HPLC mit Proteinen und Peptiden:

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1 HPLC mit Proteinen und Peptiden: Protein MG in kd KH-Anteil in % IP Handelsname Serum Albumin Orosomucoid Ovomucoid Cellobio-hydrolase I Avidin Chymotrypsin Ovotransferrin ,7 2,7 4,5 3,6 9,5-10 8,1-8,6 6,1-6,6 Resolvosil Chiral Protein 2 Chiral-AGP Ultron ES-OVM Variation der Trennbedingungen: ph-wert, Puffer-Konzentration, Temperatur Zusatz organischer Modifier

2 Beispiel 4:

3 Beispiel 6:

4 HPLC mit chiral modifizierten Polyacrylaten: Polyacrylate sind weiche, wenig druckstabile Gele; daher sind für die HPLC Polyacrylate, die auf Kieselgel aufgezogen sind vorzuziehen. Chiral modifizierte Polyacrylamide haben partial-helikale Struktur Chirale Modifier: chirale Amine chirale Aminosäureester z.b. ChiraSpher NT (ein L-Phenylalanin-ethylester-Derivat) Trennprizipien:Wasserstoffbrücken, π-π-interaktionen Eluenten: organische LM oder im RP-Modus

5 Beispiel 6:

6 Beispiel 7:

7 Beispiel 8:

8 Temperaturabhängigkeit der Trennergebnisse:

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10 HPLC-Trennungen an Brush-Type-Phasen:

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12 Mechanismen der molekularen Erkennung bei Brush-Type Phasen: Wechselwirkung über Wasserstoffbrücken mit chiralen stationären Phasen Wechselwirkung via Ladungen oder Dipole (Anziehung/Abstoßung) Wechselwirkung der π-elektronen (face-face/face-edge)

13 Beispiel 9:

14 HPLC-Trennungen an kielelgelgebundenen Binaphtholen:

15 HPLC mit chiralen Metallkomplexen:

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17 Beispiel 10:

18 Beispiel 11:

19 HPLC-Trennung nach Derivatisierung zu Diastereomeren Enantiomere werden vor der Chromatographie an achiralen Phasen mit enantiomerenreinen Derivatisierungsreagentien zu Diastereomeren umgesetzt. Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode: bei der Derivatisierung müssen sich beide Antipoden vollständig umsetzen; Selektivitäten bei der Umsetzung verfäschen das Analysenergebnis! das chirale Derivatisierungsreagens muß enantiomerenrein sein es darf keine Razemisierung bei der Derivatisierung stattfinden Vorteile der Methode: Durch die Derivatisierung können unsichtbare Antipoden UV oder Fluoreszenz-aktiv werden (geringere Nachweisgrenze!) Nachteile der Methode: die UV-Absorption der diastereomeren Derivate kann unterschiedlich sein es ist daher für beide diastereomeren Derivate eine Eichkurve erforderlich!

20 Voraussetzungen für die Trennbarkeit der diastereomeren Derivate: - die Natur der funktionellen Gruppe, die bei der Derivatisierung entsteht, muß die Wechselwirkung zwischen chiralen Partnern fördern (R*- funktionelle Gruppe - R*) z.b. Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe, Ether, Acetale - sowohl im Selektor als auch im Selektand müssen weiter funktionnelle Gruppen vorhanden sein, die eine Wechselwirkung ermöglichen - Der Abstand der chiralen Gruppen darf nicht zu groß sein - Die Anordnung der funktionellen Gruppen sollte durch konformativ fixiert sein Letztendlich muß die Lipophilie und Polarität der Gesamtmoleküle (Diastereomere) stark unterschiedlich sein um eine Trennbarkeit an der achiralen stationären Phase (Kieselgel oder Rp-Material) zu ermöglichen

21 Klassische Derivatisierungsreaktionen:

22 Beispiel: Trennung von α-aminosäuren nach Derivatisierung

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24 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch Kapillarelektrophorese Monosaccharid-Anakytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin Analytik von chiralen Aminen nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure Kapillare UV Kapillarelektrophorese (Blockschema) 30 kv

25 Monosaccharid-Analytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin: HO H O Ph NH 2 HO N Ph D-Glucose NaBH 3 CN B. Lachmann 2000 HO H N Ph

26 Elektropherogramm der (S)-Phenylethylamin-Derivate: time [min] mau D,L-glycerinaldehyde D-,L-ery D-,L-lyx D-,L-threo L-,D-gul L-,D-xyl L-,D-rib D-,L-tal D-,L-ara L-,D-glc D-,L-man L-,D-all D-,L-alt L-,D-gal

27 (S)-O-Methyltyrosinol nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure: O NH 2 O H N O MeO MeO (L)-O-Methyl-tyrosinol NaBH 3 CN H O N MeO B. Lachmann 2002

28 Elektropherogramme der (D)-Glucuronsäure-Derivate: 60 4,9 mau (R)-Derivat (S)-Derivat mau 4,7 4,5 4,3 (R)-Dericat (S)-Derivat 4,1 20 3,9 10 3, , , , , time (min) 3,5 10, , , ,5 time (min) Diastereomerenmischung 1,1% (R)- neben 98,9% (S)-