Entwicklung einer Testmethode zur Ermittlung von Anlagenträgern des Dermoid Sinus in der Rhodesian Ridgeback Zucht

Transkript

1 Entwicklung einer Testmethode zur Ermittlung von Anlagenträgern des Dermoid Sinus in der Rhodesian Ridgeback Zucht Ein Forschungsprojekt der DZRR e.v. in Zusammenarbeit mit dem Institut für Molekularbiologie und Vererbungslehre an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Autor: M. Klopsch (1. Vors. & Projektleiter DZRR e.v.) Liebe Züchter und Mitglieder der DZRR e.v. Vor gut einem Jahr habe ich Ihnen über den Stand unseres Dermoid Sinus - Projektes an dieser Stelle berichtet. Für diejenigen unter Ihnen, die mit diesem Thema noch nicht vertraut sind, eine kurze Zusammenfassung: Die DZRR e.v. unterstützt seit März 2014 das Institut für Molekularbiologie und Vererbungslehre an der Tierärztlichen Hochschule Hannover bei der Entwicklung einer Testmethode, um Anlagenträger des Dermoid Sinus (nachfolgend DS genannt) in unserer Rasse zu erkennen. Ziel ist es, die Verpaarung von Anlagenträgern zu vermeiden, um die Zahl der Welpen mit ererbten DS, die sich im Alter von 6 Wochen einer Operation unterziehen müssen, weiter zu reduzieren. In der DZRR sind es trotz unserer strengen Selektion immer noch ca. 2,5 3% der Welpen die einen DS aufweisen und operiert werden müssen. Länderübergreifend liegt die Zahl im Bereich zwischen 8 und 10 %. Seit 2014 motivieren wir unsere Züchter, für dieses Projekt Blutproben ausgesuchter Hunde aus ihren Zuchtlinien zur Verfügung zu stellen. Insgesamt liegen uns 58 Proben in Form von Blut oder Gewebe (herausoperierter DS) vor, die für die weiteren Untersuchungen aufbereitet wurden und von denen in Kürze 36 Proben zur Genotypisierung in die USA gesendet werden. Für unsere Züchter und Mitglieder, die sich im Detail dafür interessieren was mit den Blut- bzw. Gewebeproben im Einzelnen passiert, habe ich eine Abfolge zusammengestellt, über die ich gern in 2-3 Teilen berichten möchte. I. Was passiert heute und welche Möglichkeiten haben wir aktuell, um den Erbfehler Dermoid Sinus zu kontrollieren und uns nicht den Anfeindungen bezüglich einer Qualzucht aussetzen zu müssen? 1. In erster Linie werden wir an der Selektion natürlich festhalten d.h. Merkmalsträger kommen nicht in die Zucht. 2. Ich habe unsere Datenbank der Wurfabnahmeergebnisse bis zum letzten Wurftag 2015 aktualisiert. Hieraus ergeben sich für den Züchter die Möglichkeiten, a. die Häufigkeit bestimmter Vererbungsmerkmale (Dermoid Sinus, Ridgefehler, Ridgelosigkeit, Kieferanomalien und Rutenanomalien) in unterschiedlichen Zuchtlinien zu erkennen; b. zu erkennen, ob sich diese Häufigkeit der Vorkommnisse über den Rüden oder über die Hündin bestätigt;

2 c. in gewissen Grenzen die Vorfahren-Generationen bezüglich dieser Vererbungsmerkmale zu betrachten; d. einen Trend abzuleiten und eine Risikoabschätzung vorzunehmen. Für einige Zuchtstätten wurde es bereits praktiziert, im Anhang habe ich zwei Beispiele dargestellt die zeigen, welche Verteilung des DS sich bei Einsatz unterschiedlicher Rüden in den Würfen ergibt. Es lässt sich natürlich auch in vereinfachter Tabellenform darstellen, mittelfristig möchte ich der Zuchtkommission die Nutzung unserer DZRR Datenbank überlassen um unsere Züchter im Bedarfsfall unterstützen zu können. II. Was wird mit den Blut- oder Gewebeproben gemacht? Teil 1: Probenaufbereitung Üblicherweise gelangt die Blutprobe aus Ihrer Tierarztpraxis auf dem Postwege in das Institut nach Hannover (Abb. 1). Aus diesem Grunde ist ein Versand an einem Freitag oder Samstag ungünstig, da niemand im Institut die Probe in Empfang nehmen kann, um sie im Kühlschrank einzulagern. Abb. 1: Blutprobe als Postsendung Der nächste Schritt ist die Registrierung und das Einpflegen aller Daten (Abb. 2) die aus dem Einsendebogen hervorgehen, zum Beispiel das Alter, das Geschlecht und die Tatsache, ob ein DS vorgelegen hat und entfernt wurde oder nicht. Zur Identifikation des Hundes ist lediglich die Chip- oder Zuchtbuchnummer erforderlich. Der Name und die Kontaktdaten des Besitzers sind dem Institut bekannt, spielen aber nur insofern eine Rolle, als das der Besitzer mit seiner Unterschrift einwilligt, dass die Blutprobe für die wissenschaftliche Untersuchung in diesem Projekt verwendet werden darf. Es ist vertraglich mit dem Institut vereinbart, dass Daten nicht an Dritte weitergegeben werden dürfen. Abb. 2: Registrierung

3 Nun beginnt die eigentliche Arbeit, denn die Probe muss zunächst aufbereitet werden d.h. man wird nun die D N A, die sich im Zellkern befindet, für alle weiteren Untersuchungen aus der Blut- oder Gewebeprobe isolieren. Abb. 3: EDTA Blutprobe Abb. 4: Gewebeprobe DS Der Zellkern ist die genetische Steuerzentrale, er enthält die genetische Information in Form dieser doppelsträngigen DNA. Abb. 5: Zelle mit Zellkern Die Chromosomen befinden sich in den Zellkernen der Zellen (Abb. 5). Bestimmte Bereiche auf den Chromosomen, welche die Ausprägung von Eigenschaften steuern, nennt man Gene. Das Aussehen und die Anzahl der Chromosomen sind für jedes Lebewesen charakteristisch. Ein Gen ist für eine oder mehrere Eigenschaften eines Lebewesens verantwortlich. Viele Eigenschaften werden aber wiederum von mehreren Genen bestimmt. Der Aufbau der Chromosomen ähnelt einer Strickleiter. Sie bestehen aus Desoxyribonukleinsäure (DNS oder engl. DNA) und Proteinen (Abb. 6). Abb. 6: DNA

4 Zur Isolierung der DNA muss zunächst die Zelle selbst zerstört werden. Durch wiederholte Zentrifugations- und Waschschritte wird ein Großteil der nicht benötigten Zellorganellen und kleinere Membranbestandteile entfernt. Nach der letzten Zentrifugation (Abb. 7) befinden sich allerdings noch immer unerwünschte Bestandteile im Pellet, vor allem Proteine. Daher wird ein Enzym namens Proteinase K hinzugegeben, welches die Proteine aufspaltet. Nach wenigen weiteren Schritten liegt die DNA in einer Lösung vor. Um hochreine DNA zu erhalten, muss die DNA von der Lösung getrennt werden Abb. 7: Zentrifuge Dies geschieht mit hochprozentigem Alkohol, welcher die DNA ausfallen lässt d.h., sie herauslöst. Sie ist nun als weiße Flocke in der Lösung sichtbar. Durch erneute Zentrifugation lagert sich die DNA zusammengeballt als Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes ab und die Lösung kann abgegossen werden. Nach weiteren Waschschritten wird die reine DNA getrocknet und anschließend in einem konservierenden Puffer gelöst. Jetzt kann sie für Anwendungen wie z.b. den Genomtest (Genotypisierung) genutzt werden. Abb. 8: Isolierte DNA III. Was passiert nun mit der isolierten D N A? Insgesamt haben wir, wie bereits eingangs gesagt, 36 D N A -Extrakte vorbereitet und zwar 18 von Rüden und 18 von Hündinnen die jeweils in 9 D N A - Extrakte mit und 9 ohne DS unterteilt sind. Rüden Hündinnen ohne DS 9 9 mit DS 9 9 Tabelle 1 Anzahl Genotypisierungen Die Proben werden in Kürze zum Vertragslabor Neogen zur Genotypisierung versendet.

5 Sowie mir neue Informationen vorliegen, werde ich Sie über die weiteren Schritte, Methoden der Genotypisierung und ggf. Zwischenergebnisse auf unserer DZRR Homepage informieren. Bis dahin, Martin Klopsch ANHANG: Nutzung unserer Zuchtdatenbank Die Zuchtdatenbank umfasst aktuell Rhodesian Ridgebacks. Das älteste Wurfdatum in dieser Zuchtdatenbank ist das des Rüden Boland of Meyendell, der am geboren wurde. Ab 1989 wurden die ersten Standardabweichungen bezüglich Ridge, Ridgebeschaffenheit und Rutenfehler eingetragen, ab 1992 sind die Dermoid Sinus Vorkommen sowie Kieferanomalien bei Wurfabnahmen dokumentiert. Wir können somit auf die älteste und umfangreichste Dokumentation einer Ridgeback Zucht in Europa, wenn nicht sogar weltweit zurückgreifen. Ich habe die Aktualisierung dieser Datenbank mit den Eintragungen der letzten ca Welpen einschließlich ihrer Abstammung und den genetisch bedingten Abweichungen bis zum Wurfdatum vervollständigt. Die Tabellenkalkulation dieses Programms erlaubt eine sekundenschnelle Sortierung nach väterlicher bzw. mütterlicher Linie, sowie die Darstellung der Häufung von erblich bedingten Fehlern in der jeweiligen Nachzucht. Die Ergebnisse können im Excel-Format oder als Zuchtlinienschema als Anhang zugestellt werden. Ich meine, es ist gerade für Jungzüchter eine wertvolle Hilfe, um Risiken im Vorwege einer Verpaarung zu erkennen und entsprechend reduzieren zu können. Dies soll künftig bei Bedarf dem interessierten Züchter in der DZRR als Serviceleistung zur Verfügung gestellt werden. Nachstehend sind zwei Beispiele aus unserem Zuchtgeschehen in anonymisierter Form dargestellt. Ich bin gern bereit Ihnen die Möglichkeiten in einer gesonderten Veranstaltung vorzustellen.

6 An dieser Stelle noch einmal meinen herzlichen Dank an die Ridgeback Besitzer und Züchter, die mit Blutproben dieses Projekt unterstützen, insbesondere an Hrn. Dr. Thomas Laube, der mit Gewebe nach DS - Operationen ca. ein Drittel der Proben beigebracht hat. Martin Klopsch 1. Vorsitzender & Projektleiter DZRR e.v.