Kieselgelmonolithen vs. Core Shell-Materialien

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1 Schnelle Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPLC mit monolithischen Kieselgelsäulen Kieselgelmonolithen vs. Core Shell-Materialien Ein chromatographischer Vergleich hinsichtlich Trennleistung, Selektivität, Säulenstandzeit und Analysendauer Karin Cabrera und Stephan Altmaier, Merck Millipore, Merck KGaA Darmstadt Einleitung Die klassische Trennsäule in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) besteht aus Kieselgelpartikeln, welche sich im Wesentlichen in ihren Partikelgrößen (z.b. 2 5 µm) und Oberflächenmodifizierungen (z.b. -C18, -NH 2, -Phenyl etc.) unterscheiden können. Diese beiden Parameter bestimmen einerseits die Trennleistung und den Säulenrückdruck und andererseits die Selektivität. Eine Alternative zu diesen klassischen Trennsäulen bieten monolithische Kieselgele, welche seit dem Jahr 2000 kommerziell erhältlich sind (Chromolith, Merck Millipore, Merck KGaA Darmstadt). Monolithische Kieselgele bestehen aus einem porösen Kieselgelstab, der durch ein charakteristisches bimodales Porensystem gekennzeichnet ist (Abb 1). Große Makroporen bzw. Durchflußporen verleihen diesen HPLC-Säulen eine große Permeabilität und somit kleine Säulenrückdrücke. Kleine Mesoporen im Kieselgelskelett wiederum liefern große spezifische Oberflächen, die für einen ausreichenden chromatographischen Trennprozess notwendig sind. Monolithische Kieselgelsäulen eignen sich hervorragend für die schnelle Analyse von Substanzgemischen, da sie infolge ihrer großen Permeabilität auch mit höheren Flußraten (z.b. 2-3 ml/min) ohne Probleme betrieben werden können. Abbildung 1: Rasterelektroenmikroskopische Aufnahme der Struktur von Chromolith Säulen. Gut zu erkennen sind einander durchdringendes mesoporöses Skelett und makroporöse Transportporen. Die UHPLC (U= Ultra) unter Verwendung von Trennsäulen, die mit Partikeln < 2 µm gepackt sind, ist ebenfalls für schnelle chromatographische Analysen geeignet. Allerdings benötigt man für derartige Säulen kostspielige HPLC-Geräte, welche die Chromatographie mit hohen Drücken bis 1000 bar und darüber hinaus erlauben. Allerdings sind UHPLC-Säulen anfällig für Blockierungen, insbesondere in

2 den zum Verschließen der Säulen benötigten Fritten. Ein weiteres Problem dieser Trennsäulen ist die Reibungswärme, die bei der Chromatographie unter Verwendung hoher Drücke entsteht und die maßgeblich zu Störungen in der Reproduzierbarkeit führen kann. Eine deutliche Verbesserung zu UHPLC-Trennsäulen stellt die kürzlich entwickelte Core Shell- Technologie dar. Hier handelt es sich um Säulen, die mit Kieselgelpartikeln gefüllt werden, die einen unporösen Kern und eine poröse Kieseglelschicht besitzen. Diese Säulen können infolge verkürzter Diffusionswege beeindruckende Trennleistungen von über N/m (N= theor. Böden) erzielen. Die verwendeten Kieselgelpartikel haben i.d.r. einen Partikeldurchmesser von ca. 2,5 3 µm. Der resultierende Rückdruck dieser Core Shell-Trennsäulen ist deutlich niedriger als bei den UHPLC Säulen, was zu einer Verminderung der Problematik hinsichtlich Blockierungen, Säulenstandzeiten und Reibungswärme führt. Insofern erfreuen sich Core Shell-Trennsäulen steigender Beliebtheit. Eine Alternative zu den kürzlich entwickelten Core Shell-Materialien bieten Kieselgelmonolithen der zweiten Generation (Chromolith HighResolution = HR, Merck Millipore). Diese Monolithen besitzen gegenüber der ersten Generation eine kleinere Makro-/ Durchflußpore von ca. 1,1 µm (gegenüber ca. 2,0 µm). Hieraus resultiert eine deutlich höhere Homogenität des porösen Kieselgelnetzwerkes und deutlich höhere Trennleistungen, die mit der von UHPLC- und Core Shell-Trennsäulen konkurrieren können. Vor allem aber zeichnen sich diese Säulen durch eine immer noch hohe Permeabilität aus, weshalb sie üblicherweise mit den klassischen low pressure -HPLC-Geräten betrieben werden können. Im Folgenden wird ein chromatographischer Vergleich vorgestellt, in dessen Rahmen zwei prominente Core Shell-Trennsäulen bezüglich Performance, Selektivität, Säulenstandzeit und der Anwendung in schnellen Chromatographieanalysen mit der Chromolith HR-Säule verglichen werden. Chromatographischer Vergleich von Kieselgelmonolithen und Core Shell-Materialien Trennleistung, Säulenrückdruck und Trennimpedanz Die wichtigste Kenngröße für die Charakterisierung einer chromatographischen Trennsäule ist ihre theoret. Bodenhöhe, über welche sich die Trennleistung errechnen läßt; das in Abbildung 2 (oben) gezeigte van-deemter-diagramm beschreibt die Abhängigkeit der theoret. Bodenhöhe von der linearen Fließgeschwindigkeit des Eluenten für die Chromolith HR Säule (rot) und die beiden Core Shell-Säulen (blau und grün) der Wettbewerber. Alle Testsäulen liefern qualitativ ähnliche Ergebnisse und sind erfreulicherweise im Bereich von etwa 1 bis 5 mm/s ohne nennenswerte Einbußen in der Trennleistung einsetzbar. Die Plots für die Core-Shell-Materialien sind nahezu deckungsgleich, während die theoret. Bodenhöhe für Chromolith marginal höher liegt. Ein deutlich anderes Bild präsentiert sich, wenn man den Säulenrückdruck der drei Trennsäulen im p- u-diagramm (Abbildung 2 Mitte) vergleicht. Die monolithische Säule erlaubt dank ihrer hohen Permeabilität auch auf einem konventionellen HPLC-Gerät (Betriebsdruck maximal 400 bar) noch Flussraten von etwa 5 ml/min, während sich für die Core Shell Materialien deutliche Limitierungen ergeben: Bereits bei 3 ml/min schiebt hier die Partikeltechnologie der praktischen Anwendbarkeit einen Riegel vor. Die Trennimpedanz beschreibt schließlich die Gesamtleistung einer Chromatographiesäule unter Berücksichtigung der Trennleistung und des Säulenrückdruckes. Abbildung 2 (unten) zeigt, dass die Trennimpedanzen bei verschiedenen Flußraten für die Chromolith HR-Säule wie auch für die beiden Core Shell-Säulen auf gleichem Niveau liegen, d.h. die chromatographische Gesamtleistung der monolithischen Kieselgelsäule ist absolut vergleichbar mit den Core Shell-Säulen.

3 Abbildung 2: van-deemter-plot sowie p-u- und E-u-Diagramm für Chromolith High Resolution RP-18 endcapped (rot), Phenomenex Kinetex 2.6µm C18 100A 100x4.6mm (blau) und Advanced Materials Technology Halo C18 4.6x100mm, 2,7µm (grün). Selektivität Weitaus wichtiger als die Effizienz einer Säule ist deren Selektivität, insbesondere bei der Auftrennung komplexer Mischungen von Analyten aus ähnlichen Substanzklassen, zu bewerten. Um sie zu untersuchen, wurden vier verschiedene Testgemische auf Chromolith HR und den beiden Core- Shell-Säulen analysiert, die Ergebnisse sind in Abbildung 3 zusammengefasst. Die Mischungen Tanaka 1 und Tanaka 2 lassen Rückschlüsse auf die hydrophoben Eigenschaften sowie die sterische Selektivität einer Phase zu, also deren Fähigkeit, zwischen planaren und nichtplanaren Molekülen zu unterscheiden. Die drei untersuchten Säulen verhalten sich in beiden Testläufen sehr ähnlich und unterscheiden sich nur leicht hinsichtlich ihrer Kapazität. Tanaka 2 beschreibt die Elutionsfolge von Koffein und Phenol und erlaubt Aussagen hinsichtlich des Endcappings von Restsilanolgruppen. Wird Koffein deutlich vor Phenol mit einer guten Peaksymmetrie eluiert, geht man von einem erfolgreichen Endcapping aus.

4 Abbildung 3: Untersuchung der Selektivität der drei Testsäulen, als Analyten wurden die Mischungen Tanaka 1, Tanaka 2, Säuren und Metallkomplexbildner eingesetzt. Tanaka 1: Uracil, Butylbenzol, o- Terphenyl, Pentylbenzol, Triphenylen; Tanaka 2: Uracil, Koffein, Phenol; Säuren: Uracil, Nitrobenzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Benzoesäure; Metallkomplexbildner: Uracil, Purpurin, Quinizarin. Die Substanzgruppe der Säuren lässt ebenfalls Rückschlüsse auf die Endcappingmethode zu, Unterschiede zwischen den verschiedenen Säulentypen lassen sich nicht feststellen. Die Analyten Purpurin und Quinizarin stellen Komplexbildner dar, sie erlauben also eine Aussage über die Reinheit der stationären Phase in Bezug auf ihren Gehalt an Metallen. Alle Testkandidaten basieren auf hochreinem Kieselgel, die chromatographischen Ergebnisse sind daher absolut vergleichbar. Insgesamt ist die Selektivität von Chromolith HR und den Core Shell-Säulen sehr ähnlich und erlaubt eine einfache Übertragung von Methoden. Säulenstandzeit Ein weiteres, für den Anwender wichtiges Kriterium zur Beurteilung einer Chromatographiesäule, ist deren Lebensdauer in der Langzeit-Anwendung, d.h. die maximal mögliche Anzahl von Chromatographieläufen unter bestimmten Eluentenbedingungen. Hierzu wurde ein chromatographischer Belastungstest konzipiert, der eine vergleichende Aussage in einem relativ kurzen Zeitfenster erlaubt. Abbildung 4 zeigt den Belastungstest von Chromolith HR im Vergleich zu den beiden Core Shell-Säulen. Die Bedingungen waren dabei harsch, bei einer Pufferkonzentration von 50 mmol KH 2 PO 4 und einer Temperatur von 45 C betrug der ph-wert 7.6. Während die Effizienz der gepackten Säulen in einem standardisierten RP-Test bereits nach knapp 40 Stunden auf etwa ein Drittel der Ausgangsleistung einbrach, konnte die monolithische Säule unter den gewählten Bedingungen 120 Stunden ohne signifikante Effizienzeinbußen betrieben werden; und erst nach gut 160 Stunden fiel die Trennleistung auf den Wert der Core-Shell-Materialien. In Summe bedeutet dies eine um den Faktor drei bessere Säulen-Stabilität von Chromolith HR im Vergleich zu den Core Shell Säulen.

5 Abbildung 4: Langzeitstabilität von Chromolith High Resolution (rot), Phenomenex Kinetex (blau) und Advanced Materials Technology Halo (grün). Schnelle Chromatographietrennungen Vor allem in Labors mit Routineanalytik stellt sich hinsichtlich Gerätewahl und Produktivität die Frage: Standardgerät oder UHPLC? Oder anders formuliert: Welcher Aufbau erlaubt möglichst schnelle und kostengünstige Analysen ohne die Anschaffung zusätzlicher Ausrüstung? Ein Vergleich der Testsäulen auf einem konventionellen HPLC-Gerät (Arbeitsdruck bis 400 bar) beantwortet diese Frage umgehend: Ein Gemisch organischer Säuren wurde auf allen drei Säulen getrennt, Ziel war dabei, diese Trennung in Bezug auf ihre Laufzeit zu optimieren. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse dieses Vergleichs: Während für Kinetex und HALO bei Flussraten von 1.5 bzw. 2.0 ml/min und korrespondierenden Analysezeiten von neun und sechs Minuten das Drucklimit des Geräts bereits erreicht ist, lässt sich dieselbe Trennung auf Chromolith HR sogar noch bei einer Flussrate von 4.0 ml/min und in einem Drittel bzw. der Hälfte der Zeit realisieren; damit stellt die monolithische Säule das ideale Material für schnelle Analytik auf Standardequipment dar. Abbildung 5: Schnelle Analysen auf Standard-HPLC-Anlagen am Beispiel der Trennung von sechs organischen Säuren und Säureestern. Chromolith High Resolution (rot), Phenomenex Kinetex (blau) und Advanced Materials Technology Halo (grün). Proben: 1 4-Hydroxybenzoesäure, 2 Benzoesäure, 3 Sorbinsäure, 4 Methyl-4-hydroxybenzoat, 5 Ethyl-4-hydroxybenzoat, 6 Propyl-4- hydroxybenzoat

6 Ein Beispiel für die schnelle Analyse auf Chromolith HR zeigt Abbildung 6. Sieben Katecholamine wurden hier bei einem Fluss von 2 ml/min innerhalb von gut vier Minuten mit hoher Empfindlichkeit basisliniengetrennt. Abbildung 6: Trennung von Katecholaminen auf Chromolith High Resolution RP-18 endcapped mm. Eluent A: ACN % TFA, Eluent B: Wasser % TFA. Gradient: 0 0% A, 1 0% A, 5 30% A, 7 30% A. Flussrate 2 ml/min, UV-Detektion (210 nm), Injektionsvolumen 5 µl. Probe: 1 Noradrenalintartrat, 2 Adrenalin, 3 Normetanephrin, 4 Dopamin, 5 DOPA, 6 Norephedrin, 7 N- Methylephedrin. Zusammenfassung Die monolithische Kieselgelsäule Chromolith HR wurde in einem chromatographischen Vergleich mit zwei der prominenten Vertreter von Core Shell-Trennsäulen (Kinetex, Halo ) an einem klassischen (low pressure) HPLC-System (Dionex Ultimate 3000) getestet. Hierbei wurde festgestellt, dass sich die monolithische Kieselgelsäule in der Trennimpedanz E (gleichzeitige Berücksichtigung von Trennleistung + Säulenrückdruck) sowie in der Selektivität absolut vergleichbar zu Core Shell-Säulen verhält. Während die Trennleistung bei Core Shell-Materialien noch geringfügig besser ist, ist die Selektivität der drei getesteten Säulen identisch, ausgearbeitete Methoden können also auf beiden Säulenmaterialien gleichermaßen betrieben werden. Ein deutlicher Unterschied zu Gunsten der Chromolith HR-Säule zeigt sich allerdings in deren Standzeit. Die monolithische Kiesegelsäule besitzt infolge ihres rigiden Silicanetzwerkes eine um den Faktor 3 höhere Lebensdauer, was für den Anwender wegen eines erheblichen Kosteneinsparungspotentials von großem Nutzen sein kann. Darüber hinaus können mit der Chromolith HR-Säule mit den klassischen HPLC-Geräten (die immer noch bis zu 70% bei Anwendern zum Einsatz kommen) die schnellsten chromatographischen Analysen durchgeführt werden. Insofern hat der Anwender auch hier ein großes Kosteneinsparungspotential, da die monolithische Trennsäule bedingt durch ihre große Permeabilität und niedrigen Säulenrückdruck mit den kostengünstigen, klassischen low pressure -HPLC-Geräten betrieben werden können.