NMR-Spektroskopie an Peptiden. Peptide. Worum soll es heute gehen? Peptide. 2D-NMR-Spektroskopie. Seminar AG Rademann

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1 2/52 Seminar AG Rademann Worum soll es heute gehen? 2D-NMR-Spektroskopie Sequenzspezifische Zuordnung Bestimmung der 3D-Struktur 3/52 4/52 Die Primärstruktur 5/52 6/52 20 natürliche Aminosäuren Sekundärstrukturelemente α-helix β-faltblatt

2 7/52 8/52 Ebenen struktureller Organisation cyclische sind kleine mit fixierter Konformation D-Pro Trp Lys(Z) F3-008: cyc-(dp-f-f-k(z)-w-f) 9/52 10/52 1-1D-Spektrum von F3-008 (in d 6 -DMSO, 300 K) Unterschiede in der chemischen Verschiebung treten durch Strukturierung auf aromatische Protonen N -Protonen α -Protonen aliphatische Protonen Indol- N /52 12/52 13 C-1D-Spektrum von F3-008 (in d 6 -DMSO, 300 K) Carbonyl-Kohlenstoffe aromatische Kohlenstoffe aliphatische Kohlenstoffe C α -Kohlenstoffe sind quasi Polymere, es ergeben sich zwei Folgerungen. Eindimensionale Spektren sind von nur sehr begrenztem Wert, man wird immer zweidimensionale Spektren aufnehmen müssen. Die Linien sollten so scharf wie möglich sein, beim keinem der Spektren sollte ein Magnitude- Rechnung notwendig sein

3 13/52 14/52 2D-NMR-Spektroskopie Die beiden entscheidenden Vorteile der mehrdimensionalen NMR-Spektrokopie sind Verbesserte Auflösung: Die Signale werden über eine Fläche (2D) oder einen Raum (3D, 4D) verteilt Magnetisierungstransfer: Es entstehen Signale die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein. Zusammen ermöglicht das eine Auswertung der Spektren bzgl. Zuordnung und Strukturinformation 15/52 16/52 1D-NMR 2 Achsen: Intensität vs. Frequenz 2D-NMR 3 Achsen: Intensität vs. Frequenz (1) vs. Frequenz (2) homonukleare Spektren Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: Kreuzsignal Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung: Diagonalsignal Transfer 1 2 δ 2 δ 1 δ 2 δ 1 Kreuzsignal Diagonalsignal 17/52 18/52 homonukleare Spektren homonukleare Spektren Beispiele für homonukleare Spektren sind das DQF-COSY, das TOCSY, das NOESY und das ROESY DQF-COSY TOCSY NOESY DQF-COSY: Transfer via skalare Kopplung, i.a. 2 3 Bindungen TOCSY: Transfer via skalare Kopplung, ganzen Spinsysteme NOESY: Transfer durch den Raum via dipolare Kopplung (z->z) ROESY: Transfer durch den Raum via dipolare Kopplung (x->x)

4 19/52 20/52 Es gibt aber beim NOESY ein Problem, das mit der Beweglichkeit der Moleküle zusammenhängt Einen Ausweg bietet das ROESY Experiment Intensität der NOE-Signale Die Intensität der NOE-Signale ist bei einer bestimmten Beweglichkeit und Feldstärke null!! Intensität der NOE-Signale ier gibt es keinen Nulldurchgang log(ωτ c ) log(ωτ c ) 21/52 22/52 NOESY mit ωτ c > 1 ROESY, NOESY mit ωτ c < 1 heteronukleare Spektren Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal. δ 1 Transfer X δ 2 δ 3 δ C2 δ C3 δ C1 eteronukleare Spektren werden wir hier nicht verwenden, sie können aber auch bei n sehr hilfreich sein 23/52 24/52 Ein Peptid ist ein Polymer Sequenzspezifische Zuordnung Die Kenntnis der Sequenz ist unbedingt erforderlich Man führt eine sequenzspezifische Zuordnung durch

5 25/52 26/52 Sequenz-spezifische Zuordnung Der Aminosäuretyp wird aus DQF-COSY und TOCSY bestimmt. Jede Aminosäure bildet ein separates Spinsystem, da über den Carbonyl- Kohlenstoff keine signifikante skalare Kopplung reicht 1. Welcher Aminosäuretyp liegt vor (welche Farbe) 2. Welche Aminosäure liegt neben welcher (Nachbarschaft) 3. Abgleich mit der Peptidsequenz 4. Die Reihenfolge von (1) und (2) ist egal N - α gibt es in jeder Aminosäure (außer Prolin), die Seitenketten sind unterschiedlich 27/52 28/52 Die Verknüpfung der Aminosäuren erfolgt über Abstände entlang des Peptid- backbone 29/52 30/52 d Nα (i,i) Der Abstand vom N zum α, d Nα (i,i) innerhalb einer Aminosäure ist immer kurz genug für einen NOE d αn Das gleiche gilt für den Abstand vom N zum α der Aminosäure (i-1), d αn

6 31/52 32/52 d βn und auch mit Einschränkungen - für den Abstand vom N zum β der Aminosäure (i-1), d βn Es sollten also für jedes N mindestens zwei Signale im Bereich des Fingerabdrucks vorliegen: Eines zum α der gleichen Aminosäure, eines zum α der in der Sequenz vorangehenden Daneben gibt es aber noch andere Signale von N zu Seitenketten und Aromaten zu Seitenketten 33/52 34/52 1. Identifizierung der Aminosäuretypen 2. Übertragung der COSY-Peaks ins NOESY COSY TOCSY COSY NOESY K 3.6 K K /52 36/52 3. Dann kommt der sequential walk 4. Dann im Spektrum Erst in der Theorie K4 1 D-Pro F2 W5 d αn 1 2 d Nα (i,i) 2 d αn 3 d Nα (i,i) 3 d αn 4 d Nα (i,i) F3 F6 Trp Lys(Z)

7 37/52 38/52 nimmt man die β mit dazu wird es noch etwas sicherer 1 D-Pro Die Zuordnung der Seitenketten kann man mit dem COSY oder dem TOCSY aus den sequenzspezifischen Zuordnung der auptkette ableiten K4 F2 F3 W5 F6 Trp Lys(Z) /52 40/52 Bestimmung der 3D-Struktur Aus den NMR-Spektren lassen sich zahlreiche strukturrelevante Parameter extrahieren: Abstände über NOE-Effekte Dihedralwinkel über J-Kopplungen Dihedralwinkel über chemische Verschiebungen 41/52 42/52 Den NOE-Effekt haben wir schon kennen gelernt Nuclear Overhauser Enhancement Effekt I (NOE) 1/r 6 Wegen des schnelle Abfalls mit r 6 können nur Abstände bis 400 pm, manchmal 500 pm bestimmt werden r Abstände innerhalb des Moleküls sind zur Intensität der Kreuzsignale proportional. Allerdings lassen sich die Abstände nicht absolut bestimmen, sondern nur durch interne Kalibierung. Dazu braucht man NOE-Effekte von bekannten Abständen Dann kann man die unbekannten Abstände durch Vergleich der Intensitäten ermitteln I eich I dist = r dist r eich r dist = r eich I eich I dist

8 43/52 44/52 Als Eichabstände eignen sich der Indol-Ring von Tryptophan oder zwei geminale Protonen N 2 R O R Die Intensität der Signale wird dabei durch Volumenintegration bestimmt, ganz analog den eindimensionalen Spektren, bei denen die Fläche unter der Kurve der Intensität entspricht O N 320 pm 248 pm 45/52 46/52 Dihedralwinkel kann man aus J- Kopplungen erhalten Karplus-Kurven 3 J Nα N CO Aber auch chemische Verschiebungen enthalten Strukturinformation. Der Zusammenhang ist zuerst für die Werte von C α und C β aufgefallen J-Kopplung 3 J Nα=6.4 cos 2 φ 1.4 cos φ α R CO Φ-Winkel 47/52 48/52 Die gewünschte Struktur erhält man nun, indem man die Peptidkette so anordnet, dass alle durch die Experimente erhaltenen Vorgaben gleichzeitig erfüllt sind. In Anbetracht der vielen Freiheitsgrade ist das nur mit der ilfe eines Computers möglich. Dabei wird im allgemeinen so vorgegangen, dass eine Molekulardynamik- Simulation durchgeführt wird und die experimentellen Parameter als Randbedingungen zum Kraftfeld hinzugefügt werden Elemente eine Kraftfeldes Abstände Tetraederwinkel Dihedralwinkel Coulombwechselwirkung Lennard-Jones

9 49/52 50/52 Zu den chemischen Elemente eines Kraftfeldes kommen noch die experimentellen hinzu, mit entsprechender Gewichtung Das experimentelle Potential für Abstände aus NOES wird so eingeführt V chem = V B + V W + V D + V E + V C + V LJ V param = V NOE + V J + V shift V = V chem + w param *V param Energie (arb.) Abstand mit Fehlergrenze Abstand (100 pm) 51/52 52/52 Am Ende steht dann die dreidimensionale Struktur des s That s it