Agilent BioHPLC Größenausschlusschromatographie-Säulen SCHNELLE UND ZUVERLÄSSIGE AUFTRENNUNG AGGREGIERTER UND ABGEBAUTER PROTEINE

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1 Agilent BioHPLC Größenausschlusschromatographie-Säulen SCHNELLE UND ZUVERLÄSSIGE AUFTRENNUNG AGGREGIERTER UND ABGEBAUTER PROTEINE

2 AGILENT BioHPLC GRÖSSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE-SÄULEN SCHNELLE HOCHAUFLÖSENDE TRENNUNGEN BEI PROTEINAGGREGATION UND PROTEINABBAU Die Größenausschlusschromatographie (Size Exclusion Chromatography, SEC) ist ein wesentliches Tool für die Quantifizierung von Monomeren, Dimeren, Aggregaten und möglichen Abbauprodukten. Für derartige analytische Proteintrennungen sind höchste Genauigkeit und Geschwindigkeit erforderlich. Agilent BioHPLC-Säulen für die Größenausschlusschromatographie (SEC) bieten schnelle, zuverlässige und präzise Leistung für Ihre biopharmazeutische Analytik. Sie lassen sich einfach in Ihren Workflow integrieren und decken ein breites Spektrum an Porengrößen und Säulenmaßen ab für eine optimale Trennung bei jeder Analyse. Mit mehr als 3-jähriger Erfahrung als einer der führenden Hersteller von Säulen und Analysegeräten für die Größenausschlusschromatographie bietet Agilent fortlaufend neue, innovative Produkte, die ein Optimum an Auflösung und Trenngeschwindigkeit liefern. Damit unterstützen wir Sie dabei, schnell und kosteneffizient Produkte auf den Markt zu bringen, die das Leben vieler Menschen zum Positiven verändern können. Die neueste Ergänzung der Agilent SEC-Säulenfamilie ist die Reihe AdvanceBio SEC neue Technologie, neue Partikel und Säulentypen, die für die präzise und genaue Quantifizierung von Aggregaten monoklonaler Antikörper und von Proteinen ausgelegt sind.

3 Welche SEC-Säule eignet sich für Ihre Applikation? Mit dem großen Angebot an SEC-Säulen von Agilent haben Sie beste Auswahlmöglichkeiten, um ausgehend von Ihren Analyten und Methodenparametern die bestmöglichen Trennungen zu erzielen. Die nachfolgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die verfügbaren Porengrößen für sehr gute Ergebnisse bei den häufigsten Molekülarten. Agilent AdvanceBio SEC 13 Å Agilent Bio SEC 1 Å Insulin Myoglobin Ovalbumin BSA IgG Agilent Bio SEC 15 Å Agilent AdvanceBio SEC 3 Å Agilent Bio SEC 3 Å Agilent Bio SEC 5 Å Thyreoglobulin Agilent Bio SEC 1 Å NEU SÄULEN FÜR DIE ANALYSE VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN UND PROTEINEN ProSEC 3S Agilent Bio SEC 2 Å ZORBAX GF-25 ZORBAX GF-45 1 D 1 kd 1 kd 1 kd 1 kd 1 kd 1 kd Peptide Globuläre Proteine Proteinkonjugate und große Biomoleküle IN DIESER BROSCHÜRE: Das komplette Agilent Portfolio an BioHPLC SEC-Säulen für die aktuellsten Biomolekül-Applikationen Neue Technologie für die Trennung monoklonaler Antikörper Agilent AdvanceBio SEC-Säulen... 4 Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie Agilent Bio SEC-3 HPLC-Säulen... 9 Große Biomoleküle Agilent Bio SEC-5-HPLC-Säulen Globuläre Proteine auf einer einzigen Säule Agilent ProSEC 3S Säulen Für SEC-Protokolle, die USP-Säulenspezifikation L35 erfordern Agilent ZORBAX GF-25 und ZORBAX GF-45 Säulen Forschung, QC/QA und Produktion Flexibilität mit einer einzigen Säule Aufreinigung Erweiterte Detektionssysteme LC-Systeme zur Proteinidentifizierung und Charakterisierung von Verunreinigungen Bestellinformationen Weitere Informationen über schnelle, hochauflösende Trennungen bei Proteinaggregation und -abbau finden Sie unter 3

4 AGILENT ADVANCEBIO SEC-SÄULEN Die AdvanceBio SEC-Säulen liefern genaue, präzise Quantifizierungen in der SEC-Analyse der Aggregation monoklonaler Antikörper sowie von Proteinen. Diese neue Technologie für die Größenausschlusschromatographie wurde für folgende Ziele entwickelt und realisiert: Hochauflösung für eine genauere Quantifizierung Schnellere Analysegeschwindigkeiten für termingerechte Lieferung der Ergebnisse Keine Änderung der Probenintegrität Empfindliche Aggregat-Quantifizierung selbst bei geringen Konzentrationen Außerdem verbessern die AdvanceBio SEC-Säulen die Produktivität im Labor, indem sie robuste, zuverlässige Methoden bieten und Wiederholungsanalysen von Proben überflüssig machen. Darüber hinaus lassen sich die Methoden leicht auf andere Bereiche einschließlich der QA/QC übertragen, wodurch sich das Risiko von Kandidaten- und Chargenfehlschlägen in späten Stadien reduziert. Optimale Auflösung für eine genaue Quantifizierung Die Chromatogramme auf der rechten Seite vergleichen die Trennungen eines BioRad-Standardgemischs für die Gelfiltration mit den Säulen AdvanceBio SEC 3 Å und 13 Å. Oberes Chromatogramm: Die AdvanceBio SEC-3-Å-Säule bietet eine Auflösung, die für die Quantifizierung großer Proteine einschließlich mab geeignet ist. Untere Chromatogramme: Die AdvanceBio SEC-13-Å-Säule bietet eine Auflösung, die für die Quantifizierung von Proteinfragmenten, kleinen Proteinen und Peptiden geeignet ist. BioRad Standardgemisch Nr für die Gelfiltration Säule: Å 13 Å AdvanceBio SEC, 7,8 x 3 mm Mobile Phase: 15 mm Natriumphosphat, ph 7, Ovalbumin (Huhn) 13 Å Myoglobin (Pferd) 6 3. Aprotinin (Rind) 4. Neurotensin Angiotensin II Die Trennung eines Protein- und Peptidgemischs an der AdvanceBio SEC 13 Å zeigt die Auflösung für kleine Peptide und Proteine Thyreoglobulin 2. Bovines Gammaglobulin 3. Ovalbumin (Huhn) 4. Myoglobin (Pferd) 5. Vitamin B12 1. Thyreoglobulin 2. Bovines Gammaglobulin 3. Ovalbumin (Huhn) 4. Myoglobin (Pferd) 5. Vitamin B12 Trennung des BioRad-Gemischs für die Gelfiltration an AdvanceBio SEC 3 Å und 13 Å. Die 3-Å-Säule bietet eine höhere Auflösung. 4

5 Termingerechte Übergabe von Ergebnissen durch gesteigerten Probendurchsatz Durch die Verkürzung der AdvanceBio SEC-Säulenlänge von 3 mm auf 15 mm und die Steigerung der Flussrate von 1, ml/min auf 2, ml/min konnte die Analysendauer von 12 auf 3 Minuten verkürzt werden. Außerdem war die Auflösung des IgG-Monomers und -Dimers nicht nur für die Quantifizierung ausreichend, sondern blieb auch über mehr als 4 Injektionen hinweg gleich. Auflösung über 4 Injektionen Überlagerung der Chromatogramme 1 und 4 Monomer-/Dimer-Auflösungsfaktor 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,,9, Säule: Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 x 15 mm Mobile Phase: 15 mm Natriumphosphat, ph 7, Überlagerung des IgG-Chromatogramms: Injektion 1, 1, 2, 3, 4,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Agilent 13 Å AdvanceBio SEC-Proteinstandards Eine Proteinmischung aus 5 sorgfältig ausgewählten Proteinen (Ovalbumin, Myoglobin, Aprotinin, Neurotensin, Angiotensin II) für die Kalibrierung der 13 Å AdvanceBio SEC-Säulen von Agilent. Dieser Standard kann zur regelmäßigen Kalibrierung der Säule eingesetzt werden, um optimale Systemleistung bei verschiedensten Applikationen mit Aufreinigung und Analyse von Proteinen sicherzustellen.. Agilent 3 Å AdvanceBio SEC-Proteinstandards Eine Proteinmischung aus 5 sorgfältig ausgewählten Proteinen (Thyreoglobulin,Gammaglobulin, Ovalbumin, Myoglobin, Angiotensin II) für die Kalibrierung der 3 Å AdvanceBio SEC-Säulen von Agilent. Dieser Standard kann zur regelmäßigen Kalibrierung der Säule eingesetzt werden, um optimale Systemleistung bei verschiedensten Applikationen mit Aufreinigung und Analyse von Proteinen sicherzustellen.. 5

6 Keine Änderung der Probenintegrität Im Rahmen des Installationsprotokolls mussten ältere Generationen der Protein-SEC-Säulen mit BSA konditioniert werden, um die Bindungsstellen zu blockieren, die für unspezifische Wechselwirkungen verantwortlich waren. Die neue Bindungschemie, die in den Agilent AdvanceBio SEC-Säulen zum Einsatz kommt, löst dieses Problem mithilfe der inerten Oberfläche, die unspezifische Wechselwirkungen reduziert und die Probenintegrität bewahrt. Keine Probleme bei der Protein-Wiederfindung bei gewahrter Probenintegrität Säule: Agilent AdvanceBio SEC, 3 Å, 7,8 x 3 mm Mobile Phase: 15 mm Natriumphosphat, ph 7, Fünf Wiederholungsinjektionen von BSA,1 mg/ml, 1 µl entsprechend,1 µg BSA auf der Säule. Auch die BSA-Peakfläche bleibt gleich, selbst bei der Beladung der Säule mit,1 µg. Injektionen Monomer-Peakfläche 1 5,5 2 49,6 3 5,6 4 5, 5 5,2 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2, 1,9 1,8 1, Injection Number Säule: Agilent AdvanceBio SEC, 3 Å, 7,8 x 3 mm Mobile Phase: 15 mm Natriumphosphat, ph 7, Probe: IgG Monomer-/Dimer-Auflösungsfaktor Das Diagramm zeigt die Auflösung zwischen dem IgG-Monomer und -Dimer über eine Abfolge von 13 Injektionen hinweg Lauf 1 Lauf Das Profil der IgG-Probe änderte sich auch nach 13 Injektionen nicht. Auflösungsfaktoren und die Quantifizierung des IgG-Monomers und -Dimers blieben während der gesamten Lebensdauer der Säule im Arbeitsbereich. 6

7 Aggregat-Quantifizierung selbst bei geringen Konzentrationen Die dargestellte Auflösung und Stabilität der Basislinie wurde mit einer Säule vom Typ AdvanceBio SEC-3, 3 Å, 7,8 x 3 mm, 2,7 μm, erzielt. Damit war die Quantifizierung geringer Konzentrationen von Dimeren und Aggregaten in einer mab- und Antikörper-Arzneimittel-Konjugat(ADC)-Probe möglich DAD1 B, Sig = 28 8, ,17 Säule: AdvanceBio SEC-3, 3 Å, 7,8 x 3 mm Mobile Phase: (PBS) 5 mm Natriumphosphat, 15 mm Natriumchlorid, ph 7,4 Flussrate:,8 ml/min ADC-Monomer ADC-Aggregat , ,5 8 8,5 9 Gerät: Probe: Agilent 126 Infinity bioinerte Quaternäre LC Trastuzumab und Antikörper-Arzneimittel-Konjugat (T-DM1) 2 7, SEC-Profil des intakten T-DM1 (ADC). Niedrigere Nachweisgrenze (LOD) und Quantifizierungsgrenze (LOQ) Als LOD bzw. LOQ für Trastuzumab und das Antikörper-Arzneimittel-Konjugat wurden 15 µg/ml bzw 31 µg/ml ermittelt, was die Empfindlichkeit der Methode unterstreicht. 2,5 2 1,5 DAD1 B, Sig = 28, LOQ DAD1 B, Sig = 28, LOD DAD1 B, Sig = 28, Leerwert LOQ LOD Trastuzumab 2,5 2 1,5 DAD1 B, Sig = 28, LOQ DAD1 B, Sig = 28, LOD DAD1 B, Sig = 28, Leerwert LOQ LOD ADC 1 1,5 Leerwert,5 Leerwert LOD- und LOQ-Chromatogramme von Trastuzumab und ADC; Überlagerung mit Blindwert. 7

8 AGILENT 126 INFINITY BIO-SEC MULTI-DETEKTOR-SUITE (MDS) EXTREM LEISTUNGSFÄHIGE ANALYSE VON BIOMOLEKÜLEN Die SEC ist seit Jahrzehnten ein wahres Arbeitstier in der Analytik von Biopolymeren, insbesondere bei der Erfassung und Quantifizierung von Proteinaggregation. Fortschrittliche Detektoren können bei diesen kritischen Parametern eine höhere Empfindlichkeit bieten und außerdem weitere wichtige Informationen liefern. Ein Umstand, der vor allem durch die zunehmende behördliche Regulierung an Bedeutung gewinnt. Die Agilent 126 Infinity Bio-SEC MDS ist eine dedizierte Lösung für die Analyse großer Moleküle. Innovative Detektoren bestimmen genaue Molekulargewichte sowie Größe und Form von Biomolekülen. Die Abwesenheit von metallischen Komponenten im Probenflussweg bzw. von Eisen und Stahl im Lösemittelversorgungssystem gewährleistet die Integrität der Biomoleküle, minimiert unerwünschte Oberflächeninteraktionen und stellt eine verlässliche Datenqualität sicher. In Verbindung mit der intuitiven, benutzerfreundlichen Software können diese zusätzlichen Informationen mühelos und reproduzierbar mit diesem Hochleistungssystem ermittelt werden. Genaue Molekulargewichte Bestimmung der realen anstelle der relativen molaren Masse Gute Empfindlichkeit für Aggregate Ermittlung von Aggregaten, die in wesentlich geringeren Mengen vorliegen Untersuchung der Molekülgröße Bestimmung des Hydratationsradius des Biomoleküls Umfassender Zugriff Abrufen aller erforderlichen Ergebnisse, unabhängig vom Erfahrungsstand Gute Reproduzierbarkeit Steigerung der Reproduzierbarkeit mit hochentwickelten Detektionsverfahren Gesicherte Probenintegrität Vollständig metallfreie Probenkontaktflächen Benutzerfreundlichkeit Erweitertes Informationsangebot über eine einfach gestaltete Benutzeroberfläche Moderne Detektionsverfahren Agilent: AdvanceBio SEC 3 Å Anderer Anbieter A Anderer Anbieter B Die AdvanceBio SEC-Säule weist die geringste Partikelablösung und damit das geringste Basislinienrauschen auf. 8

9 AGILENT BIO SEC-3 HPLC-SÄULEN KOMPATIBEL MIT MASSENSPEKTROMETRIE ZUR PEAKERKENNUNG Die Bio SEC-3-Partikeltechnologie ist gegenüber MS-geeigneten Lösemitteln stabil, sodass die Agilent Bio SEC-3-Säulen vollständig kompatibel mit der Massenspektrometrie sind. Robuste Partikel sorgen außerdem für Stabilität der Basislinie und geringe MS- Signalunterdrückung. Weitere Vorteile sind: Kompatibilität mit denaturierenden organischen/wässrigen mobilen Phasen, wie sie in der SEC-MS eingesetzt werden Hervorragende Stabilität bei hohen als auch niedrigen Salzkonzentrationen Skalierbarkeit vom analytischen bis zum präparativen Labormaßstab Die Agilent Bio SEC-3-Säulen nutzen dieselbe Partikeltechnologie wie die Agilent Bio SEC-5-Säulen und bieten so eine effizientere Option, wenn eine höhere Auflösung für kleinere Biomoleküle benötigt wird. Säulenspezifikationen Bio SEC-3 Gebundene Phase Porengröße (Å) Partikelgröße (μm) Bio SEC bis 1 Bio SEC bis 15 Bio SEC bis 1 25 Bio SEC-3 Proteinkalibrierungskurven Molekulargewicht MG-Bereich (Da) Proteine ph-bereich Flussrate (ml/min) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 3 Å 15 Å 1 Å Typischer Betriebsdruck (bar) 13 (15 psi) 13 (15 psi) 13 (15 psi) Retentionsvolumen (ml) Säule: Mobile Phase: Flussrate: Detektor: Bio SEC-3 7,8 x 3 mm, 3 µm Natriumphosphat 15 mm, ph 7, 1, ml/min UV Retentionsvolumen Proteine MG/Da 3 Å 15 Å 1 Å Thyreoglobulin 67 6,34 5,5 5,63 Gammaglobulin 15 8,3 6,24 5,74 BSA 67 8,9 7, 6,3 Ovalbumin 45 9,57 7,7 6,41 Myoglobin 17 1,12 8,5 7,1 Ribonuklease A ,4 8,8 7,46 Vitamin B ,9 11,4 1,2 9

10 Die Massenspektrometrie ist ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung von Peak-Struktur und -Identität. Durch die Kombination von Größenausschlusschromatographie und MS lassen sich zusätzliche Daten gewinnen, die beim Einsatz eines Diodenarray oder UV-Detektors nicht verfügbar sind. Die typischerweise in der Größenausschlusschromatographie eingesetzten mobilen Phasen enthalten jedoch Puffer und Salze, wodurch sie für die MS nicht geeignet sind. Wird auf eine denaturierende mobile Phase umgestellt (wie beispielsweise Acetonitril mit Wasser gemischt mit Ameisenund Trifluoressigsäure), kann die SEC-Säule direkt mit der MS kombiniert werden. SEC-MS-Analyse (intakte mab) x1 6 3,75 3,5 3,25 3 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 2 x1 1,2 1,8,6,4,2 Säule: LC: MS: MS UV (214 nm ) Vergrößerter Ausschnitt: Bio SEC-3 7,8 x 3 mm, 3 µm Agilent 129 Infinity Bioinerte Quaternäre LC Agilent 654 Q-TOF a a b b c c d d Herceptin Responsive vs. Acquisition Time (min) Mobile Phase: 2 % ACN,,1 % Ameisensäure,,1 % Trifluoressigsäure Flussrate: 1 ml/min Temperatur: 24 C Peak a Peak b N-Acetylglucosamin Galaktose Mannose Fucose x1 4 GF/G1F 1,8 G ,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,9,8,7,6,5,4,3,2,1 GF G1F G2F G/GF ,9 GF/GF ,4 G1F/G1F ,2 G1F/G2F Counts vs. Dekonvolierte Masse (amu) 3 x1 GF 3,4 74 3,8 3,2 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 G1F ,1 G2F ,1 G , Counts vs. Dekonvolierte Masse (amu) 3 x1 4,25 4 3,75 3,5 3,25 3 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1,75,5,25 Peak c , Counts vs. Dekonvolierte Masse (amu) 4 x1 1,2 1,1 1,9,8,7,6,5,4,3,2,1 Peak d ,7 O HS OH NH , Counts vs. Dekonvolierte Masse (amu) Peak a ist der Peak des intakten mab-monomers mit verschiedenen Glykoformen. Die Peaks b, c und d sind Fragmente. 1

11 AGILENT BIO SEC-5 HPLC-SÄULEN HERVORRAGENDE LEISTUNG BEI GRÖSSEREN MOLEKÜLEN Die Agilent Bio SEC-5-Säulen sind eine ideale Wahl bei großen Biomolekülen oder Proben, die Komponenten mit unterschiedlichen Molekulargewichten enthalten. Sie sind mit 5-µm-Kieselgelpartikeln gepackt, die für maximale Effizienz und Stabilität mit einer proprietären neutralen, hydrophilen Beschichtung versehen sind. Sechs verschiedene Porengrößen bieten bestmögliche Auflösung über den gesamten Molekulargewichtsbereich. Außerordentlich gute Auflösung für große Moleküle Säulenspezifikationen Bio SEC-5 Gebundene Phase Porengröße (Å) Partikelgröße (μm) MG-Bereich (Da) Proteine Bio SEC bis 1 Bio SEC bis 15 Bio SEC bis 1 25 Bio SEC bis 2 Bio SEC bis 7 5 ph-bereich Flussrate (ml/min) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) Bio SEC > 1 2 bis 8,5,1 bis 1,25 (7,8 mm ID);,1 bis,4 (4,6 mm ID) Typischer Betriebsdruck (bar) 13 (15 psi) 13 (15 psi) 13 (15 psi) 13 (15 psi) 13 (15 psi) 13 (15 psi) Hohe Stabilität und Effizienz dank proprietärer neutraler, hydrophiler Beschichtung Verbesserte Peakkapazität und Auflösung durch das vergrößerte Porenvolumen der speziellen Packung Stabile Leistungsfähigkeit: Ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und Lebensdauer der Säule Exzellente Stabilität, auch bei hohem ph-wert und hoher oder niedriger Salzkonzentration Flexible Methodenentwicklung: Kompatibel mit den meisten wässrigen Puffern Breite Einsetzbarkeit: Porengrößen von bis zu 2 Å für Vakzine und Biomoleküle mit hohem Molekulargewicht Bio SEC-5 Proteinkalibrierungskurven Molekulargewicht Å 5 Å 3 Å 15 Å 1 Å Retentionsvolumen (ml) Säule: Mobile Phase: Flussrate: Detektor: Retentionsvolumen Proteine MG/Da 1 Å 5 Å 3 Å 15 Å 1 Å Thyreoglobulin 67 1,7 8,23 7,3 5,82 5,77 Gammaglobulin 158 1,88 9,8 8,57 6,55 5,79 BSA 67 11,13 1,44 9,44 7,29 6, Ovalbumin 45 11,28 1,83 9,89 7,9 6,4 Myoglobin 17 11,44 11,28 1,42 8,66 7,5 Ribonuklease A ,52 11,41 1,58 8,93 7,32 Vitamin B , 12,59 11,78 11,49 1,3 Uracil (Marker für die Gesamtpermeation) ,8 12,68 12,21 12,13 11,41 Bio SEC-5 7,8 x 3 mm, 5 µm 15 mm Natriumphosphat, ph 7, 1, ml/min UV Für eine optimale Auflösung über den gesamten Molekulargewichtsbereich stehen verschiedene Porengrößen zur Verfügung. 11

12 AGILENT PROSEC 3S-SÄULEN ANALYSE VON GLOBULÄREN PROTEINEN AUF EINER EINZIGEN SÄULE Die ProSEC 3S-Säulen sind eine Einsäulen- Lösung für die Analyse globulärer Proteine. Die Auswahl und Optimierung der Porengröße ermöglicht einen erweiterten linearen Auflösungsbereich. Daher kann diese Säule für die Analyse des gesamten Bereichs der globulären Proteine eingesetzt werden. Die robusten Partikel bleiben beim Gebrauch intakt, wodurch eine Ausschwemmung von Feststoffen verhindert und eine sehr gute Basislinienstabilität erreicht wird. Stabile Leistung: mechanisch robuste Kieselgelpartikel, die beim Gebrauch nicht ausbluten Mühelose Methodenentwicklung: mit dem erweiterten linearen Auflösungsbereich entfällt der Auswahlschritt für die Porengröße eine einzige Säule ermöglicht die Analyse der meisten globulären Proteine Wahlmöglichkeiten zur Perfektionierung Ihrer Trennung: zwei Säulen-Innendurchmesser ermöglichen die SEC mit Mehrfachdetektion Säulenspezifikationen ProSEC 3S Gebundene Phase ProSEC 3S Porengröße (Å) Partikelgröße (μm) bis 8 MG-Bereich (Da) Proteine ph-bereich Flussrate (ml/min) 2 bis 7,5 < 1,5 (7,5 mm ID); <,5 (4,6 mm ID) Kalibrierung der ProSEC 3S-Säule mit globulären Proteinen Log MG 6 5,5 5 4,5 4 3, Retentionszeit (min) Typischer Betriebsdruck (bar) 25 (37 psi) 13 Größere Empfindlichkeit bei der Verwendung von Lichtstreudetektoren zur Identifikation von Dimeren, Trimeren und Aggregaten Säule: ProSEC 3S 7,5 x 3 mm, 5 µm Mobile Phase: 5 mm KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 (bei ph 6,8) mit,3 M NaCl Flussrate: 1, ml/min Detektion: UV, 28 nm Probe: Proteinproben Molekulargewichte der Proteine MG/Da Protein 67 Thyreoglobulin 155 Gammaglobulin Bovines Serumalbumin Ovalbumin 29 Carboanhydrase 16 7 Myoglobulin Cytochrom C 1423 Bacitracin Die Kalibrierungskurve weist eine lineare Beziehung zwischen der Retentionszeit und dem Logarithmus des Molekulargewichts auf ein Hinweis darauf, dass eine reine Größenausschlusstrennung stattfindet. 12

13 DIE SÄULEN AGILENT ZORBAX GF-25 UND GF-45 FÜR SEC-METHODEN, WELCHE DIE USP-SÄULENSPEZIFIKATION L35 ERFORDERN ZORBAX GF-25 und ZORBAX GF-45 Größenausschluss(Gelfiltrations)-Säulen beruhen auf einer hydrophilen, gebundenen Diol-Phase mit hoher Protein-Wiederfindung (typischerweise > 9 %) sowie einer speziellen Zirkonoxid-Stabilisierung der Kieselgeloberfläche, die den Betrieb in einem breiten ph-bereich ermöglicht. Säulenspezifikationen ZORBAX GF-25 und ZORBAX GF-45 Gebundene Phase Porengröße (Å) Partikelgröße (μm) MG-Bereich (Da) Proteine ph-bereich Flussrate (ml/min) Typischer Betriebsdruck (bar) ZORBAX GF bis 4 3, bis 8, < 3, 35 (5.14 psi) ZORBAX GF bis 9 3, bis 8, < 3, 35 (5.14 psi) Durchgängige Analyse: Auswahl an semipräparativen und präparativen Säulenmaßen für Flussraten von bis zu 3 ml/min High Recovery: hydrophile, gebundene Diol-Phase mit einer Wiederfindung von üblicherweise > 9 % Proteintrennungen auf semipräparativen Säulen ZORBAX GF Thyreoglobulin, 5,43 2. BSA-Dimer, 6,19 3. BSA-Monomer, 6,93 4. Ribonuklease A, 8,74 5. Poly-DL-Alanin (1 5 kda), 9,9 6. Uracil, 12,13 Stabilität: genau dimensionierte poröse Kieselgel-Mikrosphären mit enger Porenund Partikelgrößenverteilung Kompatibilität mit organischen Modifiern (< 25 %) und denaturierenden Zusätzen zur Minimierung nicht-spezifischer Wechselwirkungen ZORBAX GF Breite Einsetzbarkeit: geeignet für einen breiten ph-bereich von 3 bis Säule: ZORBAX GF-25, 9,4 x 25 mm, 4 µm Säule: ZORBAX GF-45, 9,4 x 25 mm, 6 µm Mobile Phase:,2 M Na 2 HPO 4, ph 7, Flussrate: 5, ml/min Detektion: UV, 28 nm Probe: 2 µl Diese Proteintrennung illustriert die komplementäre Beziehung zwischen den präparativen Säulen GF-45 und GF-25. Die GF-45-Säule trennte zuverlässig die Biomoleküle mit hohem Molekulargewicht, die von dem linearen Trennbereich der GF-25-Säule (mit einer geringeren Porengröße) ausgeschlossen wurden. 13

14 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION MIT NUR EINER EINZIGEN ADVANCEBIO SEC-SÄULE FLEXIBILITÄT BEI DEN PROBEN Analyse mehrerer Biotherapeutika mit nur einer AdvanceBio SEC-Säule und einer Methode Mehrere Probentypen, biotherapeutische mab, Innovator- sowie Biosimilar-Wirkstoffe und Antikörper-Arzneimittel-Konjugate mit derselben wässrigen mobilen Phase untersuchen. Säule: AdvanceBio SEC-3, 3 Å, 7,8 x 3 mm Mobile Phase: (PBS) 5 mm Natriumphosphat, 15 mm Natriumchlorid, ph 7,4 Flussrate: Probe:,8 ml/min Agilent 126 Infinity bioinerte quaternäre LC Rituximab-Innovator, Rituximab- Biosimilar, Cetuximab-Innovator, Herceptin-Innovator, ADC Retentionszeit- und Peakflächengenauigkeit (n = 6) AU Retentionszeit A 16 DAD1 A, Sig = Rituximab-Innovator AU 7 C DAD1 A, Sig = Cetuximab-Innovator B Peakfläche Proben Mittel () RSD Mittel (/) RSD Rituximab-Innovator 8,28,4 99,33 1,21 Rituximab-Biosimilar 8,29 1 Cetuximab-Innovator 7,86 99,6,96 Herceptin-Innovator 8,34 1 ADC 8,16,5 98,91,33 DAD1 A, Sig = 22 Rituximab-Biosimilar D DAD1 A, Sig = 22 Herceptin-Innovator SEC-Profil intakter therapeutischer mab: A - Rituximab-Innovator, B - Rituximab-Biosimilar, C - Cetuximab-Innovator und D - Herceptin-Innovator DAD1 A, Sig = 22, intaktes ADC DAD1 A, Sig = 22, hitze-/ph-degradiertes ADC 8.16 ADC, intakt ADC, aggregiert 8.67 ADC, abgebaut AdvanceBio SEC-Chromatogramm des nativen Antikörper-Arzneimittel-Konjugats (ADC, Kontrolle, rot dargestellt), überlagert mit 2 mg/ml durch ph-wert und Hitze degradierten ADC. 14

15 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION EFFIZIENTE GRÖSSENTRENNUNGEN MIT EINER BREITEN PALETTE MOBILER PHASEN Robuste Leistung und Auflösung bei wechselnden Salzbedingungen Die Agilent AdvanceBio SEC-Säulen bieten eine auch über die Zeit stabile Leistungsfähigkeit unter wechselnden Salzbedingungen. Die SEC-Trennung soll ausschließlich auf der Größe ohne Einflüsse durch sekundäre Wechselwirkungen mit der stationären Phase basieren. Die in den AdvanceBio SEC-Säulen eingesetzte neuartige Partikeltechnologie reduziert die unspezifischen ionischen Wechselwirkungen, sodass für Trennungen nach Größe keine hohen Salzkonzentrationen benötigt werden. Säule: 2 1 AdvanceBio SEC-3, 3 Å, 7,8 x 3 mm BioRad Standard für die Gelfiltration Nr mm Phosphat, 5 mm NaCl 8 mm Phosphat, 7 mm NaCl 6 mm Phosphat, 9 mm NaCl 4 mm Phosphat, 11 mm NaCl 2 mm Phosphat, 13 mm NaCl ph 7, Hier sind die Peakformen gleichmäßig und zeigen keine charakteristischen Verzerrungen durch unspezifische Wechselwirkungen mm Phosphat, 5 mm NaCl 8 mm Phosphat, 7 mm NaCl 6 mm Phosphat, 9 mm NaCl 4 mm Phosphat, 11 mm NaCl 2 mm Phosphat, 13 mm NaCl ph 6, Kein Salz erforderlich: Die SEC-Retention hängt von der Molekülgröße in der Lösung ab. Leichte Änderungen der Elutionszeiten gehen wahrscheinlich auf die Auswirkungen des ph-werts und die Änderungen der Salzkonzentration auf den hydrodynamischen Radius der Proteine zurück. 15

16 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION SOFTWARE-GESTÜTZTE METHODENOPTIMIERUNG IN EINEM BRUCHTEIL DER ZEIT Die Aufsichtsbehörden verlangen, dass die optimale analytische Methode experimentell ermittelt und die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode nachgewiesen werden. Bei der manuellen Erfüllung dieser Auflagen muss eine große Zahl mobiler Phasen zubereitet werden. Außerdem muss das LC- System bei jedem Wechsel der mobilen Phase neu äquilibriert werden, was viel Zeit kostet. Die Software Agilent Buffer Advisor (Puffer- Berater) vereinfacht das Protokoll, indem sie die Zubereitung von Puffern auf dem System aus nur vier Bestandteilen (zwei Puffer, Wasser und eine Salzlösung) ermöglicht. In der rechts dargestellten Analyse wurde die Quantifizierung des BSA-Monomers und -Dimers mit 2 mobilen Phasen (ph-wert zwischen 6, und 7,5) und mit Pufferkonzentrationen zwischen 2 mm und 1 mm auf Robustheit geprüft. 9 % 88 % 86 % 84 % 82 % 8 % 5 % 4 % 3 % 2 % 1 % Monomer % Phosphat mm Dimer % % Phosphat mm ph 6, ph 6,5 ph 7, ph 7,5 ph 6, ph 6,5 ph 7, ph 7,5 Säule: Probe: Agilent AdvanceBio SEC, 3 Å 7,8 x 3 mm BSA Die Auswirkung der Phosphatpufferkonzentration und des ph-werts auf die Monomer- und Dimer-Quantifizierung. Zeit- und kostensparende Puffervorbereitung F F G G H H I I J NaCl NaCl NaCl NaCl Manuelle Puffervorbereitung Automatisches dynamisches Mischen der Puffer im LC-System J + NaCl Die Agilent Buffer Advisor-Software unterstützt Sie bei der Automatisierung der Pufferherstellung. Das dynamische Mischen der nur insgesamt vier vorgehaltenen Lösungen macht das manuelle Vorbereiten und Titrieren von weiteren Pufferlösungen unnötig. Leistungssteigerung: Rasche Methodenentwicklung dank automatisierter Pufferherstellung Zeitersparnis: Das quaternäre Mischen ermöglicht die einfache Herstellung verschiedener Puffer mit unterschiedlichen ph- oder Salzkonzentrationen für die schnellere Pufferzubereitung Kostensenkung: Reduzierung von Probenabfall und Analysendauer durch die Ermittlung der Bedingungen für ein optimales Lösemittel bereits vor Analysenläufen mit Proben 16

17 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION ADVANCEBIO SEC BESEITIGT UNSICHERHEITEN Chargenübergreifende Reproduzierbarkeit Bei der Arbeit in Labors, die besonderen regulatorischen Anforderungen unterliegen und Daten termingerecht liefern müssen, sind robuste Methoden und Säulen unerlässlich. Die AdvanceBio SEC-Säulen zeigen währen der gesamten Lebensdauer der Säule höchste Leistung und Reproduzierbarkeit. Daten zur Reproduzierbarkeit zwischen Säulen und Chargen finden Sie auf den Seiten 5 und Auflösung (Monomer/Dimer) 1, Auflösung (Monomer/Dimer) 1, Peaknummer Fläche % Fläche % 1 2,6 2,9 2 2, 2,1 3 12,8 12,9 4 78,9 78,4 5 3,7 3, Gammaglobulin-Analysen an Säulen vom Typ AdvanceBio SEC 3 Å 4,6 x 3 mm, 2,7 µm aus zwei unterschiedlichen Chargen des Trennmediums. Die Auflösung zwischen Peak 3 und 4, Dimer und Monomer sowie die prozentualen Peakflächen zeigen eine ausgezeichnete chargenübergreifende Reproduzierbarkeit. Geräteübergreifende Reproduzierbarkeit Während der Entwicklung bis hin zur Zulassung von Biotherapeutika-Kandidaten ist es erforderlich, Methoden auf andere LC-Geräte in derselben oder anderen Abteilungen, oftmals auch an anderen Standorten oder sogar in anderen Unternehmen zu übertragen. Die Partikelgröße von 2,7 µm der AdvanceBio SEC-Säulen liefern auch bei Drücken unterhalb von 2 bar brauchbare Auflösungen. Die Analyse kann auf HPLC-Systemen erfolgen, sodass bei der Methodenentwicklung die Verfügbarkeit von Geräten nicht berücksichtigt werden muss. Überlagerung vier aufeinanderfolgender Injektionen an einem HPLC-System von Waters Alliance AU,7,6,5,4,3,2,1 Alliance HPLC-System Injektionen Fläche % Nr. 1 Fläche % Nr. 2 Fläche % Nr Fläche % Nr ,7 1,8 1,7 1,7 2 1,6 1,5 1,3 1,2 3 86,5 86,1 86,3 86,6 4 1,3 1,6 1,7 1,6 Überlagerung von vier konsekutiven Chromatogrammen eines polyklonalen IgGs an einer Säule vom Typ AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 x 3 mm, 2,7 µm, die auf einem Alliance HPLC-System von Waters erstellt wurden. 17

18 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION MEHRERE SÄULENABMESSUNGEN EINE LEISTUNG UHPLC-Methoden für höhere Empfindlichkeit UHPLC-Geräte bieten die geringste Dispersion und höchste Präzision und sind in den frühen Entwicklungsstadien die LC-Systeme der Wahl. Für Applikationen, bei denen Empfindlichkeit oder kleine Probenvolumina gefragt sind, werden Säulen mit kleinerem Innendurchmesser eingesetzt. Für die Größenausschlusschromatographie wäre dies ein Innendurchmesser von 4,6 mm. Typische Flussraten für diese Säulen liegen zwischen,3 und,7 ml/min. Für den Vergleich der Säulenleistung mit verschiedenen Geräten wurde der BioRad-Standard für die Gelfiltration Nr (blaue Peaks) und ein im Handel erhältlicher polyklonaler IgG verwendet. Die Daten wurden in verschiedenen Labors mit verschiedenen Säulen und unterschiedlichen Chargen der Testproben erzeugt. Agilent 129 Infinity binäre LC mit Agilent 126 Infinity Diodenarray-Detektor (G131D) und bioinerter Flusszelle (12 bar) AdvanceBio SEC-Säule 4,6 x 3 mm mit einer Flussrate von,35 ml/min Norm Agilent 126 Infinity bioinertes Quaternäres LC-System (6 bar). AdvanceBio SEC-Säule 4,6 x 3 mm mit einer Flussrate von,35 ml/min Norm

19 HPLC-Methoden für Robustheit HPLC-Geräte sind oft die am besten geeigneten Systeme, wenn robuste Methoden für hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit benötigt werden, die für QC-Methoden erforderlich sind. Für robuste HPLC-Methoden werden routinemäßig Säulen mit 7,8 mm Innendurchmesser in HPLC-Systemen eingesetzt. Die idealen Flussraten für diese Art von LC-Systemen sind 1, ml/min bei 3 mm langen Säulen für eine optimale Auflösung und bis zu 2 ml/min bei 15 mm langen Säulen für einen hohen Probendurchsatz. HPLC-Gerät Agilent 11 (4 bar) AdvanceBio SEC-Säule 7,8 x 3 mm mit einer Flussrate von 1, ml/min Norm Mit den AdvanceBio SEC-Säulen ist kein Wechsel des Säulentyps und auch keine Validierung neuer Methoden erforderlich, wenn ein potentieller Wirkstoff von der Forschung in die Entwicklung und zuletzt in die Produktion überführt wird: Es ändern sich lediglich die Abmessungen der AdvanceBio SEC-Säule. Die AdvanceBio SEC-Säulen von Agilent mit der optimierten Partikelgröße von 2,7 µm liefern auch bei typischen Drücken von weniger als 2 bar eine herausragende Leistung. Die Methoden lassen sich von Gerät zu Gerät und von Labor zu Labor übertragen. Die UHPLC-Daten stammen aus einem F&E-Labor in Europa und die HPLC-Daten aus einem technischen Support-Labor in den USA und wurden von verschiedenen Wissenschaftlern mit unterschiedlichen Proben und an verschiedenen Säulen gewonnen. 19

20 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION MONOGRAPH METHODS FÜR DIE GRÖSSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE Analyse PEGylierter Proteine Als PEGylierung bezeichnet man die kovalente Bindung von Polyethylenglykol(PEG)-Polymeren an Proteine oder Arzneimittelwirkstoffe. Zu den Vorteilen der PEGylierung eines Moleküls zählen die erhöhte biologische Verfügbarkeit, die verlängerte Serumhalbwertszeit und eine geringere Immunogenität. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist die bevorzugte Methode, wenn es darum geht, Verunreinigungen mit hoher Molekülmasse von PEGylierten Proteinen zu identifizieren. Für die folgenden Analysenresultate wurde eine SEC-Methode eingesetzt, um nach einer noch im Entwurf befindlichen Monograph Method Pegligrastim (PEG-GCSF) mit Hilfe einer Säule vom Typ Agilent AdvanceBio SEC 13 Å, 7,8 x 3 mm, 2,7 μm, zu identifizieren. Die Ergebnisse bestätigen, dass der prozentuale Flächenanteil des Monomers und die Standardabweichung der Retentionszeit innerhalb der Monograph -Akzeptanzkriterien lagen. Außerdem ließen sich auf den Agilent SEC-Säulen die in Forced-Stress-Experimenten erzeugten PEG-GCSF-Aggregate erfolgreich trennen, nachweisen und quantifizieren DAD1 A, Sig = 214 A PEG-GCSF-Monomer 5, ,132 4,739 5, B PEG-GCSF- Aggregat DAD1 A, Sig = 214, intaktes PEG-GCSF DAD1 A, Sig = 214, hitzedegradiertes PEG-GCSF 4,51 5,117 PEG-GCSF-Monomer ,132 4, Säule Agilent AdvanceBio SEC, 13 Å, 7,8 x 3 mm Gerät: Agilent 126 Infinity bioinertes Quaternäres LC-System Mobile Phase Gemisch von 6,8 ml einer 85%igen (v/v) (laut Monograph ) Orthophosphorsäure in 8 Volumina Wasser, ph auf 2,5 einstellen mit 1 N Natriumhydroxid, 5 Volumina Ethanol und 15 Volumina Wasser. Flussrate: 1 ml/min Temperatur: 25 C Thermostat des 4 C automatischen Probengebers: Detektor: 214 nm (126 Diodenarray-Detektor VL+, G bioinerte Flusszelle) Injektionsvolumen: 3 µl Größenausschlusschromatographie von PEG-GCSF an einer Säule vom Typ AdvanceBio SEC 13 Å, 7,8 x 3 mm, 2,7 µm A. Intaktes PEG-GCSF, Vergrößerung zeigt die Aggregate. B. Intaktes PEG-GCSF, überlagert mit hitzedegradierter Probe, die Aggregate zeigt. 2

21 Analyse von Insulin Insulin ist ein kleines Polypeptidhormon, das den Blutzuckerspiegel reguliert. Biopharmazeutische Unternehmen setzen gentechnologische Verfahren zur Entwicklung verschiedener langwirksamer Insulin-Analoga ein. Die folgenden Daten stammen aus der Analyse eines Insulin-Analagons und seiner Aggregate mit einer modifizierten, noch als Entwurf vorliegenden Monograph Method für die SEC. Die Säule Agilent AdvanceBio SEC 13 Å, 7,8 x 3 mm, 2,7 µm mit ihrer kleineren Porengröße lieferte eine überlegene Auflösung zwischen Monomer und Aggregat. 16,29 Monomer 4 DAD1 A, Sig = ,29 2, ,5 1,5 HMW Rs= 3,84 13, ,569 24,221 26,797 27, Säule: Gerät: Mobile Phase Flussrate: Temperatur: Agilent AdvanceBio SEC, 13 Å, 7,8 x 3 mm Agilent 129 Infinity binäres LC-System: L-Arginin (1, g/l)/essigsäure (99 %)/Acetonitril; 65/15/2 (v/v/v),4 ml/min Umgebungstemperatur Thermostat des automatischen 4 C Probengebers: Detektor: 276 nm (126 Diodenarray-Detektor VL+, G bioinerte Flusszelle) Injektionsvolumen 1 µl Kette B 3 Aminosäuren Kette A 21 Aminosäuren 21

22 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION ÜBERWACHUNG DER PROTEINSTABILITÄT Die AdvanceBio SEC-Säule löste nicht nur die Aggregate, sondern auch das abgebaute Trastuzumab und das Antikörper-Arzneimittel- Konjugat auf. In beiden Fällen nahm die Aggregation durch Stress der Proben zu. Dieselbe wässrige mobile Phase wurde für den mab und das stärker hydrophobe ADC verwendet. Norm DAD1 A, Sig = 22, intaktes Trastuzumab DAD1 A, Sig = 22, hitze-/ph-degradiertes Trastuzumab Aggregat 6,61 7,33 8,49 Trastuzumab, intakt Trastuzumab ,584 12,74 13,114 Fragmente 14,469 Säule: Agilent AdvanceBio SEC 3 Å 7,8 x 3 mm Mobile Phase: 5 mm Natriumphosphat, 15 mm Natriumchlorid, ph 7,4 Flussrate:,8 ml/min System: Agilent 126 Infinity bioinerte Quaternäre LC Probe: Trastuzumab und Antikörper- Arzneimittel-Konjugat (T-DM1) Die degradierten Proben wurden erzeugt, indem der ph-wert auf 1,, 1 und 6, eingestellt und sie anschließend 6 Minuten lang bei 6 C inkubiert wurden. Chromatogramm des nativen Trastuzumab (rot dargestellt), überlagert mit 2 mg/ml durch ph-wert und Hitze degradiertem Herceptin DAD1 A, Sig = 22, intaktes ADC DAD1 A, Sig = 22, hitze-/ph-degradiertes ADC ADC, aggregiert 8,16 8,67 ADC, intakt ADC ADC, abgebaut 2 6,654 7,141 11,586 12, Chromatogramm des nativen Antikörper-Arzneimittel-Konjugats (ADC, rot dargestellt), überlagert mit 2 mg/ml des durch ph-wert und Hitze degradierten ADCs. 22

23 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION BESSERE GENAUIGKEIT FÜR DIE BIOAUFREINIGUNG UND SEMIPRÄPARATIVE ANWENDUNGEN Agilent BioHPLC-Säulen sind in Dimensionen erhältlich, die zuverlässige Bioaufreinigung und semipräparative Applikationen unterstützen. Beim Einsatz zusammen mit dem Agilent 126 Infinity bioinerten LC-System und dem Agilent 126 Infinity bioinerten Fraktionssammler können sie die Genauigkeit ihrer peakbasierten Fraktionssammlung verbessern. SEC und Fraktionssammlung Säule: Bio SEC-3, 3 Å, 7,8 3 mm, 3 μm Mobile Phase: Puffer A: 5 mm Natriumphosphat-Puffer + 15 mm NaCl, ph 6,8 Flussrate: 1 ml/min Gradient: Isokratisch Injektionsvolumen: 3 μl Thermostat automatischer Probengeber und FC: 8 C TCC-Temperatur: RT DAD: 28 nm/4 nm, Ref.: AUS Peakbreite: >,5 (Ansprechzeit 1, Sek.) (5 Hz) Wiederholungsanalyse Umkehrphase C8 Säule: ZORBAX 3SB-C8, 4,6 x 5 mm, 5 μm Mobile Phasen: Puffer B: ACN +,9 % TFA Puffer C: H 2 O dd +,1 % TFA Flussrate: 1 ml/min Gradient: : 5 % B, 95 % C 1 : 95 % B, 5 % C Laufzeit: 1 Stoppzeit: 1 Injektionsvolumen: 1, 5 und 1 μl Thermostat automatischer Probengeber und FC: 8 C TCC-Temperatur: 7 C DAD: 28 nm/4 nm Ref.: AUS Peakbreite: >,5 (Ansprechzeit 1, Sek.) (5 Hz) Thyreoglobulin 67 Da γ-globulin 158 Da Dieser Gelfiltrationsstandard mit Thyreoglobulin, Gammaglobulin, Ovalbumin, Myoglobin und Vitamin B12 wurde mittels SEC getrennt. Anschließend wurden die Fraktionen automatisiert in festgelegten Wells einer tiefen Wellplate gesammelt (Modus mit Peak-basierter Auslösung des Fraktionssammlers). Nach diesem Schritt wurden die Fraktionen mit C8-Umkehrphasensäulen erneut analysiert P1-G-1 P1-G-2 P1-G-3 P1-G Die Wiederholungsanalyse der Fraktionen bestätigt die Genauigkeit der Fraktionierung im Modus mit peakgesteuerter Fraktionssammlung. Das 2-Positionen-/6-Kanal-Ventil im Säulenthermostat-Modul ermöglichte die automatisierte Säulenumschaltung. Ovalbumin 44 Da Myoglobin 17 Da P1-G-5 P1-G-6 5 7,5 1 12,5 15 Vitamin B Da P1-G SEC C8 23

24 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION STEIGERUNG DER EMPFINDLICHKEIT MIT LICHTSTREUDETEKTION Die Kombination aus einem Lichtstreudetektor und einem Konzentrationsdetektor (wie z. B. UV oder RI) ermöglicht die Bestimmung des absoluten Molekulargewichts. Im Vergleich zu Konzentrationsdetektoren wie UV- und RI-Detektoren bietet die Lichtstreudetektion eine höhere Empfindlichkeit bei der Analyse von Aggregaten. In diesem Abschnitt sind drei Regionen des Chromatogramms Monomere, Dimere und Trimere zusammen mit den Molekulargewichtsinformationen, die über eine Software berechnet wurden, dargestellt. Wie zu erwarten, sprach das Signal des Lichtstreudetektors erkennbar stärker auf Material mit einem höheren Molekulargewicht an, was zu besseren Nachweisgrenzen und einer höheren Genauigkeit bei der Aggregatquantifizierung führte. Wenn Sie höhere Aggregate eines großen Proteins untersuchen, müssen Sie möglicherweise eine Säule mit größerer Porengröße verwenden, um eine maximale Datenausbeute zu erzielen. In diesem Beispiel wurde eine Säule vom Typ Agilent Bio SEC-5 5 Å verwendet, um eine Trennung über die gesamte Bandbreite der höheren Aggregate zu erreichen. Verbesserte Nachweisgrenzen mit der Lichtstreumessung Detektor-Response (mv) Orange = UV 28 nm Rot = 9 -Lichtstreuung Blau = Brechungsindex Zeit () Peak 1: MG (Trimer) Peak 2: MG (Dimer) Peak 3: MG (Monomer) Säulen: Bio SEC-5, 5 Å, 7,8 3 mm, Edelstahl Mobile Phase: 5 mm Natriumphosphat, 25 mm NaCl, ph 7, Injektionsvolumen: 5 μl Flussrate: 1, ml/min Temperatur: 3 C Probe: Bovines Gammaglobulin Probenkonzentration: 1,, 2, und 4, mg/ml Detektion: UV 28 nm; 15 - und 9 -LS; RI Gerät: Agilent 126 Infinity bioinertes Quaternäres LC-System mit Agilent 126 Infinity GPC/ SEC-Multi-Detektor-Suite e5 1e4 1e3 1e2 1e1 1e Log MG (g/mol) Detektorsignale der Monomere (Region 3), Dimere (Region 2) und Trimere (Region 1) von Rinder-IgG; die Laufzeit betrug 2 Minuten. 24

25 FORSCHUNG, QA/QC UND PRODUKTION AGILENT 126 INFINITY BIOINERTES QUATERNÄRES LC-SYSTEM: EXTREM LEISTUNGSFÄHIGE ANALYSE VON BIOMOLEKÜLEN Von der eisen- und stahlfreien Lösemittelversorgung bis hin zu den metallfreien Komponenten des Probenflusswegs die Agilent 126 Infinity bioinerte Quaternäre LC setzt neue Maßstäbe in puncto Leistung und Zuverlässigkeit. Das robuste System ist den schwierigen Anforderungen der für die Analyse von Proteinen und Biotherapeutika häufig verwendeten Lösemittel gewachsen und reduziert darüber hinaus die Fehleranfälligkeit im Zusammenhang mit nicht-spezifischen Bindungen auf ein Minimum. Bei Verwendung des Systems in Kombination mit Agilent BioHPLC Ionenaustausch-Säulen lassen sich kürzeste Auflösungszeiten erreichen. 1 % bioinerter Probenflussweg Alle Kapillaren und Fittings im automatischen Probengeber, im Säulenthermostat-Modul und in den Detektoren sind vollkommen metallfrei, sodass Biomoleküle nur mit Keramik und PEEK in Kontakt kommen. Dies hilft Ihnen, sekundäre Wechselwirkungen von Proteinen oder Peptiden mit metallischen Oberflächen auf ein Minimum zu senken und dadurch Probleme wie Peaktailing, geringe Wiederfindungsraten und verkürzte Säulenstandzeiten zu umgehen. Echte UHPLC-Leistung Der Leistungsbereich von bis zu 6 bar ermöglicht den Einsatz der neuen Säulentechnologien mit kleineren Partikeln, aber auch höheren Druckgrenzwerten. Damit wird das Gerät zum idealen Partner für alle SEC- und IEX-Säulen mit Partikelgrößen bis hinab zu 1,7 μm. Mit der Software Agilent Buffer Advisor lassen sich Salz- und ph-gradienten schnell und einfach erstellen. Weitere Informationen zum Agilent 126 Infinity bioinerten LC-System finden Sie unter Kapillar- und Fitting-Technologie für einen stabilen und sicheren Betrieb Tag für Tag Für das 126 Infinity bioinerte LC-System verbaut Agilent eine Kapillar- und Fitting-Technologie, welche die besondere Kombination aus metallfreier Bioinertheit und Hochdruckbetrieb ermöglicht. Dabei kommen drei verschiedene Kapillartypen zum Einsatz: hochgradig korrosionsbeständige Titankapillaren in den Leitungen des Lösemittel- Versorgungssystems. metallummantelte PEEK-Kapillaren in Probengeber und Säulenthermostat-Modul PEEK-Kapillaren in den Niederdruckbereichen des Systems nach der Trennsäule Die metallummantelten PEEK-Kapillaren besitzen ein besonderes Anschlusssystem, das für eine vollständige Bioinertheit an allen Verbindungen sorgt. Die mechanisch abgesicherte PEEK-Spitze hält Seitwärts- oder Drehspannungen stand. Dadurch verhindert sie Drehmomente an den Kapillaren beim Festziehen der Fittings. Weitere Informationen unter 25

26 AGILENT GERÄTE ZUR PROTEINIDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON VERUNREINIGUNGEN Das neue Agilent 129 Infinity II LC-System: Die nächste Generation in der UHPLC verbessert die Effizienz in drei Dimensionen Maximierung der Analyseeffizienz: Mit seiner beispiellosen Trenn- und Detektionsleistung liefert das System Analysendaten von höchster Qualität und Zuverlässigkeit. Maximierung der Geräteeffizienz: Höchste Probenkapazität und kürzeste Injektionszyklen kombiniert mit optimaler Anwenderfreundlichkeit. Maximierung der Laboreffizienz: Nahtlose Integration in bestehende Integriert und reibungsloser Methodentransfer von vorhandenen Anlagen. Das 129 Infinity II LC-System ist mit einer Hochgeschwindigkeitspumpe oder mit einer flexiblen Pumpe erhältlich 26

27 Agilent 126 Infinity binäres LC-System: Ein neuer Standard für die analytische HPLC mit 6 bar, 8-Hz-Hochgeschwindigkeitsdetektor und bis zu zehnfach höherer Empfindlichkeit 1%ige HPLC-Kompatibilität, UHPLC-Fähigkeit plus: korrosionsbeständiger und biologisch inerter Flussweg breitester ph-bereich zur Bioanalyse und Bioaufreinigung Geeignet für alle Standard-UHPLC-Applikationen Das Agilent 126 Infinity Multi-Detektor-Bio/SEC-System: Eine spezielle Lösung für die fortschrittliche reproduzierbare Analyse proteinbasierter Pharmazeutika. Wenn die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit modernen Lichtstreudetektoren kombiniert wird, können Biochemiker genaue Molekulargewichte und Molekülgrößen in Lösung bestimmen und erhalten gleichzeitig eine empfindlichere Detektion der Aggregation für die Analyse großer Biomoleküle. Reproduzierbare und genaue Daten zu Molekulargewicht und Molekülgröße Empfindliche Detektion von Aggregaten mit dem marktführenden Lichtstreudetektor mit geringem Totvolumen Dank fortschrittlicher Detektion Genauigkeit in der Molekülgrößen- und Molekulargewichtsbestimmung Für Applikationen, die eine höhere Empfindlichkeit für große Biomoleküle erfordern Für weitere Einzelheiten zu diesen modernen Systemen besuchen Sie unsere Website unter 27

28 BESTELLINFORMATIONEN Agilent AdvanceBio SEC HPLC-Säulen Die neueste Technologie für die Größenausschlusschromatographie-Analytik monoklonaler Antikörper, Proteine und Peptide Beschreibung 13 Å 3 Å Säulen (analytisch) 4,6 x 3 mm, 2,7 µm PL PL ,6 x 15 mm, 2,7 µm PL PL ,8 x 3 mm, 2,7 µm PL PL ,8 x 15 mm, 2,7 µm PL PL Vorsäulen (analytisch) 4,6 x 5 mm, 2,7 µm PL PL ,8 x 5 mm, 2,7 µm PL PL Agilent AdvanceBio SEC-Proteinstandards Beschreibung Größe Best.-Nr. 13 Å 1,5-ml-Probenflasche Å 1,5-ml-Probenflasche

29 Agilent Bio SEC-3 HPLC-Säulen für die Proteinanalyse mit MS-Detektion Beschreibung 1 Å 15 Å 3 Å Säulen (analytisch) 4,6 x 3 mm, 3 µm ,6 x 15 mm, 3 µm ,8 x 3 mm, 3 µm ,8 x 15 mm, 3 µm Vorsäulen (analytisch) 4,6 x 5 mm, 3 µm ,8 x 5 mm, 3 µm Säulen (präparativ) 21,2 x 3 mm, 3 µm Vorsäulen (präparativ) 21,2 x 5 mm, 3 µm Agilent Bio SEC-5 HPLC-Säulen für große Biomoleküle und Proben mit Komponenten stark unterschiedlicher Molekulargewichte Beschreibung 1 Å 15 Å 3 Å 5 Å 1 Å 2 Å Säulen (analytisch) 4,6 x 3 mm, 5 µm ,6 x 15 mm, 5 µm ,8 x 3 mm, 5 µm ,8 x 15 mm, 5 µm Vorsäulen (analytisch) 4,6 x 5 mm, 5 µm ,8 x 5 mm, 5 µm Säulen (präparativ) 21,2 x 3 mm, 5 µm Vorsäulen (präparativ) 21,2 x 5 mm, 5 µm

30 Agilent ProSEC 3S-Säulen für globuläre Proteine (USP L33) Beschreibung 1 Å Säulen (analytisch) 4,6 x 25 mm, 5 µm PL ,5 x 3 mm, 5 µm PL ,5 x 6 mm, 5 µm PL Vorsäulen (analytisch) 4,6 x 5 mm, 5 µm PL ,5 x 5 mm, 5 µm PL Gelfiltrationssäulen ZORBAX GF-25 und GF-45 für Analyseprotokolle, welche die USP-Säulenspezifikation L35 erfordern. Beschreibung Größe Best.-Nr. Säulen (analytisch) GF-25, 15 Å 4,6 x 25 mm, 4 µm GF-25, 15 Å 9,4 x 25 mm, 4 µm GF-45, 3 Å 9,4 x 25 mm, 6 µm Vorsäulen und Kits (analytisch) ZORBAX Diol, Vorsäulenkartusche, 4 St. 4,6 x 12,5 mm, 6 µm ZORBAX Diol, Vorsäulenkartusche, 2 St. 9,4 x 15 mm, 6 µm Vorsäulen-Hardware-Kit für 4,6 mm ID Vorsäulen-Hardware-Kit für 9,4 mm ID PrepHT-Säulen PrepHT GF-25, 15 Å 21,2 x 25 mm, 6 µm PrepHT GF-45, 3 Å 21,2 x 25 mm, 6 µm Vorsäulen und Kits (PrepHT) ZORBAX Diol PrepHT, Vorsäulenkartusche, 2 St. 17 x 7,5 mm, 5 µm Vorsäulenkartuschen-Hardware-Kit für 21,2 mm ID PrepHT Endfittings, 2 St

31 BEI AGILENT GEHÖRT INNOVATION ZUR TRADITION Mit der Säulenfamilie AdvanceBio führt Agilent seine Innovationstätigkeit fort, um den Anforderungen der Protein- und mab-charakterisierung gerecht zu werden. Die Agilent AdvanceBio Säulen sind dafür ausgelegt, Genauigkeit und Geschwindigkeit zu verbessern, ganz gleich, ob es um Charakterisierungen, Aggregation mit SEC, Ladungsvarianten mit Ionenaustauschchromatographie, Bestimmungen intakter Massen, Primärstrukturen und Verunreinigungsprofil mit Umkehrphasen-Chromatographie, abgespaltene Glykane mittels hydrophiler Interaktionschromatographie und mab-titerbestimmungen mit Affinitätschromatographie geht. Agilent BioHPLC-Säulen Affinität Titerbestimmung und Aufreinigung Umkehrphase Proteinidentifizierung und Charakterisierung von Verunreinigungen HILIC Glykananalyse Größenausschluss- Chromatographie Analyse der Aggregation Ionenaustausch- Chromatographie Analyse der Ladungsvariante Bio-Monolith Protein A AdvanceBio RP-mAb AdvanceBio Glycan Mapping AdvanceBio SEC, 2,7 μm Bio-Monolith (QA, DEAE, SO 3 ) Bio-Monolith Protein G-Säule AdvanceBio Peptide Mapping ZORBAX RRHD 3 Å, 1,8 µm Bio SEC-3 Bio mab ZORBAX RRHD 3 Å, 1,8 µm Bio SEC-5 Bio IEX (SAX, SCX, WAX, WCX) Poroshell 3 ProSEC 3S PL-SAX PLRP-S ZORBAX GF-45 ZORBAX GF-25 PL-SCX ZORBAX 3SB ZORBAX Amino Acid Analysis Ohne Hindernisse zu einer erfolgreichen Protein- und mab-charakterisierung Weitere Informationen finden Sie unter 31