Protein-NMR. Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

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1 Protein-NMR Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

2 Themenübersicht Termin 1 am : Biochemie von Proteinen (Aufbau, Struktur, gentechn. Herstellung) Termin 2 am : NMR-Experimente I (Labeling,1D/2D/3D-Exp. für Zuordnung und räuml. Erfassung) Termin 3 am : NMR-Experimente II (CS und NOE-basierte Strukturberechnung, prakt. Übung ) Termin 4 am : Spezielle NMR-Strategien (>4D Experimente, spez. Labeling-Strategien, RDCs)

3 Proteine sind Biopolymere

4 Es gibt 20 proteinogene Aminosäuren Säugetiere (inkl. uns) müssen 9 Aminosäuren mit der Nahrung aufnehmen, da sie diese nicht selbst herstellen können. Die meisten Pflanzen und Mikroorganismen sind uns hier überlegen.

5 Proteine bestehen aus Aminosäuren

6 Peptidbindungen bilden das Grundgerüst von Proteinen Peptide (kurzkettig) und Proteine (langkettig) bestehen aus unverzweigten Ketten von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.

7 [-N-Ca-CO-] bildet das konstante Rückgrat von Proteinen Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

8 Die Eigenschaft einer Aminosäure wird durch ihre Seitenkette (hier unpolar) bestimmt

9 Die Eigenschaft einer Aminosäure wird durch ihre Seitenkette (hier polar) bestimmt

10 Die Eigenschaft einer Aminosäure wird durch ihre Seitenkette (hier geladen) bestimmt

11 Aminosäuren sind bei physiologischen ph oft Zwitterionen Oben: Aus Müller-Esterl, Biochemie, 2004 Elsevier GmbH Unten: Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer Entspricht der ph-wert dem isoelektrischen Punkt (pi) ist die Nettoladung = 0. Jede Aminosäure besitzt einen charakteristischen pi Wert.

12 Für jede Aminosäure gibt es einen 1 und 3-Buchstabencode Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

13 Co- und posttranslationale Modifizierung vom Aminosäuren

14 Enantiomere Formen von α-aminosäuren L- und D-Form sind nicht deckungsgleich. Das Cα-Atom bildet das Asymmetriezentrum. Proteine bestehen in der Regel aus L- Aminosäuren. D-Aminosäuren kommen in bakteriellen Zellwänden und als Bestandteil einiger Antibiotika und Pilzgifte vor.

15 Die Mesomerie der Peptidbindung Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

16 Durch den partiellen Doppelbindungscharakter liegen CO-NH in einer Ebene Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer Die Peptidbindung ist nicht frei drehbar und führt (in der Regel) zu einer trans-stellung der übrigen Substituenten. Dadurch wird die Konformation der Polypeptidkette stark eingeschränkt. Die hier gezeigten Werte beziehen sich auf eine vollständig gestreckte Polypeptidkette.

17 Standardwinkel in cis- und trans-konformation

18 Definition der Dihedralwinkel φ (Phi): N-C a ψ (Psi): C a -CO

19 Das Ramachandran-Diagramm zeigt die möglichen Winkelkombinationen φ (Phi): N-C a ψ (Psi): C a -CO Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

20 Sekundärstrukturen: Paralleles und antiparalleles β-faltblatt Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

21 Wasserstoffbrücken stabilisieren das antiparallele β-faltblatt (a) Aufsicht: CO & NH Gruppen sind so ausgerichtet, dass sie aufeinander zeigen (b) Seitenansicht: Die Seitenketten zeigen abwechselnd nach oben und unten (c) Das Faltblatt

22 Das Ramachandran-Diagramm zeigt die möglichen Winkelkombinationen φ (Phi): N-C a ψ (Psi): C a -CO Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

23 Sekundärstrukturen: Rechtgängige α-helix

24 Die Tertiärstruktur bezeichnet die dreidimensionale Struktur eines Proteins Schematische Darstellung von Sekundärstrukturelementen (Gelb: α-helix, Rosa: β-faltblatt (inkl. Richtung vo N zu C- Terminus), blau: Übrige inkl. Kehren und Schleifen Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

25 Tertiärstruktur von Ubiquitin (76 AS) Cartoon-Darstellung und Oberflächenstruktur von Ubiquitin Quelle: Wikipedia

26 Beispiele von Proteinstrukturen aus der PDB Quelle: Wikipedia

27 3D-Model eines DNA-Reparaturproteins (NMR basiert!)

28 Zusammenfassung der Strukturebenen Primärstruktur: Abfolge der Aminosäuren ( Sequenz ) Sekundärstruktur: Kleinste räumliche Struktureinheit ( lokale Strukturelemente ) Tertiärstruktur: Summe aller Sekundärelemente, 3-Dimensionale Struktur Quartärstruktur: Kombination mehrerer Proteine

29 DNA: Der Speicher unserer Erbinformation Watson-Crick Basenpaare : Adenin Thymin, Guanin Cytosin

30 Durch Basenpaarung entsteht eine rechtsdrehende DNA-Doppelhelix

31 Die Verpackungsebenen der eukaryotischen DNA

32 Von der DNA zum Protein

33 Transkription (DNA->RNA) Durch Abschreiben der DNA durch das Enzym RNA-Polymerase entsteht RNA. Anstelle von Thymin wird in der RNA allerdings Uracil verwendet.

34 Ein Gen kann gleichzeitig von mehreren RNA-Polymerasen transkripiert werden

35 Ein Gen kann gleichzeitig von mehreren RNA-Polymerasen transkripiert werden

36 Der Weg von der DNA zum Protein in Eukaryonten ist etwas komplexer Räumliche Trennung zwischen Transkription und Translation (Zellkern vs. Cytoplasma) Codierende Sequenz der DNA ist durch nichtcodierende Bereiche ( Introns) unterbrochen (Prozessierung notwendig) Fertige Proteine müssen oft noch in andere Kompartimente der Zelle transportiert werden (Sortierung)

37 Der Faltungstrichter

38 Mechanistische Modelle der Proteinfaltung Hierarchisches Modell (a) vs. Hydrophober Kollaps (b)

39 Die räumliche Struktur bestimmt die Funktion des Proteins Das menschliche Proteom. Auf sonstige Funktionen entfallen z.b. Motorproteine oder Imunglobuline.

40 Die räumliche Struktur bestimmt die Funktion des Proteins

41 Die räumliche Struktur bestimmt die Funktion des Proteins Proteine die chemische Reaktionen katalysieren nennt man Enzyme ( -asen )

42 Bindungen von Liganden können Konformationsänderungen bewirken

43 Durch Konformationsänderungen können Signale übertragen werden

44 Durch wiederholte Konformationsänderungen können sich Motorproteine bewegen Durch Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP, der universellen Energiewährung der Zelle) erfährt das Myosin-Protein eine strukturelle Änderung, was wiederum zu einer gerichteten Bewegung führt.

45 Ionenkanäle, die Porengröße bestimmt die Selektivität

46 Fehlfaltungen von Proteinen können zu Krankheiten führen Alzheimer, Parkinson, Prionen-Krankheit (z.b. BSE), Polyglutaminkrankheiten (z.b. Chorea Huntington), u.v.m. Während das normale monomere Prionenprotein vorwiegend aus α- Helices aufgebaut ist, besitzt seine pathogene Form einen hohen Anteil an β-faltblättern und bildet schnell neurotoxische Multimere.

47 Zusammenfassung I Proteine sind unverzweigtebiopolymere aus Aminosäuren Die Abfolge von DNA-Basen (Triplets) bestimmten die Primärstruktur (Sequenz) eines Proteins Durch spezifische Wechselwirkung der Seitenketten untereinander (Wasserstoffbrücken, Ionische WW, hydrophobe Effekte) bilden sich lokale Strukturelemente und schließlich eine meist komplexe 3-dimensionale Struktur Die räumliche Struktur bestimmt die Funktion eines Proteins Durch Bindung von Liganden (oder anderen Proteinen) kann sich die räumliche Struktur eines Proteins ändern (Konformationsänderung) Wenn man auf molekularer Ebene (Reaktionsmechanismus) verstehen will, wie ein bestimmtes Protein seine Funktion ausübt, muss man seine räumliche Struktur(en) kennen! Proteine sind interessante Forschungsobjekte! (Aber wie bekommt man sie?)

48 Wahl des Expressionssystems

49 Die Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors Ein Expressionsvektor ist ein Plasmid (circuläre DNA), mit einer Klonierunsgstelle zum Einbringen fremder DNA, einem Promotor zur Regulation der Expression ( Herstellung ) und einem Selektionsmarker (hier Resistenz gegenüber Ampicilin). Durch Restiktion und Ligation können unterschiedliche DNA-Fragmente miteinander verknüpft werden. Restiktionsenzyme erkennen spezifische DNA-Seq.

50 Plasmidkarten liefern alle notwendigen Informationen für die Klonierung

51 Plasmidkarten liefern alle notwendigen Informationen für die Klonierung

52 Ein Tag erleichtert die spätere Isolation & Aufreinigung des Proteins

53 Zellfreie Expressionssysteme Quelle: Promega Vorteil: hochreine Komponenten, definiertes System Nachteil: Oft geringe Ausbeuten, teuer

54 Plasmidkarten liefern alle notwendigen Informationen für die Klonierung

55 Das lac-operon in E. coli: Grundlage für IPTG-induzierte Überexpression

56 Transkriptionsaktivierung von T7-basierten Expressionssystemen mit IPTG Quellen: ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/ Nach Zugabe von IPTG in das Zellmedium startet die (Überproduktion) des gewünschten Proteins

57 Proteinreinigung in Kurzform (Zellaufschluss, Ni-Affinitätschromatografie bei His 6 -Tag)

58 Proteinreinigung in Kurzform (Größenausschlusschromatografie / SEC) Quelle:

59 Problem der natürlichen Häufigkeit Kern Spinquantenzahl I Natürliche Häufigkeit in % 1 H 1/2 99,99 13 C 1/2 1,10 15 N 1/2 0,37 17 O 5/2 0,04 Wie löst man das Problem der natural abundance in der NMR-Protein- Strukturaufklärung? à Auflösung gibt es nächste Stunde. 1 H[ppm]