektion der Fluoreszenzfarbstoffe Die Injektion der Fluoreszenzfarbstoffe FITC-Dextran und Rhodamin-6-G erfolgte mit einer 1ml-Insulinspritze (29g, 0,33x 12,7mm, Micro-Fine U-40, Becton Dickin-son, Irland) in die laterale Schwanzvene der Tiere. Es wurden mit derselben Spritze 150µl eines Gemisches aus FITC-Dextran und Rhodamin-6-G (Verhältnis 1:1) verabreicht. Für FITC- Dextran betrug die applizierte Menge 0,15mg/kg KG und für Rhodamin-6-G 0,3mg/kg KG. Dies entsprach in beiden Fällen jeweils 75µL der von uns hergestellten Lösungen Anfertigung der Basisaufnahmen Abbildung 7: Basisaufnahme direkt vor Erfrierung bei 50facher Vergrößerung Nach Injektion der Farbstoffe wurden die fluoreszenzmikroskopischen Basisaufnahmen des Ohrs vor Erfrierung bei 50facher Vergrößerung angefertigt Auswahl der Regions of Interest (ROI) und Basisaufnahmen Direkt im Anschluss wurden im Abstand von 1,5 Bildschirmlängen vom Zentrum der Erfrierung bei 120facher Vergrößerung für jedes Ohr sechs gleichmäßig um das Zentrum verteilte ROI ausgewählt. Diese wurden bei 240facher Vergrößerung für die Basisaufnahmen fotografiert. Außerdem wurden Videoloops von 10s mit dem FITC-Filterset und 20s mit zwischengeschaltetem Rhodamin-Filterset aufgenommen. Neben dem konstanten Abstand zum Zentrum der späteren Erfrierung war auch die Existenz von mindestens vier Venolen, vier Arteriolen und vier Kapillararealen in jeder ROI Vorraussetzung für deren Auswahl. Die unterschiedlichen Vergrößerungen wurden verwendet, weil in 120facher Vergrößerung die Wahl des Abstandes besser gelang und die 240fache Vergrößerung später eine bessere Auswertung der Aufnahmen ermöglicht. 17

28 Abbildung 8: Veranschaulichung der Auswahl der ROI Ohr der haarlosen Maus in 50facher Vergrößerung mit Erfrierungsareal und den sechs um das Areal platzierten Regions of Interest (ROI), in denen die Aufnahmen zur Untersuchung der Mikrozirkulation erstellt wurden. 18

29 2.4.7 Erzeugung der Erfrierung Abbildung 9: Skizze des Versuchsaufbaus Im Hintergrund die Pumpe und der Vorratsbehälter, im Vordergrund die narkotisierte Maus mit dem unter der Austrittsöffnung fixierten Ohr. Der Abstand zwischen Ohroberfläche und Austrittsöffnung beträgt 3mm. (Zeichnung von Klaus Rybak) 19

30 Der Aufbau des Erfrierungsapparats gestaltete sich wie folgt: Flüssiger Stickstoff wurde in einem Thermobehälter gelagert (Alladin Stanley, 0,95l). Über Rohrleitungen im Verschlussstopfen konnte mit Hilfe einer Membranpumpe Luft mit Raumtemperatur in das Vorratsgefäß hinein- und durch den entstehenden Überdruck der flüssige Stickstoff über eine zweite Leitung hinausgepumpt werden. Ein an das aus dem Behälter austretende Messingrohr angeschlossener Silikonschlauch leitete den Stickstoff zur Austrittsöffnung, einer Vasofix-VenenVerweilkanüle (20G, Braun, Melsungen), die an einer Präzisionsdrehmechanik (Jettkant, Ruhr-Universität Bochum) über dem Mausohr befestigt war. An der Öffnung der Kanüle trat der hier dampfförmige Stickstoff in Form eines Gasstroms mit einer Temperatur von -195,8 C (+/- 2,7 C) aus. Ein zwischen Schlauchleitung und Kanüle befindlicher Dreiwegehahn ermöglichte ein präzises Ein- und Ausschalten des Dampfstroms auf das darunter aufgespannte Mausohr. Nach ausreichender Vorkühlung des gesamten Leitungsapparates, welche durch einminütiges Pumpen bei voller Leistung und geöffnetem Dreiwegehahn bis zum Erreichen der Tiefsttemperatur an der Austrittsöffnung erfolgte, wurde der Gasstrom unterbrochen und das präparierte Ohr des Versuchstiers in einem Abstand von 3mm unterhalb der Austrittsöffnung platziert. Anschließend wurde die vorher ausgewählte Stelle zur Traumasetzung lokalisiert. Der Gasstrom wurde aktiviert und durch einmaliges Öffnen und Schließen der Strombahn in die Kanüle wurde an der Austrittsöffnung ein Jetimpuls von 1,5s Dauer erzeugt. Das Resultat war eine kreisrunde Erfrierung deren Durchmesser direkt nach Trauma ca. 1,8mm betrug. Die tatsächliche Größe und Tiefe des gesetzten Traumas ließ sich anhand der ersten Beobachtungen bereits bei geringer Vergrößerung recht genau vorhersagen und mittels Nachuntersuchungen an den Folgetagen bestätigen. Eine präzise intravitalmikroskopische Beurteilung des Traumas direkt ne konnte aufgrund der starken reaktiven Ödembildung nicht erfolgen. In die Versuchsgruppe aufgenommen wurden nur Tiere, deren Trauma an Tag 1 eindeutig die gestellten Bedingungen erfüllte. Temperaturmessung an der Austrittsöffnung Die kleinen Dimensionen des Versuchaufbaus und die extremen Temperaturunterschiede zwischen Gasstrom, Ohroberfläche und Umgebung stellten ein physikalisches Problem dar. Sie machten eine direkte Messung der tatsächlich erreichten Temperaturen mit herkömmlichen Thermometern unmöglich. Die in Relation zum Versuchsaufbau relativ große Masse der Messelemente in diesen Geräten und deren damit verbundene Trägheit im Bezug auf Temperaturveränderungen führten zu einer groben Verfälschung der Temperatur- 20

31 messwerte. Daher benutzten wir zur Temperaturbestimmung an der Austrittsöffnung der Kanüle und auch an der Ohroberfläche einen modifizierten Herzkatheter mit Thermoelement (Pressure Wire 5, RADI Medical Systems, Uppsala Schweden). Der sehr kleine und leichte Katheter mit einem Durchmesser von nur 0,36mm war angeschlossen an ein HP3455A Digital Voltmeter (Hewlett-Packard, Loveland, USA). Nach vorheriger Kalibrierung des Messaufbaus, welche durch Eichung in einer Messreihe mit einem Referenzthermometer (PT 1000, Greisinger Electronic, Regenstauf, Deutschland) vorgenommen wurde, konnten so im Versuchsverlauf die Temperaturverhältnisse am Ohr anhand der Skala des Voltmeters genauestens überprüft werden Aufzeichnung der Veränderungen Direkt ne wurden lediglich zur fotografischen Dokumentationen der sich entwickelnden Läsion in den ersten sechs Minuten nach Traumasetzung Aufnahmen angefertigt. Hierzu wurden im Abstand von 5s 80 Bilder in 50facher Vergrößerung mit dem FITC-Filterset aufgenommen. An den posttraumatischen Beobachtungszeitpunkten an den Tagen 1, 3, 7 und 14 wurden die der Messung der MZV dienenden Aufnahmen in Art der Basisaufnahmen wiederholt und die Tiere zum Versuchende an Tag 14 noch in Narkose mit einer Überdosis Penthobarbital getötet Evaluierung der Erfrierung Für eine orientierende Beurteilung genügte ein Vergleich der Ödembildung an Tag 0 direkt ne. Erschien der in den Fotos des Verlaufs sichtbare typische ödematöse Randwall, wurde das Tier im Versuch belassen und über die fluorometrische Bestimmung des NPA an Tag 1 der exakte Durchmesser definiert. Der Abheilungsprozess wurde anhand der Angiogenese verglichen. 2.5 Messung der Mikrozirkulationsparameter Alle Mikrozirkulationsparameter wurden nachträglich offline mittels Videoauswertung der digitalisierten Aufnahmen am Computer gemessen Nicht perfundiertes Areal (NPA) FITC-Dextran als intravasaler Plasmamarker diente zur Kontrastverstärkung zwischen Arealen mit erhaltener Perfusion und dem NPA. Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe von Aufnahmen, die an den Tagen 1, 3, 7 und 14 gemacht wurden. Eine grundsätzlich wünschenswerte und in unserem Erfrierungsmodell ähnlichen Verbrennungsmodellen auch 21

32 durchgeführte Bestimmung des NPA an Tag 0 direkt nach Traumasetzung war aufgrund schlechter Aufnahmequalität bedingt durch extreme reaktive Ödembildung nicht sinnvoll. Der konkrete Messvorgang bestand in einem manuellen mit dem Mauszeiger durchgeführten Nachzeichnen der nicht durchbluteten Fläche am Monitor und einer Auswertung über die Planimetriefunktion von CapImage. Das NPA wurde in mm² angegeben Funktionelle Gefäßdichte (FGD) Um Veränderungen der Gewebsperfusion feststellen zu können wurde der Parameter der FGD bestimmt. In diesem werden die in der jeweiligen ROI zum Untersuchungszeitpunkt auffindbaren Gefäße zusammengefasst. Es wurden sowohl Kapillaren als auch Venolen und Arteriolen dritter und vierter Ordnung miteinbezogen. Der konkrete Untersuchungsvorgang bestand in der Nachzeichnung der vorhandenen Gefäße in der korrespondierenden CapImage-Funktion unter Verwendung von in 240facher Vergrößerung an den Tagen 1, 3, 7 und 14 gemachten Aufnahmen. Das Programm summiert in dieser Funktion die gemessenen Einzelstrecken; als Einheit wird cm pro cm 2 verwendet. Der Gefäßdurchmesser floss nicht in diese Auswertung mit ein Gefäßdurchmesser Bei diesem Parameter handelt es sich um den Innendurchmesser ausgewählter Gefäße. Der Kontrast zwischen FITC-Dextran-markiertem Plasma und der Gefäßwand wurde bei der Messung zur Orientierung genutzt. Eine in CapImage perpendikular zum Gefäßverlauf gezogene Linie, deren Anfangs- und Endpunkt auf der Plasma-Gefäßwand-Grenze lagen, diente zur Messung des Gefäßdurchmessers in µm. Die Messung wurde für jedes Gefäß an exakt derselben Stelle an den bekannten Untersuchungstagen 1, 3, 7, und 14 wiederholt. Eine dreifache Wiederholung jedes einzelnen Messvorgangs und die Bildung des Mittelwerts aus den drei erhaltenen Messwerten dienten der Reduzierung des Messfehlers. Das Durchführen der Messung am bewegten Bild brachte aufgrund hierdurch gegebener besserer Kontrastierung zwischen Plasma und Gefäßwand eine weitere Erhöhung der Messgenauigkeit Erythrozytenflussgeschwindigkeit (RBCV) Auch die Messung der RBCV erfolgte in CapImage. Hierzu wurde am Monitor eine Linie parallel zu den Gefäßwänden zentral in das jeweilige Gefäß gezeichnet. Das Programm wertete mittels der Line-Shift-Diagramm-Methode das Grauwertprofil eines 10s-Loop aus. Eine durch einen Erythrozyten verursachte Plasmalücke stellte sich hier im zugehörigen Diagramm als schräg verlaufende dunkle Gerade dar. Durch automatisches Nachzeichnen 22

33 der Geraden des Diagramms wurde über deren Steigungswinkel die RBCV in mm/s ermittelt. Um eventuelle Messungenauigkeiten zu minimieren, wurde der endgültige Wert durch Mittelung von zehn Einzelmesswerten bestimmt. Durch die Verwendung dreier Messlinien, zwei wandnahe und eine zentrale pro Gefäß, konnte statt des meist zu hohe Werte ergebenden Zentralstroms eine repräsentativere EFG für das ganze Gefäß ermittelt werden. Allerdings lag die Priorität auch bei diesen Messungen auf der Bestimmung relativer Veränderungen und nicht auf der Erfassung absoluter Werte Ödembildung Die Extravasation des Plasmamarkers FITC-Dextran wurde als repräsentativ für die Makromolekulare Leakage und damit für die reaktive Ödembildung im Erfrierungsareal angesehen. Die Bestimmung dieses Parameters erfolgte mittels der Densitometriefunktion von CapImage, wobei hierbei die Fluoreszensintensität eines extravasal eingezeichneten Messfensters mit der eines intravasalen verglichen wurde. Hieraus wurde der Fluoreszenz-Intensitäts-Quotient errechnet: die extravaskuläre Lichtintensität geteilt durch die intravaskuläre Lichtintensität [Ie/Ii] Rollende Leukozyten (Roller) In einem 20s-Loop der unter Rhodamin-6-G-Filter aufgenommenen Videosequenzen wurden die rollenden Leukozyten bestimmt. Als Roller definierten wir Leukozyten, die innerhalb des Messzeitraums eine in CapImage perpendikular zum Gefäßverlauf gezeichnete Linie passierten. Es wurden nur Zellen gewertet, die eindeutig als verlangsamt gegenüber den frei flottierenden Zellen und somit als rollend zu identifizieren waren und die Zellzahl wurde in Zellen pro 20s angegeben Adhärierende Leukozyten (Sticker) Auch für die Zählung der Sticker wurde ein 20s Loop der Rhodamin-6-G-Aufnahmen ausgewertet. Nach demselben Prinzip, wie für die Roller angewandt, wurden hierzu Zellen gewertet, die über den Messzeitraum oder darüber hinaus auf einer Strecke von 100µm innerhalb des jeweiligen Gefäßes am Endothel haften blieben, sich also nicht über diese Strecke hinausbewegten. 23