Genombasierte Selektion: neue Ansätze in der Rinderzüchtung - ein aktueller Überblick -

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1 Genombasierte Selektion: neue Ansätze in der Rinderzüchtung - ein aktueller Überblick - W. Brade (LWK Niedersachsen) Zusammenfassung: Mittels molekulargenetischer Methoden lassen sich Punktmutationen im Genom eines Tieres jetzt sicher und umfassend erfassen. Diese als SNPs bezeichneten Stellen sind über das gesamte Genom verteilt und erlauben eine hohe Informationsdichte. SNPs in kodierenden Regionen (= Bereiche, in denen z. B. die wichtigen Proteine genetisch determiniert sind) begründen genetische Variabilität. Ihr Nachweis erlaubt eine Leistungsvorhersage wichtiger Merkmale (z. B. Milchleistung, Milchfettgehalt) bereits am Kalb durch molekulargenetische Analyse des zugehörigen Genotyps des Tieres. Schlüsselwörter: Milchkühe, Selektion; Einzelnukleotid-Polymorphismen (= SNPs), Milch, Leistungsvorhersage 1 Einleitung Die Desoxyribonukleinsäure (kurz: DNA) ist ein in allen höheren Lebewesen vorkommendes Biomolekül (= im Zellkern jeder lebenden Zelle) und die Trägerin der Erbinformation. Sie enthält unter anderem die Gene, die Proteine codieren, welche für die biologische Entwicklung eines Organismus und den Stoffwechsel in der Zelle notwendig sind. Im Normalzustand ist die DNA in Form einer Doppelhelix organisiert; vereinfacht ausgedruckt: ein Original-Strang und ein Komplementär-Strang sind spiralförmig verknüpft. Veränderungen (= Variationen) einzelner Basenpaare in einem DNA-Strang bezeichnet man als Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl.: SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms; sprich: Snips) (vgl. Abb. 1). Beispiel: Die Abfolge der Basen im Original-Strang ist üblicherweise: AAGCCTA. Eine Veränderung der Basenabfolge in AAGCTTA führt zu einer Variation im DNA- Strang (vgl. Abb. 1). Abb. 1: Darstellung eines SNP auf DNA-Ebene Betrifft die Punktmutation eine Keimzelle (Eizelle, Spermium) eines Tieres, können Nachkommen dieses Tieres diese Mutation erben und der SNP kann sich nach mehreren Generationen in der Population etablieren.

2 - 2 - In jedem Genom gibt es eine Vielzahl von SNPs. Im menschlichen Genom sind beispielsweise zwischenzeitlich über 4 Millionen, verstreut über das gesamte Genom, nachgewiesen (= 1 SNP pro 1000 Basenpaare (bp)). Unter den ca. 3 Milliarden Basenpaaren des Rindergenoms sind etwa 2,5 Millionen variable (= polymorphe) Stellen zu finden. Die Abfolge aller anderen Basen ist bei allen Tieren identisch. Kurz gesagt: SNPs sind DNA-Regionen, in der die zugehörige Basenabfolge in mehr als 1 Variante vorkommt. Die Bedeutung, die diese SNPs, zwischenzeitlich vor allem in der Humanforschung (z. B. für den frühzeitigen Nachweis von Erbfehlern) erlangt haben, führte parallel auch zur Etablierung von Verfahren bezüglich ihrer (automatisierten und kostengünstigen) Darstellung. 2 Methodische Aspekte Erinnert man sich an die Struktur der DNA (siehe auch: Abb. 1) so können sich immer nur die komplementären Basen A und T bzw. C und G zusammenlagern (der Genetiker spricht von: Hybridisierung). Ist auch nur eine Fehlpaarung, eine einzige Position, die kein Basenpaar bildet, vorhanden, kann keine Zusammenlagerung (= Hybridisierung) stattfinden. Das ist die Grundlage für die so genannte Oligonukleotid-Hybridanalyse; die aktuelle, labormäßige Nachweismethode von SNPs (Anm.: griechisch: olígos, übersetzt: wenig, d.h. Oligonukleotid= wenige, hintereinander liegende Nukleotide im Sinne von: kurze DNA-Stücke) 2.1 Die Oligonukleotid-Hybridanalyse Folgende Schritte sind hier (vereinfacht) zu nennen: 1. DNA-Gewinnung vom Test-Tier (Blut, Sperma, Ohrgewebe); 2. Erzeugung kurzer, einzelsträngiger DNA-Moleküle (= sogenannte: Ziel- Oligonukleotide) vom zu prüfenden Tier (= Ziel-DNA) unter Laborbedingungen; 3. Hybridisierung der Ziel-DNA (des Patienten/Testtieres unter geeigneten Bedingungen) mit einem definierten Oligonukleotid (= Oligonukleotid-Sonde). Ein stabiles Hybrid bildet sich nur, wenn das definierte Oligonukleotid-Stück (= Sonde) eine vollständige Basenpaarung mit der Ziel-DNA ausbilden kann (vgl. Abb. 2) 4. Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals. Abb. 2: Die Oligonukleotidhybridisierung ist sehr spezifisch. Das Hybrid bildet sich nicht, wenn eine Fehlpaarung vorhanden ist (in Anlehnung an Brown, 2007)

3 - 3 - Eine bisher weit genutzte Möglichkeit, einen SNP darzustellen, war/ist die gezielte Markierung der Sonde mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Verbindet sich die Oligonukleotid-Sonde mit der Ziel-DNA (= des zu bewertenden Tieres) werden die beiden Marker am Sondenende (= der fluoreszierende Marker und die abfangende Verbindung) getrennt (Abb. 3). Abb. 3: Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals. Die Oligonukleotidsonde trägt an ihren Enden zwei Marker. Einer dieser Marker ist ein Fluoreszenzfarbstoff und das andere eine abfangende Verbindung. Hybridisiert die Sonde nun mit der Ziel-DNA (des zu untersuchenden Tieres bzw. Patienten), dann werden die beiden Enden des Oligonukleotids getrennt und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert das Signal ( molekulares Leuchtfeuer ); vgl. Brown, 2007 Der Fluoreszenzfarbstoff emittiert ein Signal (= molekulares Leuchtfeuer ), das nun mikroskopisch (= z. B. mittels Laser-Scanning) erfasst und somit zum Nachweis der Hybridisierung/Nichthybridisierung verwenden kann. 2.2 DNA-Chips Die Weiterentwicklung der oben dargestellten (labormäßigen) Hybridisierungstechnik führte zur Entwicklung sogenannter DNA-Chips. DNA-Chips basieren auf der Umkehrung des Prinzips: Die Sonden-DNA wird auf ein Glasobjektträger (oder ein Silikonträger) aufgebracht und die fluoreszenzmarkierte DNA des zu untersuchenden Tieres (= Patienten -DNA) darauf hybridisiert. Die Anzahl der Sonden, die gleichzeitig untersucht werden können, hängt somit nur noch von den technischen Rahmenbedingungen ab, d. h. wie viele unabhängige Sonden-DNAs auf einen Objektträger aufgebracht werden können. Hier ist die Entwicklung extrem dynamisch. Bis vor wenigen Jahren konnten man mittels der (damals verfügbaren) SNP-Chips nur ca SNPs erkennen. Zwischenzeitlich werden DNA-Chips genutzt, die bereits ca SNPs nachweisen können. Und die Entwicklung geht weiter: In der Humanmedizin sind bereits Chips mit einer Sondendichte von mehr als SNPs in Erprobung.

4 - 4-3 Genombasierte Selektionsverfahren beim Rind Die aktuelle Verfügbarkeit eines er DNA-Chips beim Rind ermöglicht das Erkennen von (rund) markierten (= polymorphen) Stellen (= SNPs) in der Basenabfolge der Tiere. Anhand geeigneter Daten aus der Leistungs- und Zuchtwertprüfung von Milchkühen können nun mittels sogenannter Assoziationsstudien die Effekte einzelner SNPs innerhalb einer Population geschätzt werden. Der genomische Zuchtwert ist dann die Summe der geschätzten Effekte aller erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals (Abb. 4 und 5). Abb. 4: Notwendige Schritte zur Etablierung der genomischen Selektion zwecks Auslese von Zuchtkälber und Verkürzung des Generationsintervalls Abb. 5: Der genomische Zuchtwert für ein Tier (= gzw) ist vereinfacht betrachtet - die Summe seiner SNP-Effekte bezüglich eines Merkmals (Beispiel: Milchmenge in kg)

5 - 5 - Einfache Assoziationsstudien auf der Basis der Analyse einzelner SNPs können jedoch leicht zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. In diploiden Organismen, wie Rinder oder der Mensch, ist es deshalb zukünftig zusätzlich notwendig, die spezifischen Kombinationen der Sequenzvarianten, die Haplotypen, für jedes der beiden (väterlichen und mütterlichen) Chromosomen des Genes zu bestimmen, da nur so eindeutige Aussagen über die Funktionalität der beiden Genkopien möglich sind (vgl. Hoehe et al., 2009). 4 Zu erwartende Konsequenz: Modifikation der Zuchtprogramme Für ein Kalb hat der genomische Zuchtwert etwa die Sicherheit, als ob man die Leistungen von zehn bis zwölf Nachkommen gemessen hätte (Van Raden et al., 2008). Sobald ein Bulle die Nachkommenprüfung abgeschlossen hat, und 100 bis 200 Töchterleistungen ausgewertet sind, ist der zusätzliche Informationsgewinn der SNP- Marker nur noch relativ gering. In der Tat lässt sich zeigen, dass eine frühzeitige Auslese potenzieller Zuchttiere unmittelbar nach der Geburt den möglichen Zuchtfortschritt beträchtlich steigern kann (vgl. Tab. 1). Tab. 1: Unterschiedliche Selektionserfolge in Abhängigkeit von der Gestaltung des Zuchtprogramms; berechnet auf der Basis der 4 wirkenden Erb-/Selektionspfade (ausgedrückt in genetische Standardabweichungen: σ A ) Bedingung: h² = 0,25 Erb-/ Selektionspfad Anteil ausgelesender Tiere (%) standardisierte Selektionsintensität (i) Genauigkeit der Zuchtwertprüfung (r TI )*** Produkt aus: i x r TI Länge Generationsintervall (L) Zuchtfortschritt (in Standardabweichungen) Herkömmliches, konventionelles Zuchtprogramm mit Nachkommenpüfung der genutzten Väter*: Bullenväter 4 2,15 0,93 2,00 6,50 Kuhväter 15 1,55 0,93 1,44 6,50 Bullenmütter 2 2,42 0,62 1,50 5,50 Kuhmütter 92 0,16 0,50 0,08 4,25 Zuchtfortschritt/Jahr (= Σ (i x r TI )/ (Σ L)**** 5,02/22,75 = 0,22σ A 1:1,5 Genombasierte, sehr frühzeitige Selektion von Bullen und Bullenmüttern**: Bullenväter 4 2,15 0,63 1,35 2,25 Kuhväter 20 1,40 0,63 0,88 2,25 Bullenmütter 4 2,15 0,63 1,35 2,25 Kuhmütter 92 0,16 0,50 0,08 4,25 Zuchtfortschritt/Jahr (= Σ ( i x r TI )/ Σ L) 3,66/11,00 = 0,33σ A Anm.: * ca. 100 Nachkommen je Vater, ** Genauigkeit entspricht etwa 10 geprüften Nachkommen, *** r TI = Korrelationen zwischen den wahren und geschätzten Zuchtwerten; **** gültige Berechungsgrundlage Setzt man eine additiv-genetische Standardabweichung (σ A ) bezüglich der Milchmengenleistung von σ A = 500 kg voraus, so beträgt der zu erwartende Zuchtfortschritt im herkömmlichen Zuchtprogramm 110 kg Milch pro Kuh und Jahr (0,22 x 500 kg) und im genomgestützten Programm 165 kg Milch pro Kuh und Jahr (0,33 x 500 kg). Das heißt ein Erhöhen des möglichen genetischen Fortschritts um 50 Prozent auf 150 Prozent; im Wesentlichen bedingt durch kürzere Generationsintervalle. Künftig werden Besamungsstationen ihre Jungbullen unter Beachtung ihrer genomischen Zuchtwerte auslesen. Auf der weiblichen Seite ist bereits jetzt die DNA- Testung potenzieller Bullenmütter zumindest in führenden ausländischen Zuchtgebieten die Regel.

6 - 6 - Fazit In zahlreichen Ländern, einschließlich Deutschland, arbeitet man aktuell sehr intensiv an einer Etablierung einer genombasierten Selektion im Milchrinderbereich. Von besonderem Interesse ist hier die Entwicklung eines kostengünstigen Systems (unter Verwendung von Ohrgewebe, Blut, Sperma oder Haarwurzeln), die eine frühe Zuchtwertvorhersage an Kälbern (männlich/weiblich) ermöglicht. Die aktuelle Verfügbarkeit eines ca er DNA-Chips beim Rind ermöglicht das Erkennen von (rund) markierten (= polymorphen) Stellen (= SNPs) in der Basenabfolge der Tiere. Anhand geeigneter Daten aus der Leistungs- und Zuchtwertprüfung von Milchkühen (Zuchttieren) können dann mittels sogenannter Assoziationsstudien zugehörige Effekte einzelner SNPs innerhalb einer Population geschätzt werden. Der genomische Zuchtwert ist die Summe der geschätzten Effekte aller erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals. Erste Studien zeigen, dass für ein Kalb der genomische Zuchtwert etwa die Sicherheit erreicht, als ob man die Leistungen von zehn bis zwölf Nachkommen gemessen hätte (Van Raden et al., 2008; Van Raden et al., 2009). Sobald beispielsweise ein Bulle aber die Nachkommenprüfung abgeschlossen hat, und 100 bis 200 Töchterleistungen ausgewertet sind, ist der zusätzliche Informationsgewinn der SNP-Marker nur noch relativ gering. In der Tat lässt sich zeigen, dass eine frühzeitige Auslese potenzieller Zuchttiere unmittelbar nach der Geburt den möglichen Zuchtfortschritt beträchtlich steigern kann (vgl. Tab. 1). Künftig werden Besamungsstationen ihre Jungbullen nur noch unter Beachtung ihrer genomischen Zuchtwerte auslesen. Abbildungsverzeichnis und zugehörige Erklärungen: Abb. 1: Darstellung eines SNP auf DNA-Ebene Abb. 2: Die Oligonukleotidhybridisierung ist sehr spezifisch. Das Hybrid bildet sich nicht, wenn eine Fehlpaarung vorhanden ist (in Anlehnung an Brown, 2007) Abb. 3: Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals. Die Oligonukleotidsonde trägt an ihren Enden zwei Marker. Einer dieser Marker ist ein Fluoreszenzfarbstoff und das andere eine abfangende Verbindung. Hybridisiert die Sonde nun mit der Ziel-DNA (des zu untersuchenden Tieres bzw. Patienten), dann werden die beiden Enden des Oligonukleotids getrennt und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert das Signal ( molekulares Leuchtfeuer ); vgl. Brown, 2007 Abb. 4: Notwendige Schritte zur Etablierung der genomischen Selektion zwecks Auslese von Zuchtkälber und Verkürzung des Generationsintervalls Abb. 5: Der genomische Zuchtwert für ein Tier (= gzw) ist vereinfacht betrachtet - die Summe seiner SNP-Effekte bezüglich eines Merkmals (Beispiel: Milchmenge in kg) Tabellenverzeichnis: Tab. 1: Unterschiedliche Selektionserfolge in Abhängigkeit von der Gestaltung des Zuchtprogramms; berechnet auf der Basis der 4 wirkenden Erb-/Selektionspfade (ausgedrückt in genetische Standardabweichungen: σ A ); Bedingung: h² = 0,25

7 Autoren: Prof. Dr. Wilfried Brade, Tierärztlichen Hochschule Hannover und Landwirtschaftskammer Niedersachsen, Bereich Versuchswesen Tier, Johannssenstr. 10, Hannover ( wilfried.brade@lwk-niedersachsen.de) Anhang: Definitionen Allel: DNA-Chip: Gen: Genom: Hybridisierung: Oligonukleotid: Phänotyp: Eine durch Mutation entstandene Variante eines Gens. Eine sehr dichte Anordnung von DNA-Molekülen, die für die gleichzeitige Hybridisierung eingesetzt wird. Funktionseinheit der DNA, in der die kodierenden wie auch regulatorischen Sequenzen für ein Protein lokalisiert sind. Die vollständige genetische Ausstattung eines lebenden Organismus. Die Zusammenlagerung von zwei komplementären Polynukleotiden durch Basenpaarung unter Laborbedingungen. Ein kurzes (synthetisches) einzelsträngiges DNA-Molekül. Die beobachtbaren Merkmale eines Individuums. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs): Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms; SNPs) kommen sehr häufig vor. Beim Menschen schätzt man eine Häufigkeit von 1 SNP pro 1000 bp (= Basenpaare) Daraus ergibt sich eine sehr hohe Markerdichte Für den Nachweis von SNPs gibt es eine Vielzahl verschiedener Methoden, die weitestgehend automatisiert werden können SNPs in kodierenden Regionen begründen genetische Variationen für Leistungs- und Fitnessmerkmale und sind auch für die meisten Erbfehler verantwortlich